metodesammendrag

her presenterer vi en ny 9-dagers faset strategi for differensiering av humane CD14+ monocytter til homogene populasjoner av monocytt-avledede dendrittiske celler (moDCs) og M1 og M2 makrofager. Våre makrofagpopulasjoner er homogene, og spesielt viste Våre m2 makrofagpopulasjoner høy mannoseopptak samt cellulær fusjon. Spesifikk cytokinbehandling på dag 9 økte også modc-modningen samt ekspresjon AV celleoverflatemarkørene CD80, CD86 og CD83.myeloidkammeret i det medfødte immunsystemet består av en rekke celletyper hvis funksjoner inkluderer klaring av skadede og apoptotiske celler, antigenpresentasjon, immunosuppresjon og beskyttelse av verten fra fremmede mikroorganismer.

Monocytter representerer en svært plastisk delmengde av celler som komponerer det medfødte immunsystemet. Disse cellene er i stand til å krysse vaskulaturen og, når de blir utsatt for spesifikke cytokiner, gjennomgå differensiering i forskjellige celletyper. Sirkulerende monocytter er klassifisert som enten ikke-klassiske eller klassiske og kan skilles ved deres mønster av celle-overflate reseptor uttrykk. De klassiske monocyttene i sirkulasjonen viser CD14 + + + Hi / CD16 – / lo og er til stede spesielt på steder med infeksjon eller sykdom (1,2).

Menneskelige ikke-klassiske monocytter i sirkulasjonsvisningen CD16 + + + Hi / CD14 + / lo overflateuttrykk (1). Etter aktivering gjennomgår monocytter flere morfologiske og biokjemiske funksjonelle endringer, noe som resulterer i monocyttdifferensiering til nye celletyper som makrofager (3).

i et paradigme kalt klassisk aktivering viser humane monocytter fenotypisk plastisitet som kan initieres ved eksponering For Th1—responsfremmende cytokin interferon-γ (IFN-γ) eller tumor nekrosefaktor α (TNF-α), samt endotoksinlipopolysakkarid (LPS) (4,5). Denne mekanismen for klassisk aktivering genererer m1 makrofager, som fungerer for å produsere pro-inflammatoriske mediatorer som gir vertsbeskyttelse mot bakterier og virus (6). Humane monocytter kan også differensieres til m2—makrofager ved eksponering For Th2-responsfremmende cytokiner som interleukin-10 (IL-10) og transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) (4,7). M2 makrofager uttrykker høye NIVÅER AV CD206 (mannosereseptor) og CD163, produserer lave nivåer av proinflammatoriske cytokiner, og fremmer sårheling og matriseomforming.Dendrittiske celler (DCs) er et annet sett med monocytt-avledede immunceller hvis funksjon er å presentere antigener Til T-celler for å initiere en adaptiv t-cellebasert immunrespons. DCs kan kategoriseres i stor grad i tre undergrupper: klassisk (cDCs), plasmacytoid (pDCs), og monocyte-avledet (moDCs). cdc er vanligvis funnet i lymfoid vev, milt, lymfeknuter og benmarg. pdc ligner plasmaceller og finnes vanligvis i blodsirkulasjonen (8). Monocytter kan differensieres til DCs, som ofte kalles monocytt-avledet dcs (moDCs), etter eksponering for granulocytt makrofagkolonistimuleringsfaktor (GM-CSF) og IL-4 (9,10). moDCs har blitt rapportert å uttrykke celleoverflatemarkørene CD80, CD83, CD86 og CD1a in vitro (11-13). Mens moDCs skiller seg fra makrofager i celleform og funksjon, deler de uttrykk for flere celle-overflateantigener, inkludert CD11c, CD206 Og CD1a (14).

Flere grupper har rapportert vellykket differensiering av humane CD14 + monocytter i makrofager; imidlertid er mange av disse publiserte protokollene forskjellige. En vanlig variasjon blant disse metodene er inkludering (15) eller utelatelse (16) AV IL-6. En annen forskjell mellom protokoller er behandlingstiden. Denne mangelen på konsistens blant protokoller er problematisk.for å løse disse problemene undersøkte og sammenlignet vi inkluderingen OG utelatelsen AV IL-6 i cytokinbehandlingen som brukes i vanlige humane monocyttdifferensieringsmetoder. Vi fant at i fravær AV IL-6 produserer disse strategiene celler med lav grad av homogenitet, noe som kan gi tvetydige eksperimentelle resultater. For det andre, for å løse dette problemet, utviklet vi en ny faset in vitro-strategi med inkludering AV IL-6. Vi fant at denne strategien forbedret cellulær homogenitet av M1-og M2-makrofager, samt moDCs som ble differensiert fra humane CD14+ – monocytter. Denne forbedringen i metodikken vil gi forskere bedre modeller for å undersøke immunsystemet og sykdomstilstander.

Materialer og metoder

cellepreparater

Buffy strøk ble samlet fra hele blodet av fem eller flere friske mannlige givere som hadde blitt samlet. Mononukleære celler i perifert blod (pbmc) ble fremstilt fra buffy-strøk av Ficoll-Paque (1,077 g / mL tetthet) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) tetthetsgradientsentrifugering ved 400 × g ved 18°C i 35 min for å skille blodbestanddelene. Cellene ble vasket flere ganger ved hjelp av 1× PBS og talt ved Hjelp Av En Nexcelom Cellometer Auto T4 plus celleteller (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). NÅR talt, CD14 + monocytter ble isolert Fra PBMCs ved magnetisk merking Ved hjelp AV MAB CD14 konjugerte mikroperler (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) etterfulgt av separasjon ved hjelp av magnetiske kolonner (130-042-401 og 130-042-302; Miltenyl Biotec) i henhold til produsentens instruksjoner, med ett unntak: ved innsamling AV CD14+ – celler fra den magnetiske kolonnen ble cellene spylt ut først ved bruk av 5 mL buffer som bare var avhengig av tyngdekraften (uten bruk av det medfølgende stempelet). Etter den første 5 mL skyllingen ble ytterligere 5 mL buffer tilsatt og skyllet forsiktig med det medfølgende stempelet.

Cellekultur

Humane CD14 + monocytter ble sådd med en celletetthet på 2,0-3.0 × 105 celler/mL i RPMI 1640 medium med 2 mM/L l-glutamin (Life Technologies, Frederick, MD) supplert med 10% varmeinaktivert FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 e/mL penicillin (Life Technologies) og 100 mg/mL streptomycin (Life Technologies) ved 37°C i en fuktet 5% CO2-inkubator. For å differensiere celler til m1-makrofager var cytokinene som ble brukt GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) og endotoksinlps (20 ng/mL). For m2-makrofagdifferensiering var cytokinene som ble brukt makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), IL-4, IL-6 og IL-13 i en konsentrasjon på 20 ng/mL (PeproTech). moDCs ble generert ved tilsetning AV GM-CSF (100 ng/mL) OG IL-4 (20 ng/mL). Tidspunktet for hver strategi er nærmere beskrevet I Figur 1.

Flowcytometri

Polariserte makrofager og Dc-er ble dyrket i 9 dager på 10 cm2 retter(Bd Falcon, Billerica, MA). På dag 9 ble media og ikke-adherente celler samlet; adherente celler ble vasket ved hjelp av 1× pbs, fjernet ved hjelp av celledissosiasjonsbuffer( Livsteknologier), og deretter tilsatt til de oppsamlede media / ikke-adherente cellene som skulle vaskes. Suspenderte celler ble sentrifugert og vasket to ganger (1× pbs, 0,5% BSA, 2 mM EDTA), talt, og deretter inkubert med fluoroforkonjugerte primære antistoffer mot CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), OG cd64 (fitc) i mørket i 45 MIN VED 4°C. FLUORESCENS ble detektert AV EN s3tm cellesorter (bio-rad, hercules, ca).

Endocytose analyse

Polariserte humane makrofager ble belagt i 4-brønnkammer glassglass (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) ved en tetthet på 3.0 hryvnias 105 celle / mL På dag 7 og fortsatte å bli dyrket med passende cytokiner de resterende 2 dagene. Perylen bisimid (PBI-12-Man) (17) var en snill gave Fra Ke-Rang Wang Ved Hebei University. Cellene ble dyrket med 10 µ / mL PBI-12-Mann i 30 min ved 37 hryvnias C, og deretter vasket med 1 hryvnias PBS. Cellene ble festet ved hjelp av 70% etanol og montert MED DAPI (P36962; Life Technologies). For å visualisere endocytose AV Pbi-12 Mann, ble lysbildene begeistret og utgitt ved 585 nm. Røde fluorescensbilder ble kvantitert Ved Hjelp Av Metafer slide scanning software (MetaSystems, Boston, MA). Statistisk testing ble per dannet VED HJELP AV MATLAB R2015a programvare (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Rank-sum tester ble utført for å teste for univariate statistisk signifikans mellom prøvene.

Immunfluorescens

Makrofager ble differensiert ved hjelp av tidligere beskrevne metoder i 7 dager og deretter overført Til Nunc Lab-Tek II 4-brønnsglasskammer med passende cytokiner. Celler ble igjen for å vokse i de neste 7 dagene; 14 dager etter innledende plating ble celler løst ved hjelp av 70% etanol og montert ved Hjelp Av Prolong Diamond anti-fade mountant med DAPI. Cellene ble visualisert ved hjelp av fasekontrast og fluorescensmikroskopi PÅ EVOS FL Auto (Life Technologies).

Resultater og diskusjon

Strategier og betingelser for human CD14+ monocyttdifferensiering

Vi begynte med å vurdere hvilke strategier som var mest effektive for å produsere homogene populasjoner av humane m1-og m2-makrofager samt moDCs. Humane CD14 + – monocytter ble isolert og sådd på vevskulturplater for å differensieres til makrofager eller moDCs in vitro. Vi testet deretter tre spesifikke behandlingsforhold for å bestemme metoden som ga de mest ensartede makrofag-og moDC-populasjonene. For den første tilstanden kultiverte vi celler med tillegg av BARE GM-CSF eller M-CSF i 9 dager (Figur 1). Denne tilstanden kalles «bare» (Figur 1). Den andre behandlingsstrategien var å kontinuerlig eksponere celler for det aktuelle cytokinmiljøet På dag 0, fylle på media, cytokiner og LP-er På dag 5 og analysere cellene på dag 9. Denne tilstanden kalles «kontinuerlig» (Figur 1). Den tredje strategien var å stimulere CD14 + monocytter med ENTEN gm-CSF eller M-CSF i 5 dager, etterfulgt av tilsetning av ferske medier som inneholder LP-er for humane m1-makrofager og alle gjeldende cytokiner for en gitt behandlingsgruppe (GM-CSF, IFN-γ og IL-6 for m1-makrofager eller M-CSF, IL-4, IL-13 og IL-6 for M2-makrofager). Denne behandlingsstrategien ble kalt «faset» (Figur 1). Behandling AV CD14+ monocytter med 100 ng / mL GM-CSF og IL-4 i 5 dager og erstatning av medier og alle cytokiner på dag 5 genererte moDCs. MoDCs ble deretter stimulert MED IL-6 og LPS for 24 h før analyse (Dag 8) for å fremme DC modning og aktivering. Denne dyrkingsmetoden ble kalt » stimulert «(Figur 1). Modcene som aldri mottok IL-6 og LPS eksponering ble betegnet «un-stimulated» (Figur 1). Etter 9 dager med kultur under de spesifikke forholdene beskrevet ovenfor, ble celle-overflate reseptor uttrykk og cellefunksjonalitet analysert.

IL – 6-eksponering øker m2 polarisasjonseffektiviteten in vitro

Tidligere studier har vist at makrofageksponering for cytokin IL-6 ikke bare forskyver monocyttdifferensiering fra en dendrittisk celle til en makrofagfenotype, MEN AT IL – 6-eksponering også øker mRNA-uttrykksprofilen assosiert Med M2-makrofager (15,18). For å bekrefte disse funnene og for å teste EFFEKTEN AV IL-6 på m1-og m2-polarisering, ble humane CD14+ – monocytter under de kontinuerlige og fasede dyrkningsbetingelsene behandlet MED ELLER uten IL-6. Undersøkelse Av m2 makrofag overflate markør uttrykk I m1 differensierte celler viste ingen signifikante endringer når dyrket MED IL-6( Figur 2), noe som tyder på AT IL-6 behandling ikke shunt M1 polariserte makrofager mot En m2 fenotype.Omvendt viste analyse av de kontinuerlige Og fasede m2-makrofagkulturgruppene AT IL – 6-behandling økte ekspresjonen Av m2-makrofagoverflatemarkører. I m2-makrofagpopulasjoner forblir BÅDE CD206 og CD36-uttrykket høyt og virket uendret når DE ble utsatt FOR IL-6(Figur 2, A Og B). CD163 og e-cadherin viste imidlertid signifikant økning i overflateuttrykksnivåer og populasjonshomogenitet ved behandling MED IL-6 (Figur 2, C og D). Dette er demonstrert av en nedgang i LAV-uttrykke CD163 og E-cadherin topper (røde piler I Figur 2, C Og D) og den resulterende forskyvning mot en homogent høy-uttrykke befolkningen.

IL-6 brukes ofte til å indusere modc modning (18,19). For å avgjøre OM IL-6-behandling kan resultere i uønskede moDCs i de makrofagpolariserte populasjonene, ble uttrykket moden DC overflatemarkør (CD83) undersøkt. Flowcytometrisk analyse viste at ingen Av m1-eller m2-kulturforholdene fremmet noen signifikant økning I CD83-uttrykk (Figur 2e). Dette antyder at det ikke var noen moDC-forurensning i disse makrofagpopulasjonene eller at noen forurensende moDCs var IL-6 ufølsomme.

Faset polarisering fører til økt ekspresjon av kanoniske m1 -, M2-og moDC-celleoverflatemarkører

for å bekrefte at humane CD14+-monocytter ble fullstendig differensiert til enten makrofager eller moDCs innen dag 9, ble flowcytometri brukt til å analysere celleoverflatemarkører og vurdere morfologiske forskjeller (Figur 3, A-C). Humane CD14 + monocytter ble differensiert (Figur 1) for å vurdere hvilken strategi som ville gi høyt uttrykk for passende overflatemarkører av celletype. Et panel av celleoverflatemarkører ble testet for hver av celletypene. Vår m1 celle-overflate markør panel besto av de kanoniske markører CD86, OG CD80 (Figur 3, A-C). For m2 makrofagpanelet brukte VI CD206, CD163, CD124 (IL-4 reseptor-α), E-cadherin og CD36 (klasse b scavenger reseptor) (Figur 3, A-C). For moDCs, CD83, CD86 Og CD1a ble benyttet. Overflateuttrykksnivåer for alle de testede markørene ble bestemt for alle celletyper (Supplerende Figur S1). Median fluorescens intensitet (MFI) ble beregnet og vist som fold-endring i forhold til den tilsvarende unstained kontroll (se tabeller I Figur 3).

Interessant, analyse Av m2 celle-overflate markører, CD36 OG IL-4RA, i M1 GM-CSF-bare polariserte makrofager avdekket dramatiske økninger (Figur 3a). Når man sammenlignet gm-CSF-behandlede celler med alle M1 – behandlingsgrupper, hadde gm-CSF-gruppen markert høyere CD36-uttrykk. Disse gm – CSF-cellene uttrykte også lave nivåer AV DE M1-assosierte markørene CD86 og CD80. På samme måte ga den kontinuerlige tilstanden celler som ikke bare var lave I CD86 og CD80, men var også høye I CD36 og IL-4RA-uttrykk. Omvendt, da humane CD14+ – monocytter ble differensiert under m1-fasetilstanden, VAR CD86 og CD80 merkbart oppregulert, MENS CD36 og IL-4RA-uttrykket forblev lavt. Videre flowcytometrisk analyse av celle-overflate markøruttrykk viste At M1 makrofager hadde lavere uttrykk FOR CD206, CD36 og CD163 i forhold Til M2 makrofager under både faset og kontinuerlig eksponering (Supplerende Tall S1 og S4). I tillegg genererer disse varierte dyrkningsbetingelsene celler med forskjellige morfologiske egenskaper og struktur (Figur 3A). Mens de gm-CSF-behandlede cellene ser ut til å være større, viste forward scatter (FSC) data minimal forskjell i størrelse mellom gruppene (Supplerende Tall S2 og S3). Sammenligning av intern kompleksitet (SSC) mellom behandlingsforhold viste en økning i granularitet i GM-CSF og fasegruppene (Supplerende Figur S2). Sammen viser disse resultatene AT gm-CSF-only og kontinuerlig behandling gir celler som uttrykker lave nivåer Av M1 markører og høye nivåer av visse M2 markører, samt viser morfologiske endringer.

m2 makrofag dyrking forhold ga litt mer tvetydige resultater enn de som ble funnet Med M1 makrofag dyrking forhold (Figur 3b). I forhold TIL M-CSF-only-gruppen viste de fasede og kontinuerlige gruppene økte uttrykksnivåer AV CD206. OMVENDT VAR IL-4Ra overflatenivåer markant høyere i M-CSF-only forhold, i forhold til både kontinuerlig og faset. E-cadherin uttrykk forble ensartet på tvers av grupper, MENS CD163 var signifikant høyere i BÅDE M-CSF-only og faset grupper. En observasjon av notatet er at den kontinuerlige eksponeringsgruppen var konsekvent langt mindre homogen i forhold til celle-overflate markøruttrykk. Dette illustreres av bimodalfordeling og stor varians i uttrykksnivåer funnet på histogrammet. I tillegg kan man se dramatiske morfologiske forskjeller mellom behandlingsgruppene. BASERT på fasekontrastbildene produserte M-CSF-gruppen celler som ser ut til å være mindre og svært granulære (Figur 3B). Flowcytometrisk analyse viser at disse cellene har lignende størrelse( FSC), men det er en økning i cellulær granularitet i fasede og kontinuerlige behandlingsforhold (Supplerende Figur S2). Til slutt endret glutamin deprivasjon m2 polarisering, noe som demonstrerte at metabolske produkter er nødvendige under denne strategien (Supplerende Figur S5). Til sammen foreslår disse dataene at faseforholdene gir størst effektivitet For m2 makrofagpolarisering.

vi undersøkte deretter overflatemarkøruttrykk av moDCs som ikke var stimulert eller stimulert MED IL-6 og LPS 24 h før flowcytometrisk analyse. Stimulering MED IL-6 og LPS resulterte i en økning I CD80, CD83 og CD86 uttrykk (Figur 3c). Eldre DC-markør CD83-celleoverflateuttrykk økte dramatisk ved aktivering ved BRUK AV IL-6 og LPS På dag 8 i forhold til den ikke-stimulerte gruppen. DETTE bekreftet AT IL-6 og LPS var i stand til å fremme dendritisk cellemodning (Supplerende Figur S1L). CD1a-uttrykket forblir ensartet mellom de ikke-stimulerte og stimulerte gruppene. Interessant nok forblir de stimulerte Dc-ene i suspensjon, men de syntes å begynne å aggregere og holde seg til hverandre (Figur 3c). Disse resultatene bekrefter tidligere funn angående moDC polarisasjon og gir en ekstra kontroll for overflatemarkøranalyse for å identifisere uønskede moDC-populasjoner innenfor de forskjellige makrofagkultiveringsforholdene.

m2 makrofager generert av faset cytokin eksponering har M2-assosiert funksjonalitet

MANNOSERESEPTOREN (CD206) er en endocytisk og resirkuleringsreseptor som er sterkt uttrykt i Våre m2 makrofagpopulasjoner under fasede behandlingsforhold. Vi ønsket deretter å vurdere CD206-mediert endocytisk opptak i våre makrofager. Dette ble bestemt ved BRUK AV PBI-12-Man, et biokompatibelt middel som fluorescerer ved binding til mannosereseptoren (17). Etter en 1-timers behandling av Både m1-og M2-makrofager med PBI-12-Man var den røde fluorescensen av PBI-12-Man hovedsakelig intracellulær i M2-makrofager under fasede og kontinuerlige behandlingsforhold(Figur 4, A og B). Dette funnet antyder at celleoverflatebinding TIL CD206 og endocytose resulterer i vesikulær lokalisering. Dette stemmer overens med tidligere data fra flowcytometri, som viste at Under fasede behandlingsforhold viste M2-makrofagene et høyere celleoverflateuttrykk AV CD206 i forhold til m1-makrofagpopulasjonen. Interessant, fant vi AT gm-CSF-bare celler viste høye nivåer AV PBI-12-Man endocytose (Figur 4, A og B). Dette korrelerer med våre flowcytometriske data (Figur 2), som viste AT gm-CSF-bare dyrkningsbetingelser produserer M1-celler med m2-assosiert overflatemarkøruttrykk. Til sammen demonstrerer vi at disse cellene hadde de normale egenskapene til makrofager og AT CD206 var funksjonell I m2 makrofagpopulasjonen.

Etter 14 dager i kultur viste M2 makrofager også muligheten til å smelte, nå over 200 µ i størrelse og inneholde flere kjerner per celle(Figur 4C). Disse lignet multi-nukleerte gigantiske celler (MNGCs) som har blitt rapportert å ha fagocytiske og andre evner (20). I tillegg Har MNGCs vært assosiert med fremmedlegemer i kroppen, tuberkulose og kreft (20-23). Denne cellulære fusjonen ble funnet utelukkende i Våre m2 makrofagpopulasjoner og var langt mer signifikant I M2 faset tilstand. MENS M-CSF-gruppene bare hadde noen multinucleated celler (Figur 4C), var deres størrelse og tall mye lavere enn fasegruppen. Gitt disse cellenes evne til å utføre denne makrofagassosierte funksjonen, indikerer disse resultatene videre at de fasede dyrkningsbetingelsene produserer svært M2-lignende makrofager.

her beskrev vi vår nyutviklede faseprotokoll for makrofagpolarisering. Vi fant at inkludering AV IL-6 og faset polarisering behandlingstiming er helt avgjørende for å generere De Mest M1 – Og M2-lignende makrofager in vitro. Dette funnet ble testet grundig sammenlignet med andre polarisasjonsmetoder. Derfor mener vi at den fasede polarisasjonsmetoden gir et betydelig skritt fremover. Dette vil gi forskere enhetlige eksperimentelle standarder for å produsere homogene populasjoner av makrofager for å bruke in vitro og evnen til å sammenligne resultatene. Selv om denne protokollen gir en rekke forbedringer i forhold til dagens polarisasjonsstrategier, tror vi at ytterligere forskning og optimalisering av eksponeringstider og cytokincocktailen vil være nyttig. Dette vil hjelpe oss til å forstå de komplekse rollene Til M1 og M2 makrofager i ulike former for sykdomsprogresjon og fremme utviklingen av ny terapi.