Forbindelser

ALDH1A1 hemmere har nylig blitt beskrevet30. LDHA-hemmere ble tidligere beskrevet I Rai et al.29. IDH1-hemmere ble tidligere beskrevet I Urban et al. Og Davis et al.24,36. Andre forbindelser som ble brukt i studien var Metotreksat (Medchem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MEDCHEM Express HY-18690), Isofagomin (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) OG LY2857785 (MEDCHEM Express, HY12293). For qHTS ble forbindelser i mechanism interrogation plate (MIPE) testet i 11-poeng (intraplate, 1:3 fortynningsfaktor). Kinasehemmersamlingen inneholdende 977 kinasehemmere ble testet i 7-punkts doser (interplate, 1:5 fortynningsfaktor). I alle tilfeller BLE DMSO brukt som kjøretøy.

Kloning

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Åpne Leserammer (ORFs) av genene av interesse ble klonet inn i akseptorbeinene ved Hjelp Av BamHI / EcoRI (N-terminal) eller NheI/BamHI (C-terminal) – steder ved PCR-forsterkning av kodingsområdet med infusjonskompatible oligonukleotider, definert i detalj I Supplerende Tabell S1. Idh1, LDHA, DHFR, GC og ALDH1A1 konstruksjoner ble fremstilt Ved GeneArt Gensyntese (ThermoFisher) i pcDNA3.1 (+). For Gateway kloning (BARE IDH2-konstruksjoner) ble en målvektor som inneholdt 86b-taggen opprettet ved å erstatte V5-taggen i pcDNA3.2-V5 / DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes «LPTFLYKVVDLEGPR» prior to the 86b tag.

Cellekultur

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 og HT-29 celler ble oppnådd fra ATCC (HENHOLDSVIS CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 og HTB-38). HuCC-T1 OG CC-LP-1 var en slags gave Av Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T-celler ble dyrket i DMEM (4,5 g/L glukose) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM l-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 E/mL penicillin og 50 µ/mL streptomycin. LN18, HT-29, CC-LP-1 Og HeLa celler ble dyrket i ovennevnte medium, uten natriumpyruvat. Ov-90 celler ble dyrket i EN 1: 1 blanding AV MCDB 105 medium (Cell Applications Inc.) og m199 medium (Hyklon, GE), supplert med 15% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin( Livsteknologier), og en endelig konsentrasjon på 1,85 g/L natriumbikarbonat (Hyklon, GE). 22rv1 -, HuCC-T1-og MDA-MB-468-celler ble dyrket i rpmi 1640 supplert med 10% FBS, 6 mM l-glutamin, 100 enheter/mL penicillin, 100 µ / mL streptomycin. Alle celler ble dyrket ved 37 °C i en fuktet inkubator opprettholdt ved 5% CO2 og testet negativt for mykoplasma ved Bruk Av Et Mycoalert deteksjonssett (Lonza).

Rekombinant protein og peptidproduksjon og rensing

11s og 86b proteiner ble produsert Av GenScript. For rekombinant 11s-fragment ble den kodende DNA-sekvensen smeltet til en 6x hans-tag for å lette nedstrøms rensing, og sekvensen ble subklonert til En e. coli-uttrykksvektor. BL21 Star (DE3) celler ble transformert med rekombinante plasmider og en enkelt koloni ble inokulert I LB medium inneholdende IPTG for induksjon av proteinuttrykk. SDS-SIDE og Western blot analyse ble brukt til å overvåke uttrykket og velge optimal innhøsting timing. Celler ble høstet ved sentrifugering og pellets ble lysert ved sonikering. Etter His-tag rensing, fraksjoner ble sterilisert gjennom en 0.22 µ filter. Proteiner ble analysert AV Sds-PAGE Og Western blot ved hjelp av standardprotokoller og en mus-anti-His mAb (GenScript, Cat. No. A00186). konsentrasjonen av renset protein ble bestemt ved Bruk Av En Bradford – proteinanalyse MED BSA som standard. Protein ble lagret I 1X PBS, 10% glyserol, pH 7,4, og renhet var omtrent 90%, som estimert ved densitometrisk analyse Av Coomassie Blåfarget sds-SIDE gel under reduserende forhold. 15 aminosyren 86b peptid ble lagret i ultrapure dH2O og var 99.9% ren AV HPLC.

LAV gjennomstrømning (96-brønns PCR-plater eller-striper) CETSA-komplementeringsanalyse

Celler ble transfisert i 6-brønnskåler ved hjelp av en omvendt transfeksjonsprosedyre, hvor 1,25 ml komplekser (6,25 µ Lipofektamin 2000 og 3 µ DNA per brønn) ble kombinert med 1,25 ml HEK293T cellesuspensjon (1 × 106 / mL, totalt 1,25 × 106 celler). FOR CDK9 ble det brukt 2 µ DNA per brønn. Etter 24 timer (48 timer FOR CDK9) ble celler høstet ved trypsinisering og resuspendert til 1 × 106 celler/mL (med mindre annet er angitt) I CETSA buffer inneholdende DPBER (Med CaCl2 og MgCl2) pluss 1 g/l glukose, 1x Halt proteasehemmer cocktail (ThermoFisher) og 0,5% DMSO (DMSO ble ikke tilsatt for eksperimenter som fikk etterfølgende forbindelse og kjøretøybehandling). For temperaturområdeforsøk (uten forbindelse eller enkeltdose) ble prøver aliquotert TIL PCR-striper ved 30 µ per rør. Forbindelsen ble tilsatt og celler ble inkubert ved 37 °C i 1 h. Prøver ble deretter oppvarmet i 3.5 min ved bruk av en forvarmet termisk cycler, tillatt å balansere til romtemperatur, og 6 µ på 6% NP40 ble tilsatt til hver brønn. For fryse-tine eksperimenter ble rør plassert i en ALUMINIUM PCR-blokk på et tørris / etanolbad i 3 min etterfulgt av inkubering ved 37 °C i 3 min, vortexing i 3 sek, og gjenta disse trinnene tre ekstra ganger. 11s (GenScript) og furimazinsubstrat (Fra Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega) ble tilsatt ved endelige konsentrasjoner på 100 nM og 0.5X, henholdsvis, og prøver ble analysert for luminescens intensitet ved hjelp Av En ViewLux High-throughput ccd imager (Perkin Elmer) utstyrt med klare filtre.

384-brønns CETSA-analyse

Celler ble transfisert i t75-kolber ved hjelp av en omvendt transfeksjonsprosedyre, hvor 9 mL komplekser (45 µ Lipofektamin 2000 og 22,5 µ dna) ble kombinert med 10 mL HEK293T cellesuspensjon(1 × 106 celler/mL, totalt 10 millioner celler). Etter 24 timer ble cellene høstet ved trypsinisering, resuspendert til 1 × 106 celler / ml som beskrevet ovenfor og utlevert (15 µ celler/brønn) til 384-brønns PCR-plater (Roche) ved Bruk Av En Multidrop Combi (ThermoFisher). Forbindelser (63 nL) eller DMSO vehicle control (63 nL) ble deretter festet ved hjelp av et pinneverktøy (GNF) og inkubert i 1 t ved 37 °c. Plater ble forseglet og oppvarmet til den angitte temperaturen i 3,5 min og avkjølt til 25 °C ved BRUK AV AB qPCR-maskin (Roche) ved bruk av rampehastighet på 1,5 °C/sek for oppvarmingsfase og maksimal rampehastighet for kjølefasen. Tre µ på 6% NP40 ble tilsatt per brønn og inkubert i 30 min for å tillate cellelyse etterfulgt av tilsetning AV 11s og furimazinsubstrat (ved endelige konsentrasjoner på henholdsvis 100 nM og 0,5 X). Prøver ble analysert for luminescens intensitet ved hjelp Av En ViewLux leser.

1536-brønns CETSA-analyse

Celler ble transfisert og høstet som ovenfor (384-brønnprotokoll). Celler ble utlevert (5 µ celle/brønn) til 1536-brønnhvite plater (Aurora, syklisk olefinpolymer, cat# ewb041000a) ved Bruk Av En Multidrop Kombi. Forbindelser (23 nL) ble deretter festet ved hjelp av et pinneverktøy (Wako Automation) og inkubert i 1 t ved 37 °C. Plater ble oppvarmet til angitt temperatur og tid ved bruk av en varmeblokk (se nedenfor) og avkjølt til 25 °C. En µ på 6% NP40 ble tilsatt per brønn og plater ble inkubert i 30 min for å tillate cellelyse etterfulgt av tilsetning av 3 µ 11s (endelig konsentrasjon 100 nM) og furimazinsubstrat. Plater ble sentrifugert og analysert for luminescens intensitet ved hjelp Av En ViewLux leser. FOR LDHA-og CDK9-skjermene, en endelig konsentrasjon på 0,5 x og 0.25x furimazin ble brukt, henholdsvis. Normaliseringskontroller inkluderer DMSO og GSK2837808A-behandlede prøver eller uoppvarmede prøver for HENHOLDSVIS LDHA og CDK9. CDK9-telleskjermen ble utført som ovenfor med følgende forskjeller: 5 µ av ikke-overførte HEK293T-celler (1 × 106/mL I CETSA-buffer) ble dispensert i 1 536 brønnplater etterfulgt av sammensatt tilsetning, 37 °c inkubasjon, varme-og lysisetrinn som ovenfor. Deretter ble 500 pM (endelig) av 86b tilsatt til brønnene, etterfulgt av tilsetning av 100 nM 11S og 0,25 x furimazin substrat (endelig).aluminiumsblokken for oppvarming av en 1,536-brønnplate ble designet ved å måle en plate for å bestemme dimensjonene til området som grenser til støpte forsterkningsribber I X Og Y, og bunnbrønnflaten Og bunnflensflaten I Z. deretter ble en blokk som skulle bearbeides fra 6061 t6 aluminiumsplate støpt, noe som ville være en fri passform med omtrent 0,5 mm klaring for platen i alle akser. Blokken ble maskinert ved hjelp av en manuell vertikal fresemaskin, endemøller og en ansiktsmølle. For ovnsoppvarmingsforsøk ble plater plassert i midtstativ av konveksjonslabeovn (ThermoFisher) og dekket med metalllokk for å minimere fordampning.

CETSA i cellulære lysater

Celler ble samlet i CETSA-buffer ved 1,0 × 106 celler/mL (som beskrevet ovenfor) og NP40 ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,4%. Etter roterende prøver i 30 min (romtemperatur) ble lysatene klargjort ved sentrifugering ved 20 000 × g i 10 min (4 oC). Kofaktor (F. eks. NAD+) ble tilsatt til det klargjorte lysatet. For temperaturresponsforsøk ble 25 µ lysat overført TIL PCR-rør og oppvarmet i 3,5 min til forskjellige temperaturer. For isotermiske doseresponseksperimenter ble 5 µ avklart lysat dispensert til 1536-brønnplater ved Bruk Av En BioRAPTR FRD-arbeidsstasjon og prøver ble oppvarmet på en aluminiumsblokk. Prøver fikk lov til å balansere til romtemperatur og substrat ble tilsatt (endelig konsentrasjon: 100 nM 11S, 0,5 x furimazine). Luminescens ble fanget ved hjelp Av En ViewLux imager som skissert ovenfor.

Western blots

Prøver ble behandlet som skissert i lav gjennomstrømning komplement assay seksjon, ved hjelp av fryse-tine sykluser for lysis. Lysater ble sentrifugert ved 15 200 × g i 20 min ved 4 °C. Prøver ble kjørt på en 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (ThermoFisher) ved BRUK AV MOPS buffer og overført til EN PVDF membran ved bruk av et iBlot 2 overføringssystem ved 25 V i 7 min. Membraner ble blokkert med en 5% melkeoppløsning (50 Mm Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) og primære antistoffer ble inkubert over natten ved 4 °C i blokkeringsløsning. Antistoffer ble: anti-IDH1 (, Cellesignal #8137, 1: 500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Cellesignal #3582, 1: 1000). Anti-kanin / mus-HRP (kanin = Cellesignalering 7074; mus = Cellesignalering # 7076) ble tilsatt ved 1: 2500 og inkubert i 1 h ved romtemperatur. Et kjemiluminescerende signal ble generert Med Supersignal west dura solution (ThermoFisher) og fanget ved Hjelp Av Et Biorad Chemidoc-system. Densitometrisk analyse ble utført ved Hjelp Av Photoshop-programvare (Adobe).

2-hg-analyse

HEK293T-celler reverseres transfisert i 24 brønnretter ved å legge til 2.5 × 105 celler på transfeksjonskomplekser(0.75 µ plasmid-DNA, 1.5 µ Lipofektamin 2000 per brønn). Cellekulturmedium ble samlet etter 72 timer og 15 µ ble overført til 384-brønns ugjennomsiktig plate. 1,5 µ på 660 mM HCl ble tilsatt til hver brønn og prøver ble inkubert ved romtemperatur i 10 min. 1,5 µ av 720 mM Tris-HCl base ble lagt til hver brønn. Deretter 52 µ av 2-HG deteksjonsløsning (100 mM HEPES (pH 8,0), 100 µ NAD+, 1 µ/mL aktiv rekombinant D-2-Hydroksyglutarat dehydrogenase (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 µ resazurin, 0,03 mg/mL diaphorase (Sigma, Cat: D5540) ble tilsatt og platen ble inkubert ved romtemperatur. En 2-HG standardkurve ble utarbeidet i 100 mM HEPES (pH 8,0). Fluorescens ble målt på En ViewLux-leser Ved Hjelp Av Ex: 525, Em: 598/25 filtre.

Biokjemiske analyser

LDHA biokjemisk analyse ble utført som tidligere beskrevet29. Kort sagt, 3 µ human laktatdehydrogenase 5 (2 nM endelig) (nr. A38558h, Meridian Life Science, Inc.) I LDH-analysebuffer (200 Mm Tris HCl, pH 7,4, 100 µ EDTA og 0,01% Tween-20) ble tilsatt til en svart solid bunn 1536-brønn analyseplate (Greiner Bio-One). Etter overføring av forbindelse med pin (23 nL) ble det utlevert 1 µ substratoppløsning inneholdende NADH (0,06 mm endelig) og natriumpyruvat (0,2 mM endelig) (Sigma-Aldrich) I LDH-analysebuffer for å initiere reaksjonen. Etter 5 min inkubasjon ved romtemperatur ble 1 µ deteksjonsreagenset tilsatt til hver brønn. Plater ble umiddelbart overført til En ViewLux-leser, og eventuell resulterende resorufinfluorescens ble målt (ex 540 nm, em 590 nm) ved 0 og 10 min. Fluorescens ble normalisert ved bruk av enzymfrie og DMSO-behandlede kontrollbrønner på hver plate.

ALDH1A1 biokjemisk analyse ved bruk av ukodet protein ble utført som tidligere beskrevet31, 37. Kort sagt ble 3 µ av 20 nM renset human ALDH1A1 i analysebuffer (100 mM HEPES pH 7,5 med 0,01% Tween 20) dispensert i en 1536-brønn solid bunn svart plate (Greiner Bio One). Tjuetre nl av forbindelser eller kontroll Bay 11-7085 ble overført via pin verktøy (Wako Automation). Prøvene ble inkubert (romtemperatur, beskyttet mot lys) i 15 min etterfulgt av en 1 µ substrat tilsetning av NAD + og Propionaldehyd (endelige konsentrasjoner på henholdsvis 1 mM og 80 µ). Plater ble sentrifugert og lest i kinetisk modus på En ViewLux imager utstyrt med 340 nm eksitasjon, 450 nm utslippsfiltre for 5 min. Endringen i fluorescensintensitet over 5 min ble normalisert ved bruk av enzymfrie og DMSO-behandlede kontrollbrønner på hver plate.

TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase Binding assay FOR CDK9 / cyclin K ble kjøpt fra ThermoFisher og utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 4 µ av en mastermiks inneholdende 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotin Anti-His Ab, 2 nM Eu-Streptavidin og 10 nM Kinase Tracer 236-Oppløsning I 1x Kinasebuffer dispensert i Greiner 1536-brønnhvite medium-bindingsplater ved Bruk Av En BioRAPTR FRD-arbeidsstasjon. Tjuetre nL av sammensatte og kontroller (DMSO og LY2857785 ved en endelig konsentrasjon på 6 µ) ble umiddelbart levert til analyseplatene via pin-verktøyoverføring. Platene fikk lov til å ruge i 1 time ved romtemperatur, og tr-FRETFLUORESCENS ble deretter målt med En PerkinElmer EnVision Multilabel plateleser (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Lagtid 100 µ; Integrasjonstid 200 µ).

laktatproduksjonsanalyse

HEK293T-celler ble dyrket som beskrevet ovenfor. Celler ble skyllet MED PBS, trypsinisert og resuspendert i fenolrød FRI DMEM (Life Technologies) uten kosttilskudd. Cellene ble umiddelbart belagt til 1536-godt svarte klare bunnplater (Corning) ved 250 celler per brønn i 4 µ volum. Forbindelse eller kjøretøy kontroll ble lagt til brønner via pin verktøy overføring og celler ble inkubert på 37 °C for 1 h. To µ av laktat reaksjon blanding (Biovision K607-100) ble lagt til hver brønn og plater ble dekket og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Fluorescens ble målt ved hjelp Av En ViewLux microplate imager utstyrt Med Ex / Em 528/598 nm filtre.

Aldefluor assay

for første bestemmelse av 86B-merket ALDH1A1-aktivitet ble celler transfisert ved hjelp av en omvendt transfeksjonsprosedyre, hvor 1 mL komplekser (6 µ Lipofektamin 2000 og 3 µ dna) ble kombinert med 1 mL ln18 cellesuspensjon (5 × 105 / mL) og 100 µ/brønn blandet ble dispensert i svarte, klare 96-brønnplater (Corning). Etter 24 timer ble media fjernet og erstattet med 100 µ/brønn Aldefluorbuffer (STEMCELL Technologies) som inneholdt BAAA-substrat og Hoechst 33342 (ThermoFisher, sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 500 nM og 0,5 nM). Kjøretøy DMSO eller DEAB (1 µ endelig) ble deretter tilsatt og plater ble inkubert i 30 min ved 37 °C for å tillate konvertering av BAAA til BAA. Cellene ble vasket og 100 µ/brønn Aldefluorbuffer ble dispensert før avbildning på En In-Celle 2200 (GE Healthcare). FOR høy gjennomstrømmingsanalyser ble LN18-celler transfisert I t75-kolber ved hjelp av en omvendt transfeksjonsprosedyre som beskrevet ovenfor for HØY gjennomstrømming HEK293T CETSA-analyser. Etter 16 timer ble cellene høstet og belagt (1000 celler/brønn/5 µ) i svart, optisk kvalitet klar bunn, tc-behandlede 1536-brønnplater (Aurora Mikroplater) ved hjelp av En Multidrop Kombidispenser og inkubert over natten ved 37 °C. Aldefluor-analysen med høyt Innhold ble deretter utført på transfiserte ln18-celler eller ikke-transfisert OV-90 som tidligere beskrevet 31. Bilder ble analysert ved HJELP Av In Cell Investigator v1.6.2 analysis software ‘ s hermetisert Multi-Target Analysis algorithm (GE Healthcare) som beskrevet.

Membrananalyse for termisk integritet

30 000 HEK293T-celler ble tilberedt i 30 µ CETSA-buffer inneholdende 1x proteasehemmercocktail (ThermoFisher) supplert med 0,5% DMSO (1,5% DMSO totalt). FOR DMSO-toleranseeksperimentet ble DMSO lagt til DPBS ved 0, 1, 2 eller 3%. Cellesuspensjoner ble oppvarmet i 3,5 min ved 42 til 74 °C, med 4 graders intervaller, deretter fjernet til en aluminiumsblokk på våt is. Cellesuspensjoner ble blandet med Like Deler Trypan Blå (LONZA) (=0,2% trypan blå) og telles umiddelbart ved Hjelp Av En C-chip hemocytometer (iNCyto, Korea). Trypan positiv (permeabilized) og negativ (intakt) ble talt, med n = 2 ved hver temperatur. For ytterligere cellelinjer ble en million celler fremstilt i 100 µ av fenolrødt FRITT DMEM inneholdende 1% DMSO. Cellene ble oppvarmet i 3 min over 42 til 90 °C med 4 graders intervaller, deretter fjernet til en aluminiumsblokk på våt is. Membranintegritet ble vurdert som beskrevet ovenfor.

PAMPA

røring dobbel-vask PAMPA metoden patentert av pION Inc. (Billerica, MA) ble brukt til å måle sammensatt permeabilitet som tidligere beskrevet38. Forbindelser ble fortynnet i donor-og akseptorløsninger bufret til pH7. 4 og DMSO-konsentrasjonen var 0,5%. Permeabilitet beregninger ble utført ved Hjelp Av Pion Inc. programvare.

qhts analyse

Data fra hver analyse ble normalisert platevis til tilsvarende kontroller som beskrevet tidligere39. De samme kontrollene ble også brukt for beregning Av Z ‘ faktor for hver analyse. Prosent aktivitet ble avledet ved hjelp av intern programvare (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Alle konsentrasjon-respons kurver ble montert OG AC50 ble beregnet Med GraphPad Prism programvare; kurver ble klassifisert som beskrevet tidligere27. Området under kurven (AUC) ble beregnet ved hjelp av trapesformet regel for å tilnærme området mellom responskurven og x-aksen over konsentrasjonsområdet. Ekvivalente konsentrasjonsområder ble brukt for alle forbindelser i et eksperiment. Cutoff effekt på 3 σ fra gjennomsnittet (av kjøretøykontroll) ble brukt til å klassifisere aktive forbindelser.