Abstract
Carbendazim, som et soppdrepende middel, ble ofte brukt til å kontrollere soppsykdommer i jordbruk, skogbruk og veterinærmedisiner. I denne studien ble akutt og reproduktiv toksisitet av karbendazim vurdert ved Hjelp Av Caenorhabditis elegans (C. elegans) som en modell for å foreløpig vurdere de potensielle risikoene for dette fungicidet i landbruksproduksjon og anvendelse. Resultatene viste at veksten Av c. elegans ble hemmet av 0,01 µ/L carbendazim. Behandlingen av 0,1 µ/L karbendazim forårsaket en signifikant reduksjon i bevegelsesadferd og betydelig skade på reproduksjons-og antioksidantsystemet, noe som førte til at levetiden til nematoder ble drastisk forkortet. Disse resultatene gir en bedre forståelse av miljørisikoen for carbendazim og gir nye bekymringer om sikkerhet.
1. Introduksjon
Pesticider, en slags kjemiske eller biologiske reagenser, er mye brukt i landbruket for å regulere plantevekst og kontrollere sykdommer og skadedyr, som kan fremme vekst og forbedre avlinger . Den utbredte bruken av plantevernmidler vil imidlertid føre til forskjellige grader av rester i avlinger eller mat og dermed påvirke menneskers helse . Problemene med plantevernmidler har ikke bare tiltrukket stor oppmerksomhet fra forbrukerne, men også blitt en av de viktigste faktorene som påvirker mattryggheten .Carbendazim, som et bredspektret fungicid, har blitt brukt til å kontrollere soppsykdommer i landbruk, skogbruk og veterinærmedisiner . Imidlertid er carbendazim kategorisert i den farlige kategorien kjemikalier Av Verdens Helseorganisasjon og har blitt klassifisert i prioriteringslisten for hormonforstyrrende kjemikalier av Eu-Kommisjonen . I de senere år er det åpenbart at den utbredte bruken av carbendazim med over-range og overdose og det faktum at carbendazim er vanskelig å bli degradert både føre til problemet med carbendazim rester i landbruket . Selv om den toksiske effekten av karbendazim har blitt rapportert siden 1980-tallet, blir giftigheten av karbendazim et hett tema på grunn av den økende bekymringen for miljø endokrine forstyrrelser . Carbendazim har blitt forbudt i flere land på grunn av negative virkninger på miljø og helse som utvikling og reproduktive forstyrrelser, toksisitet og mutagenitet . Bivirkninger av karbendazim på biokjemiske, histopatologiske og hematologiske parametere i lever, nyre og endokrine kjertler og deres hormonelle nivåer er vist hos rotter . I tillegg trenger den videre studier på lav konsentrasjon på grunn av rester av karbendazim.Caenorhabditis elegans (c. elegans), som en viktig forskningsmodell, er mye brukt til å gjøre noen vurdering. Ifølge Amrit et al. , C. elegans har mange fordeler, for eksempel liten størrelse, rask generasjon tid, lett å dyrke på laboratoriet, og kort voksen levetid. C. elegans ble valgt i denne studien som modellorganisme for å evaluere toksisiteten av lav konsentrasjon av karbendazim, som kan betraktes som en referanseverdi for anvendelse av karbendazim i landbruket.
2. Materialer og Metoder
2.1. Kjemikalier og Stammer
Carbendazim (renhet ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, Kina) ble oppløst I N, n-dimetylformamid (DMF; Sinopharm Kjemisk Reagens Co., LTD, Shanghai, Kina) for å produsere 1 g/L carbendazim opprinnelige løsning. Konsentrasjonene av DMF var 0,1% i endelige eksponeringsløsninger (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µ/L). 0,1% DMF uten carbendazim var kontrollgruppen. C. elegans (wild – Type N2) ble opprinnelig hentet fra Caenorhabditis Genetics Center (University Of Minnesota, MN, USA). Nematodene ble dyrket på nematode vekstmedium (NGM) plater som ble sådd Med Escherichia coli OP50 ved 20°C som beskrevet . L1-larval c. elegans ble samlet ved å vaske de gravide nematoder med en blekeblanding (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Dødelighet
Karbendazim originale oppløsninger (1 g/L) ble fortynnet Med s flytende medium (1,12 g K2HPO4, 5,92 G KH2PO4 og 5,85 g NaCl ble fortynnet med 1 l vann) for å få de endelige karbendazimkonsentrasjonene av 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, og 1 mg/L, som inneholdt 0,1% DMF. S flytende medium med 0,1% DMF var kontrollgruppen. 30 nematoder (L4) ble testet i 96-brønnplater for hver konsentrasjon. Overlevelsen av nematoder ble telt under et mikroskop etter dyrking i 24 timer i inkubatoren. Prosessen med testen er basert På Metoden For Xiang et al. . Tre parallelle eksperimenter var nødvendig.
2.3. Locomotion Behavior
Minst 10 c. elegans (L4) ble plukket tilfeldig fra hver konsentrasjon for å bestemme lokomotivets oppførsel, som ble registrert av både head-thrash-frekvensen og kroppens bøyetider . Antall head-thrash frekvens ble regnet med endringer i retning av bøying på midbody Av C. elegans i 1 min. Måling av kroppsbøyning ble definert som tider for retningsendringer av delen av nematodene dyrket i NGM uten E. coli OP50 i 30 s.
2.4. Vekst-Og Utviklingsanalyser
C. elegans utsatt for karbendazim for 24 h ble analysert. Kroppslengden av nematoder utsatt for karbendazim ble vurdert av Image J-programvaren. Avkom Av Hver C. elegans Fra l4 larver til dag 1 ble registrert På l3 scenen etter individuelt overføring til en ny plate hver dag til reproduksjon opphørt . Minst tre parallelle tester ble utført.
2.5. Levetidsanalyse
Alle C. elegans som ble testet for levetidsanalyse ble dyrket i samme tilstand ved 20°C. de synkroniserte c. elegans ble dyrket i NGM-plater med forskjellige konsentrasjoner av karbendazim frem til dag 4. De testede nematodene vil da bli overført til nye NGM-plater hver 2. dag. Overlevende Og døde C. elegans ble registrert daglig (begynner på den første dagen i voksen alder) til alle nematoder for hver konsentrasjon hadde dødd . Minst tre parallelle tester ble utført.
2.6. Bestemmelse Av Oksidativ Skade
Intracellulær ROS ble målt med 2′, 7 ‘ – diklordihydrofluoroscein diacetat (H2DCFH-DA), som er den vanligste og mest følsomme reaktive oksygendeteksjonssonden langt. Den ville Typen N2 c. elegans ble vasket I M9 buffer og deretter ultrasonisk forstyrret. Supernatanten ble analysert ROS-nivået etter instruksjonene TIL ROS-settet. Den endelige arbeidskonsentrasjonen AV H2DCHE-DA var 10 μΜ . Eksitasjons – og emisjonsabsorbansbølgelengder var henholdsvis 485 nm og 535 nm. Minst tre parallelle tester ble utført.Intracellulær total superoksiddismutase (T-SOD) ble bestemt i henhold til instruksjonene FRA T-SOD-settet kjøpt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Etter vasket Med M9 tre ganger, ble de undersøkte nematoder ultrasonisk forstyrret og reagert med ET T-SOD-sett. Absorbansbølgelengden var 550 nm. I tillegg ble supernatanten brukt til å oppdage nivået av protein for hver konsentrasjon, hvor absorbansbølgelengden var 595 nm. Minst tre parallelle tester ble utført.
2,7. Dataanalyse
Alle data ble gitt som gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM) ved å bruke enveis ANOVA. Grafer ble presentert Ved Hjelp Av Origin 8.5 Og GraphPad Primer 7, og statistisk analyse ble utført ved HJELP AV spss 19.0-programvaren. Det statistiske signifikansnivået ble utført ved bruk av og .
3. Resultater
3.1. Bestemmelse Av Bevegelsesadferd Av C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans etter carbendazim akutte eksponeringer ved å analysere data om head-thrash frekvens og kroppen-bøying ganger av nematoder(Figur 1(a) og 1 (b)). Begge viste signifikant reduksjon ved karbendazimkonsentrasjoner fra 0,01 µ/L til 100 µ / L (). I tillegg ble hodestøtene av nematoder utsatt for 100 µ/L redusert til 68,27%. For karosseribøyningstesten, da karbendazimkonsentrasjonene var 10 µ/L og 100 hryvnias/L, hadde Den en signifikant hemmende effekt på karosseribøyningene Til C. elegans med henholdsvis 36,77% og 35,48% sammenlignet med kontrollgruppen.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Bestemmelse Av Vekst Og Utvikling Av C. elegans etter Akutt Karbendazimeksponering
Sammenlignet med kontrollgruppen (Figur 1(c) og 1(d)) ble kroppslengde og kroppsoverflate signifikant () redusert i eksponeringsgruppene fra 0,01 µ/L til 100 µ/L. begge ble redusert med henholdsvis 19,16% og 22,15% ved behandling av 0,01 µ/L sammenlignet med kontrollgruppen. Konsentrasjonen på 10 µ / L ga de mest negative effektene, og kroppslengde Og kroppsoverflate For c. elegans ble redusert med henholdsvis 35,21% og 65,22% sammenlignet med kontrollgruppen.
3.3. Bestemmelse Av Stamfiskstørrelsene Av C. elegans etter Akutt Karbendazimeksponering
ifølge Figur 2 hadde stamfiskstørrelsene av nematoder en signifikant reduksjon () i behandlingsgruppene fra 0,1 µg/L til 100 µ/L. stamfiskstørrelsene Av C. elegans ble mest signifikant redusert, noe som ble redusert til 43,71% ved behandling av 10 µ/L sammenlignet med kontrollgruppen.
3.4. Bestemmelse Av Levetiden Til C. elegans etter Akutt Karbendazimeksponering
C. elegans levetid ble signifikant hemmet av 0,01 µ/L til 100 µ/L karbendazim i henhold til levetidskurven vist i Figur 3. Resultatene viste at c. elegans levetid ble redusert fra 24 til 20 dager ved behandling av 0,01 µ/L karbendazim. Levetiden til nematoder behandlet med 0,01 µ/L karbendazim ble redusert med 20,00%. Når karbendazim-eksponeringskonsentrasjonen var 100 µ/L, ble levetiden Til c. elegans mest redusert med 45,83%.
3.5. Effekter Av Akutt Eksponering For Karbendazim på Antioksidantsystemet Til c. elegans
ROS-nivåene av kontroll og behandlet c. elegans ved karbendazimeksponering av forskjellige konsentrasjoner er vist I Figur 4 (a). Det ble indisert at nivået av intracellulær ROS var signifikant økt () i områder fra 0,01 µ / L til 100 µ/L karbendazim. SAMMENLIGNET med kontrollen økte ROS-nivået maksimalt med 70,60% ved behandling av 10 µ/L. ifølge resultatene av intracellulære SOD-nivåer hadde det en økning ved behandlingen fra 0.01 µ/L til 100 hryvnias/l carbendazim(Figur 4 (b)). SOD-nivået økte med 10,70% ved 0,1 µ/L karbendazim sammenlignet med kontrollgruppen.
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Diskusjon
Carbendazim, som fungicider, er mye brukt i landbruket for å hemme veksten av sopp. Carbendazim har vært forbudt å bruke I Australia, det Meste Av Eu og USA på grunn av sin alvorlige toksikologi og vedvarende natur . For denne studien var Det første gang Å bruke C. elegans som modellorganismer for å evaluere effekten av carbendazim på lokomotivadferd, vekst og utvikling, reproduksjon, levetid og antioksidantsystemer. Videre viste resultatene at Det hadde en negativ innflytelse På C. elegans.
i Henhold til 24 h-LC50 er den akutte toksisitetskonsentrasjonen Av c. elegans eksponert for forskjellige konsentrasjoner av karbendazim 0,867 mg / L. 96-h LC50 av karbendazim som respons på sebrafisk er illustrert som 1,75 mg / L . Eggene Av Preussisk karpe Carassius gibelio har vist toksisitetseffekter ved konsentrasjonen av 0,036 mg / L . Studier presenterte at vekst Og utvikling Av Navicula sp. hemmet av karbendazim med en 24 h-EC50-verdi på 2,18 mg / L. selv om algeveksthastigheten gjenvinnes etter 72-h eksponering, forblir klorofyll-a-innholdet signifikant redusert når behandlingen av karbendazim var over 0,5 mg / L . I denne foreliggende, C. elegans utsatt for en lav konsentrasjon av karbendazim ble valgt for å evaluere dens effekter avhengig av den faktiske konsentrasjonen av human daglig eksponering. Lave konsentrasjoner av karbendazim betyr ikke at det er trygt. Carbendazim viser negative biologiske virkninger ved mye lavere doser i noen studier.Lokomotivadferd ble evaluert for å vurdere Nevrotoksisiteten Til C. elegans (L4 larve) etter 24-timers eksponering for karbendazim. Resultatene viste at carbendazim kunne ha negative effekter på lokomotiv atferd gjennom påvisning av hodet juling og kroppen bøying Av C. elegans, som begge var mer følsom på høyere eksponeringsgruppen. Lokomotivet til sebrafiskembryoer utsatt for karbendazim er følsomt . Tidligere studier har vist at fisk har en unormal oppførsel når subletale konsentrasjoner av karbendazim er 0,22-0,43 mg / L .
utviklingsmisdannelser kan også være en årsak til unormal bevegelse . Veksten og utviklingen Av c. elegans ble analysert i vår studie. Resultatene viste at kroppslengden Og kroppsområdet Til c. elegans ble signifikant redusert ved behandling som oversteg 0,01 µ/L karbendazim. Den normale veksten av vertebrater er relatert til metabolsk skjoldbruskhormonhomeostase . Williams et al. har indikert at karbendazim kan forårsake sædtap etter implantasjon, føtal misdannelse og langsom vekst og utvikling.
karbendazims reproduksjonstoksisitet er vist at karbendazim kan hemme mikrotubulepolymeriseringen av sopp-og pattedyrceller, og forårsake forstyrrelse av mikrotubulasammensetningen ved å virke med β-tubulin, noe som resulterer i nedsatt segregering av kromosomer i prosessen med celledeling . Dannelsen av mikrotubuli ved ikke-kovalente bindinger av α-og β-tubulin er ansvarlig for kromosomsegregering i prosessen med mitose og meiose . Stamfiskstørrelsen til c. elegans reduseres signifikant ved 0,1 µ/L karbendazimkonsentrasjon. Carbendazim har vist seg å påvirke reproduksjonssystemene I Japanske vaktler og hamstere . Det ble konkludert med at c. elegans levetid var signifikant redusert med carbendazim-konsentrasjon av ≥0,01 µ / L basert på vår studie. Studier har vist at karbendazim har ført til infertilitet og utviklingstoksisitet og manifesterer embryotoksisitet, kimcelleapoptose og teratogenese hos forskjellige pattedyrarter .Apoptose Er en kompleks programmert celledød, som er et høyt regulert fenomen preget av en rekke cellulære prosesser . Mange studier har presentert at produksjonen AV ROS indusert av oksidativt stress er relatert til apoptotisk celledød . Vår studie fant at carbendazim kunne indusere en signifikant økning i NIVÅET AV ROS-verdier og en liten økning i NIVÅET av SOD-verdier. Oksidativt stress forårsaket av miljøforurensning induserer økt uttrykk FOR ROS og skader deretter antioxidantforsvaret . SOD er ansvarlig for avgiftning av giftige frie radikaler og deres aktiviteter, som brukes til å evaluere oksidativt stressnivå og cellulær antioksidantstatus . Metalloenzymsod akselererer transformasjonen av endogene cytotoksiske superoksidradikaler TIL H2O2, og økningen av SOD-uttrykksnivåer kan bidra til å forbedre enzymaktiviteten for å eliminere superoksidradikaler indusert av karbendazim og for å forhindre forekomst av cellulær dysfunksjon under eksponering av karbendazim . Høyere eksponeringskonsentrasjoner av karbendazim kan forårsake alvorlig oksidativt stress, som deretter ødelegger balansen mellom cellehomeostase og fremmer apoptose . Imidlertid kan karbendazim i lave konsentrasjoner fortsatt skade reproduksjonssystemet betydelig i henhold til våre resultater.
5. Konklusjon
så vidt vi vet, evaluerte denne studien sikkerheten til carbendazim utsatt For C. elegans for første gang. Det viste at carbendazim kunne ha en skadelig effekt på lokomotivets oppførsel, utvikling og vekst, reproduksjon, levetid og antioksidantsystem Av C. elegans. Håper at det må være mer oppmerksom på anvendelsen av carbendazim basert på resultatene. I tillegg må sikkerheten til karbendazim for bruk vurderes ytterligere, spesielt bioakkumuleringstoksisitet og potensielle gentoksiske effekter.
Datatilgjengelighet
alle data generert eller analysert i løpet av denne studien er inkludert i denne artikkelen.
Interessekonflikter
forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Bekreftelser
denne forskningen ble støttet Av National Natural Science Foundation Of China (31501569).
