Dette er den første i en tredelt serie om transformasjon Av E. coli. Ved slutten av dette bør du være ekspert På e. coli transformasjon og hvilke stammer å velge for forskjellige applikasjoner. Hvis du allerede er en ekspert, håper jeg det vil være en hyggelig oppfriskning for deg. I begge tilfeller, kan du kommentere nedenfor hvis du har noe å legge til.

Bruk Av Elektrisitet for Transformasjon

Fremmed DNA kan innføres i kompetent E. coli ved hjelp av elektroporering eller kjemisk transformasjon. Når du bruker elektroporasjon, bruker du en elektrisk strøm over cellen. Strømmen antas å skape øyeblikkelige «porer» i cellemembranene, noe som tvinger det negativt ladede DNA inn i cellene ved en elektroforese-type effekt. For å lage elektro-kompetent E. coli, vask cellene grundig for å fjerne alle mediumsalter. Dette sikrer at ladningen ikke gjennomføres gjennom mediet. Utfør også elektroporasjonen ved 0°C for å minimere varmeskader på cellene.

Kjemikalier: De Arbeider Også

for å lage kjemisk kompetente celler, resuspend E. coli i En CaCl2-løsning ved 0°C. Under Disse forholdene antas ca2 + – ion å skape porer i membranen, hjelpe bindingen AV DNA til cellemembranen og maskere den negative ladningen PÅ DNA. Sammen letter DISSE passasjen AV DNA gjennom den hydrofobe cellemembranen. Tvinge DNA inn i cellene ved å påføre et kort 42°c varmesjokk, noe som resulterer i en termisk strøm som feier DNA inn i cellene.

Fordeler og Ulemper ved Hver

Elektroporasjon er mindre tungvint enn kjemisk transformasjon og gir generelt høyere transformasjonseffektivitet (målt i kolonier dannet per mikrogram DNA). Det er imidlertid dyrere. Det krever et spesialisert apparat for å levere ladningen og kyvetter for å overføre ladningen til cellesuspensjonen. Elektroporasjon er følsom for salt – du kan miste dyrebare prøver hvis overflødig salt overføres til kuvetten.

personlig foretrekker jeg kjemisk transformasjon. Selv om DET tar rundt en halv time lenger, finner jeg at resultatene er mer forutsigbare, og jeg liker det faktum at et større VOLUM DNA kan legges til hvis konsentrasjonen er for lav. DU kan ikke øke VOLUMET AV DNA med elektroporasjon på grunn av risikoen for å legge for mye salt til løsningen. Selv om den ofte nevnte ulempen ved kjemisk transformasjon er dens lavere effektivitet, kan du nå kjøpe ultra-kompetente celler, for eksempel Stratagene XL10-gull, så dette er ikke lenger så mye av et problem.

Artikler i denne serien:

• E. coli Electroporation vs Kjemisk Transformasjon (denne artikkelen)
• Kompetent E. coli: Å Kjøpe eller Ikke Å Kjøpe ?
• Velge En Kompetent E. coli Stamme

opprinnelig publisert 18.September 2007. Revidert og oppdatert 11. juli 2016.