Bidratt Av Paul Barber
DNA Extraction via Chelex
Chelex er beryktet for å være så ustadig som det er billig og enkelt. Her er noen tips for gode forsterkninger: 1. Noen ganger prøverarbeid best hvis det brukes umiddelbart, noen ganger er det bedre å vente over natten før du bruker dem. Eksperimenter og finn ut hva som fungerer for din art. Resultatene kan variere etter taxa.2. Når du gjør første PCRs, gjør du en seriell fortynning av mal.Mengden Av En Chelex DNA-ekstraksjon brukt I EN PCR kan være så høy som halvparten AV VOLUMET AV PCR eller så lavt som 1 mikroliter av en 1: 10.000 fortynning. Jeg finner at 1 microliter av en 1: 1 er bra for de fleste applikasjoner.3. Hvis DU ikke får forsterkninger fra PCR første gang med En Chelex ekstrakt, gjenta vortex, spin, inkubere, vortex, spin, sitte over natten prosedyre beskrevet ovenfor. Ofte vil dette gjøre et negativt PCR-arbeid.
metode¶
- steriliser en tørr reagensspatel og en liten magnetisk rørestang med Blekemiddel.
- Forbered en 5-10 vekt % slurry Av Chelex100 Harpiks (Biorad del 143- 3832,100-200 mesh Chelex, natrium form) OG UV sterilisert hplc vann. Den mest effektive måten å gjøre dette på er å ta et 50 ml sterilt falcon tube, plasser på en skala inne i et lite beger og null skalaen. Tilsett deretter 5 gram Chelex og fyll til 50 ml mark med vann.
Presisjon er ikke kritisk. Steril teknikk er.
- plasser steril stirbar i røret og plasser på magnetisk omrører. Chelex legger seg raskt, så hvis slammet ikke er godt blandet, vil konsentrasjonene og resultatene variere. Holde oppslemmingen godt blandet, aliquot 300-500micro liter i 0,6 eller 1,6 ml eppendorf rør (igjen, sterile) og cap umiddelbart. Hvis du har tilgang til en laminær strømningshette, er det et godt sted å gjøre alt dette. Det kan være lurt å tørke ned skalaen og omrører med en 10% blekemiddel løsning og / ELLER UV sterilisere før bruk.
- Slå på varmeblokk. Sett til 95°C. Fyll hull med vann.
- bruk sterile tang (Flamme over alkoholbrenner flere ganger for å sterilisere), fjern et lite stykke vev fra prøven. Dette stykke vev bør være stor nok til å være synlig, men ikke så stor som å være lett synlig. Tenk deg å kutte en 0,2 mm del av en standard stift. Dette er stort. For mye vev kan hemme dine reaksjoner.
Steriliser tang mellom prøver.
- når du er ferdig, gjør en negativ Chelex kontroll ved å dyppe steriliserte tang i et rør Av Chelex slurry.
- Virvelprøve og chelex slurry i 10-15 sekunder.
Pass på at lokkene er festet tett før du begynner.
- Spinnprøver kort ved høy hastighet i en mikrocentrifuge
- Inkuber prøver i 20 minutter ved 95°C
* blokktemperaturen kan falle litt når du gjør dette trinnet. Denne dråpen er normal. Kontroller rørene mens du inkuberer for å sikre at dekslene ikke har kommet av.*
- Vortex prøver igjen i 10-15 sekunder.
Forsiktig som damp kan pop lokket av sentrifugerøret. Hold lokkene nede.
- Spinn rør igjen med høy hastighet i mikrocentrifuge.
- Prøver er klare til bruk.
bruk bare supernate FOR PCR-reaksjoner. Chlex perle vil inaktivere Taq!
denne metoden er basert, med tillatelse, på en original protokoll tilgjengelig her.
