Systemisk agonistisk kreft immunterapi induserer differensiell utvidelse AV CD4 OG CD8 t-lymfocytter i lymfoide og perifere organer

Kombinasjon av ANTI-CD40 med IL-2 har vist seg å indusere forsinket vekst og regresjon på tvers av flere murine tumormodeller . I likhet med publiserte data ved bruk av cellelinjetumormodeller , førte behandling av mammary intraepitelial neoplasia-outgrowth (MIN-O)-modellen, en vevstransplantasjonslinje, med anti-CD40 og IL-2 immunterapi (IT) til signifikante antitumorresponser (P = 0,0057) inkludert regresjon i>50% av de behandlede musene (Tilleggsfil 1: Figur S1A). Tidligere studier har vist at disse antitumorresponsene skyldes CD8 T-celler, derfor vurderte Vi T – cellefenotype i milten så vel som i svulsten og lungene (et vanlig metastatisk sted for mange forskjellige tumormodeller). Mens vi bemerket terapi generelt indusert CD8 ekspansjon på tvers av alle organer, vi bemerket noen forskjeller I CD8 t celle minne fenotype på tvers av organsider (Tilleggsfil 1: Figur S1B-C).Vi og andre har tidligere vist at sterke immunstimulerende behandlinger for kreft induserer potent spredning av minne (CD44high) CD4 OG CD8 T-celler i milt og lymfeknuter . DET ble også observert AT CD4, MEN IKKE CD8, T-celler også gjennomgår aktiveringsindusert celledød i en interferon(IFN)-γ avhengig mote som resulterer i ubetydelig total utvidelse AV CD4 T-celler med tall i de samme organene sammenlignet med baseline . Disse dataene ble generert ved hjelp av lymfoide organavlesninger. I lys av fenotyper observert I MIN-o-lageret, immunterapi-behandlede mus, kan imidlertid utvidelse, aktivering og apoptose av aktiverte T-celler påvirkes differensielt i perifert vev. Derfor søkte vi å ytterligere karakterisere Og sammenligne t-celleaktivering i perifere organer (hvor primærtumor og / eller metastaserende lesjoner kan ligge) og sekundære lymfoide organer (som ofte undersøkes under immunoterapeutiske studier for å vurdere virkningsmekanismer). VI evaluerte CD8 OG CD4 T-celle (Foxp3neg) frekvens, ekspansjon og apoptose systemisk i både lymfoide og perifere organer. I samsvar med tidligere rapporter fra vår gruppe, mens de ikke signifikant endrer sin generelle frekvens (Fig. 1a), resulterte anti-CD40 / IL-2 immunterapi i signifikant ekspansjon i totalt ANTALL CD8 T-celler i milt og lymfeknuter (Fig. 1b). I tråd med økning i TOTALT CD8-tall ble frekvensen AV CD8 T-celler som inkorporerte bromodeoksyuridin (BrdU) in vivo signifikant utvidet, og andelen apoptotiske celler vurdert ved ekstracellulær Anneksin V-uttrykk var ikke signifikant forskjellig fra kontroller (Fig C-D). I motsetning til dette ble TOTAL CD4 t-cellefrekvens redusert og tallene endret seg ikke signifikant sammenlignet med kontroller innenfor de samme organene (Fig. 1a-b). MENS CD4 T-celler ekspanderte som vurdert Ved brdu-inkorporering, gikk en betydelig andel av dem også gjennom apoptose (Fig. 1c-d) som resulterer i en netto ubetydelig endring i totalt antall. Disse dataene var i tråd med det som tidligere ble observert . Når VI vurderte ikke-lymfoide organer, inkludert lunger og lever, så vi lignende trender i BÅDE CD4 OG CD8 T-celler, nemlig AT CD8 T-celler ekspanderte og overlevde på tvers av alle organer som fulgte DEN (Fig. 2a-b) MENS CD4 T-celler (Foxp3neg) ekspanderte og samtidig gikk gjennom apoptose i samme grad som resulterte i ubetydelige endringer i både frekvenser og tall (Fig. 2c-d) i periferien.

T-celleminnefenotyper varierer mellom sekundære lymfoide organer og perifere ikke-lymfoide vev I CD8 T-celler, men IKKE CD4 T-celler som følger den

HOS mus KAN CD4-og CD8 t-celler videre kategoriseres i minne og naï fenotyper basert PÅ CD62L (L-selektin) OG CD44-uttrykk med cd44lowcd62l+ – populasjonen anses som naï (tn), cd44highcd62l+ – populasjonen anses som sentralt minne (tcm), og cd44highcd62lneg-populasjonen anses som effektor og/eller effektorminne (te / EM). DET er kjent AT CD4 OG CD8 t-celler varierer i fordelingen av disse undergruppene i lymfoide og perifere organer. Mens naï frekvenser INNENFOR CD4 og CD8 populasjoner forblir relativt like, Er CD44high populasjonen mer sentralt minne skjevt I CD8 T-celler og effektorminnet skjevt I CD4 T-celler i en hvilende organisme . I perifere organer er imidlertid T-celler i BÅDE CD4-og CD8-celledelene hovedsakelig av effektorminne-fenotypen .

Tidligere studier har vist at minnefenotypeceller (CD44high) er den viktigste celletypen som ekspanderer etter stimulerende immunterapi . For bedre å forstå sammensetningen AV CD4 OG CD8 t-celler på tvers av ulike organer, evaluerte vi deres minnefenotypestatus i hvert organ som fulgte den. I ro var Cd44høy populasjon AV CD8 T-celler i lymfoide organer hovedsakelig TCM (> 90%), mens i perifere organer var det en kombinasjon med ~60% TCM (Fig . 3a, c, e, – f). Generelt resulterer det i en generell utvidelse I Cd44høy frekvens på tvers av alle organer. Tcm-frekvensene var enten uendret eller noe økt, MENS te / EM-populasjonene betydelig utvidet (Fig. 3e-f) fra ~10% til 30% i lymfoide organer og imponerende fra ~30-85% i perifere organer.

I Cd44høy populasjon AV CD4 T-celler var hvilende mus mer tungt skjev mot te / EM-fenotypen med omtrent 60-70% i lymfoid og 75-95% i perifert vev (Fig. 3b, d). Som skjedde I CD8 T-celler, etter Det Cd44h Høy andel utvidet, men på grunn av det faktum at det var så tungt skjev TIL te/EM fenotype over alle organer i hvile mus, frekvensene AV CD4 TE/EM var i stor grad konsistent på tvers av alle organer I IT-behandlede mus (Fig. 3e). Tcm CD4-frekvensene forblir relativt lave og konsistente på tvers av alle organer, både før OG etter DET (Fig. 3f).

Ekspresjon av aktiveringsmarkører I CD4-og CD8-t-celler er avhengig av plassering og minnefenotype

i tillegg til forskjeller i proliferasjon og apoptose, har vi også rutinemessig lagt merke til AT CD4-og CD8-t-celler forskjellig oppregulerer aktiverings-og hemmende molekyler som følger DEN. DET mest bemerkelsesverdige eksempelet på DETTE er PD-1, som, basert på studier med fokus på sekundære lymfoide organer (milt og LN), fortrinnsvis ble oppregulert PÅ CD4 og IKKE CD8 T-celler og antatt å være involvert i fortrinnsrett aicd-prosessen som skjedde I CD4, men IKKE CD8 T-celler som fulgte DEN . Et annet eksempel ville være fortrinnsrett oppregulering AV NKG2D PÅ CD8 T-celler, men IKKE CD4 overdragelse tilskuer-indusert lytisk evne etter sterk cytokin eksponering FOR MINNET CD8 undergruppe. Tidligere studier av vårt laboratorium samt data presentert I Fig. 3 har vist at BLANT BÅDE CD4 OG CD8 T-celler, er de primære cellene som aktivt sprer SEG og reagerer PÅ Det, cd44high memory phenotype cells . Derfor, vi neste fokusert på denne befolkningen.

I CD44high-populasjonen har det vist seg at de prolifererende CD8 T-cellene ikke klarer å oppregulere markører i samsvar med aktivering av en antigen-spesifikk stimulus som CD25 og PD-1, men oppregulere markører som tillater dem å skaffe seg en tilskuer fenotype, nemlig NKG2D, som gir muligheten til å handle mer på en NK-lignende, antigen ubegrenset måte. Omvendt, CD44high, prolifererende (Foxp3neg) CD4 T-celler uforholdsmessig oppregulere PD-1 (i motsetning TIL CD8 T-celler og Foxp3+, regulatoriske CD4 T-celler) som vi har foreslått tillater dem å være fortrinnsvis målrettet for induksjon av apoptose . I samsvar med disse tidligere rapportene observerte vi lignende fenotyper blant milt-og lymfeknutebeboende, IT-behandlede CD44highCD8 + T-celler, som signifikant oppregulerte NKG2D, men IKKE PD-1 (Fig . 4a, c) og CD44highCD4+ t-celler, som robust oppregulerte PD-1, men ikke NKG2D (Fig. 4b, d). Når Vi vurderte de samme fenotypiske markørene i t-cellepopulasjonene bosatt i perifere, ikke-lymfoide organer, Var CD44highCD8+ t-cellefenotypen betydelig forskjellig fra de som var bosatt i sekundære lymfoide organer. Mens CD44highCD8 + t-celler bosatt i lungene og leveren fortsatt var Nkg2d + CD25neg (Fig. 4a, c), syntes frekvensen AV nkg2d+ – celler i denne populasjonen å øke fra 20-30% i lymfoide organer til 40-50% i perifere organer (Fig. 4a). I motsetning til lymfoide organer hvor pd-1-uttrykket var uendret, økte PD-1-uttrykket signifikant i både lungene og leveren etter Det I CD44highCD8+ – populasjonen (Fig. 4c). Omvendt Var CD44highCD4 t-cellefenotype bemerkelsesverdig lik milt OG lymfeknute CD4 T-celler over alle organer (Fig. 4b, d) med sammenlignbare uttrykk FOR PD-1, og minimal oppregulering AV NKG2D. CD25 ble ikke oppregulert I CD4 ELLER CD8 T-celler på noe sted (data ikke vist). Dette var uventet fordi vi tidligere har antydet at differensial ekspresjon AV PD – 1 sannsynligvis var den underliggende mekanismen for differensial induksjon av apoptose MELLOM CD4 OG CD8 T-celler etter sterke, immunstimulerende it-regimer. LIKEVEL, I perifere organer, FORTSETTER CD4 T-celler å være uforholdsmessig påvirket av apoptose til tross for AT pd-1-uttrykket er sammenlignbart MELLOM CD4 OG CD8 T-celler. Dette mønsteret som dukket opp var også interessant fordi økt aktivering markør uttrykk i periferien syntes å direkte korrelere MED te / EM overvekt, spesielt I TILFELLE AV PD-1.

det har nylig blitt vist at sirkulerende te / EM-celler uttrykker forhøyede nivåer av pd-1 I Hvilende mennesker . DERFOR antydet VI AT CD8 + TE / EM-celler fortrinnsvis kan uttrykke disse aktiveringsmarkørene over CD8 + TCM, noe som resulterer i differensielle frekvenser Av CD44highCD8+ T-celler som uttrykker aktiveringsmarkører i sekundære lymfoide og perifere organer etter DEN. Derfor evaluerte VI nkg2d-og PD-1-uttrykk PÅ CD8 + CD44highCD25neg TE / EM og TCM-celler på tvers av alle organer i hvilende OG IT-behandlede mus. I kontrollmus, både NKG2D (Fig. 5a) OG PD-1 (Fig. 5c) ble uttrykt med en høyere frekvens på te / EM-undergruppen AV CD8 + CD44highCD25-populasjonen. Imidlertid er den totale frekvensen AV te / EM-populasjonen blant CD8 + T-celler i hvilende mus relativt lav sammenlignet MED TCM (kakediagrammer Fig . 5a) er derfor generelt uttrykket FOR BÅDE PD-1 og NKG2D overveiende lavt (Fig. 4) SOM TCM utgjør flertallet AV CD8 + T-celler i ro. I de immunterapibehandlede musene ble både NKG2D-og PD-1-ekspresjonen økt på tvers av alle organer (Fig. 4). Igjen, både NKG2D (Fig. 5b) OG PD-1 (Fig. 5d) ble uttrykt mer høyt PÅ TE / EM CD8 + T-cellene enn TCM CD8 + T-cellene. I lymfoide organer, hvor te / EM-populasjonen utvidet seg sammenlignet med kontroll, var den fortsatt signifikant mindre ENN CD8 + TCM-celler (kakediagrammer, Fig. 5b) som resulterer i mindre betydelige utvidelser på disse nettstedene. I motsetning til lymfoide organer utgjorde CD8+ TE/EM-celler størstedelen av de perifere organene som ble analysert (kakediagrammer, Fig. 5b) gjør dermed det generelle uttrykket FOR NKG2D og PD-1 betydelig høyere på disse nettstedene. Igjen er det viktig å merke seg at i lymfoide organer av immunterapi-behandlede mus var det generelle uttrykket for begge aktiveringsmarkører signifikant lavere enn i perifere organer på grunn AV tcm-skjevhet i lymfatene over periferien i CD8-populasjonen. Uttrykksnivåene varierte ikke sterkt mellom TE / EM fra forskjellige organer (det var ingen signifikante forskjeller mellom lymfoide og perifere organer) innenfor de samme behandlingsgruppene, men økte generelt I IT-behandlet sammenlignet med kontroll, en trend som var mer signifikant uttalt med NKG2D enn PD-1 (Fig. 5). I kontrast forblir tcm-aktiveringsmarkøruttrykk relativt konstant, ikke bare blant organer fra mus i en behandlingsgruppe, men også mellom kontroll-og IT-behandlede grupper (Fig. 5a-b). Samlet sett tyder disse dataene på at konstitueringen av minnet / aktivert basseng (TCM vs TE/EM) veier tungt på fenotypen av den aktiverte t-cellepopulasjonen, spesielt MED CD8 T-celler, da deres konstitusjon varierer sterkt mellom lymfoide og ikke-lymfoide organer.

Vurdering av t-celler fra pasienter som får systemisk immunstimulerende behandling med høy dose / h3>

neste vi ønsket å vurdere om disse resultatene oversatt til humane pasienter som får immunstimulerende behandling for kreft. Det er for tiden ingen studier som vurderer kombinasjonsagonistisk ANTI-CD40 med rekombinant HUMAN IL-2, men vi har rutinemessig sammenlignet vår kombinasjonsbehandling med andre systemiske immunstimulerende behandlinger, inkludert HØYDOSE TLR-agonister og høye doser systemisk cytokinbehandling, og vist lignende fenotypiske og funksjonelle endringer I T-celler som er observert i vår prekliniske modell . For å vurdere om pasienter i klinikken viste lignende endringer i overflatemarkøruttrykk, samlet vi perifere blodmononukleære celler (PBMCs) fra metastaserende melanompasienter som gjennomgikk systemisk HØYDOSE IL-2-behandling. Pasientene fikk 6×10 ^ 5 IE/Kg hver 8.time for en planlagt total dose på 14 doser. PBMC-prøver ble samlet inn en dag før behandlingsstart (baseline) eller på dag 8 i den første behandlingssyklusen (dag 8) for å vurdere T – cellefenotype. Sammenligning av prøver ved baseline og dag 8 var det en signifikant økning I PD – 1 + – minnefenotype (CD45RO+) – celler i BÅDE CD4-og CD8 t-celledelene etter HØYDOSE IL-2-behandling (Fig . 6a-c). Når denne populasjonen videre ble brutt ned i sentralt minne (CD62L+) og effektor / effektorminne (CD62L-) på dag 8-tidspunktet, uttrykte effektor / effektorminne-delsettet signifikant høyere pd-1-uttrykk enn det sentrale minnet (Fig . 6d-e). Sammen korrelerer disse dataene med det som ble observert i murine studier som tyder på at disse dataene gjelder for menneskelige studier og kan være en indikator på hva som skjer lokalt.