iv xmlns: xhtml=» http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1. Økt Cdc42-aktivitet i løpet av naturlig aldring hos mus og effekten Av Cdc42GAP – genmålretting på vekst, beinstruktur, levetid og fertilitetsperiode hos voksne mus. (A) Normal aldring hos mus er forbundet med økt Cdc42-aktivitet. (Venstre) Cdc42-GTP-nivåene av ulike vev fra unge (2 måneder gamle), middelaldrende (12 måneder gamle) og eldre (24 måneder gamle) mus ble undersøkt AV GST-PAK1 effektor domene nedtrekksanalyser. En representativ blot fra to eksperimenter er vist med densitometri kvantifiseringer. (Høyre) Cdc42-GTP nivåer av forskjellige vev fra 1.5 måneder gamle (Unge) OG 26 måneder gamle (Gamle) wt-mus ble undersøkt av effektor-nedtrekksanalysen. Kvantifiseringene ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. (B) ulike organer fra 8 måneder gamle mus ble lysert med sonikering. Lysatene ble utsatt FOR NEDTREKK AV gst-PAK1-effektor, og de bundne proteinene ble immunoblottet av et monoklonalt anti-Cdc42-antistoff. Ett sett med data fra to gjentatte eksperimenter er vist. De understrekende tallene indikerer relativ Cdc42-GTP kvantifisert ved densitometri-skanning. (C) Kroppsvekt på 20 mus i hver gruppe (Cdc42GAP+/+, Cdc42GAP+/− og Cdc42GAP−/−) spores med økende alder. (D) Overlevelseskurver av 16 kontroll (Cdc42GAP+ / + Og Cdc42GAP+/−) og 21 Cdc42GAP−/ – mus. Median levetid var henholdsvis 12 og 27 måneder for Cdc42GAP−/− og kontrollmus. (E) Fotografier av representative 12 måneder gamle live Cdc42GAP+ / + og Cdc42GAP−/− hanner. Cdc42GAP – / – musen viser redusert størrelse og alvorlig lordokyphosis. (F) Røntgenbilder av representative 15 måneder gamle hannmus som viser skjelettforandringer med alvorlig lordokyfose i Cdc42GAP – / – mus. G) Forsinket, redusert og forkortet reproduksjonsperiode hos Cdc42GAP – / – hunnmus.For å avgjøre om Den økte Cdc42-aktiviteten forbundet med naturlig aldring kan ha fysiologisk relevans, undersøkte Vi Cdc42 negativ regulator, Cdc42GAP, i genmålrettede mus etter at de har nådd voksen alder. Tidligere studier av homozygote Cdc42GAP knockout mus i perinatal perioden indikerte at ulike vev / celler inneholdt forhøyet Cdc42-GTP, og embryoer / nyfødte unger Av Cdc42GAP – / – genotypen viste redusert organ / organismestørrelse som er relatert til økt spontan apoptose i ulike celletyper (6). Hos Voksne Cdc42GAP−/− mus var Cdc42-aktiviteten konstitutivt høyere i flere vevs – / celletyper enn HOS de samsvarende wt-musene, mens Nivået Av RhoA-GTP eller Rac1-GTP forble likt NIVÅET AV WT (Fig. 1b; data ikke vist), noe som tyder på en spesifikk gain-Of-Cdc42 aktivitet hos voksne dyr som ligner på den i perinatal perioden. Flertallet Av Cdc42GAP – / – mus døde i nyfødtperioden på grunn av deres mindre størrelse og svake kroppsbygning (6). En andel av dem (≈7%) kunne imidlertid overleve nyfødtperioden under fosterhjem av ikke-relaterte pleiende kvinner. Til tross for vanlig melkeinntak og normale serumglukose – og insulinkonsentrasjoner funnet hos homozygote mus i postnatalperioden, begynte vektøkning På Cdc42GAP−/− mus å avta ved ≈3 måneders alder sammenlignet med ≈5 måneders alder for WT-eller heterozygote mus, og de modne homozygotene var ≈30% redusert i kroppsvekt på grunn av en reduksjon i total cellularitet (Fig. 1 C og data ikke vist). Median levetid For Cdc42GAP – / – musene var ≈12 måneder, mens kontrollmusene (WT eller heterozygote) forble vitale inntil en median alder på ≈27 måneder (Fig . 1 D). Overlevelseskurven til de homozygote musene er noe forskjellig fra den typiske gompertz-kurven, men ligner den som er rapportert For BubR1 (en mitotisk kontrollpunktregulator) knockout (10) eller p44 (en kort isoform av p53 tumor suppressor) transgene (11) dyr. Kyphos og mangel på kraft hos Cdc42GAP−/− mus ble tydelig ved en alder av ≈12 måneder (Fig. 1 E). Flådd Cdc42GAP – / – mus ved 15 måneders alder viste en klar reduksjon i kroppsmasse, et betydelig tap av subdermalt fettvev, alvorlig lordokyfose og muskelatrofi (data ikke vist). En røntgenundersøkelse viste en signifikant kyphos fenotype og redusert benmineraltetthet (BMD)Hos Cdc42GAP – / – mus i en alder av 15 måneder (Fig . 1 F). Ytterligere kvantifisering av dissekerte bein Av Cdc42GAP−/− mus viste 3-og 2,6-ganger reduksjon AV BMD i henholdsvis tibia og femur (Si Fig. 7). I tillegg mistet Både Mannlige Og kvinnelige Cdc42GAP−/− mus fruktbarhet i en tidligere alder sammenlignet med WT. I parring Mellom Cdc42GAP−/− kvinner og WT-menn ble homozygotene ufruktbare ved 26 uker gamle sammenlignet med 48 uker gamle FOR WT (Fig. 1 G). Disse observasjonene indikerer At Cdc42GAP-mangel resulterer i konstitutivt forhøyet Cdc42-GTP-nivå, redusert kroppsstørrelse, tidlig kyphos, redusert BMD, forkortet fertilitetsperiode og redusert levetid hos voksne mus.

H &e fargede seksjoner gjennom den 8 måneder gamle kvinnelige musens vertebrale kropp viste At Cdc42GAP – / – musene hadde en tynnere, bøyd cortex og tynnere trabeculae sammenlignet med WT-mus (Fig . 2 A). Tilsvarende viste lengdegradsseksjonene av lårbenet til de homozygote musene en reduksjon av kortikal bein tykkelse sammenlignet med WT-mus (data ikke vist). Disse observasjonene er i samsvar med brutto utseende og kliniske trekk ved osteoporose. Milten, leveren og nyrene til voksne Cdc42GAP−/− mus ble redusert i masse på grunn av en reduksjon i total cellularitet, noe som var tydelig i H &e-fargede deler av milten, og t-og b-celleholdige hvite pulpregioner av 12 måneder Gamle Cdc42GAP-/− milt ble markert redusert sammenlignet med de av aldersmatchede wt− mus (Fig. 2 B og data ikke vist), noe som tyder på uttalt lymfoid atrofi i homozygoter. I samsvar med den tilsynelatende reduksjonen av subdermal fettvev viste histologisk analyse av tverrsnittene av dorsal hud et nesten fullstendig fravær av s. c. adipose celler i 9 måneder Gamle Cdc42GAP – / – mus − Fig . 2 C). Et tap i muskelmasse og muskelatrofi ble også bekreftet ved undersøkelsen av H & e-farget skjelettmuskelseksjoner fra 12 måneder Gamle Cdc42GAP- / -mus og aldersmatchede wt− mus (Fig. 2 C). Cdc42GAP – / – musene viste også markert reduksjon i hårregenerering etter fjerning av dorsalt hår ved barbering, mens alders – og kjønnstilpasset WT viste robust hårgenvekst (SI Fig. 8). Evnen til å tåle påkjenninger, som sårheling, en aldringsassosiert aktivitet (12) Av Cdc42GAP-/− mus, ble signifikant redusert sammenlignet med WT (Fig. 2 D). Histopatologisk analyse av sårseksjonene viste liten reepithelialisering i sårkanten Av Cdc42GAP – / – mus, mens fullstendig reepithelialisering av wt-mus var tydelig 4 dager etter at såret ble introdusert (Fig . 2 E). I tillegg til disse observasjonene var en rekke hematopoietiske fenotyper av de homozygote musene, inkludert anemi, redusert milt-og benmargcellulariteter, defekter av hematopoietisk stamcelle engraftment til beinmarg og økt følsomhet av hematopoietiske stamceller til indusert mobilisering (13, 14) i samsvar med tidlig aldring i hematopoietisk system. Det er viktig at en undersøkelse av unge homozygote mus (<4 måneder gammel) før manifestasjonen av åpenbare fenotyper viste ingen store abnormiteter i bein, hud og milt (SI Fig . 9 A Og B og data ikke vist), noe som tyder på at de aldringslignende fenotypene Til Cdc42GAP – / – musene ikke skyldes en tidlig utviklingsforstyrrelse. Videre kan en rekke fenotyper av homozygote mus, inkludert redusert kortikal ben tykkelse, kyfose, og tap av muskelmasse og epidermal vev, finnes i den gamle (>2,5 år gammel) WT mus (SI Fig. 9 C og D og data ikke vist). Som oppsummert I Si Tabell 1, samlet gir disse resultatene sterke bevis på At Cdc42GAP-mangel forårsaker for tidlig aldringslignende fenotyper hos dyrene.

Farging av vev hos 9 måneder gamle voksne, inkludert lever, nyre og milt, for senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) viste en sterk aktivitet av denne senescensmarkøren i homozygote mus som ikke var påviselig i vev av alder – og kjønnstilpasset WT-mus (Fig. 3 A Og Si Fig. 10), som indikerer At Cdc42GAP – / – voksent vev kan gjennomgå for tidlig senescens. Interessant nok var økt apoptose av homozygote vev observert i perinatal perioden fraværende hos voksne homozygoter da den forhøyede sa-β-gal-aktiviteten var tydelig (ref. 6 og data ikke vist). Cdc42GAP – / – musembryonale fibroblastceller (MEF), som inneholder ≈3 ganger høyere Cdc42-GTP, men normalt Rac1-GTP-eller RhoA-Gtp-innhold sammenlignet med wt MEF-celler (6), viste signifikant økt SA-β-gal-aktivitet og akkumulert en flat og forstørret senescent morfologi som begynte ved passasje 6 når WT MEF-celler var negative FOR SA-β-gal-aktivitet og var kontraktsmessig i morfologi (Fig. 3 B Og Si Fig. 11). Cdc42GAP – / – MEF-cellene begynte å avta i vekst ved passasjer 5-7 da de matchede wt MEF-cellene vokste eksponentielt (Fig . 3 C) (6), og de gjennomgikk massiv replikativ senescens etter passasje 7, mens de fleste wt MEF-celler ikke nådde senescens til passasje 13 (SI Fig . 11 og data ikke vist). I tillegg dannet en betydelig høyere prosentandel Av Cdc42GAP−/− MEF-celler ved passasje 7 større foci i kjernen enn WT-celler(SI Fig . 12). Disse resultatene indikerer At Cdc42GAP-mangel induserer tidlig vev / celle senescens.

en velkjent medvirkende faktor til pattedyrs for tidlig aldring og cellesensens er økt genomisk ustabilitet (15). Metafasespredningsanalyse viste at>30% primære splenocytter fra 8 måneder gamle homozygote mus var aneuploide, mens alders-og kjønnsmatchede wt-splenocytter ikke hadde noen påviselig aneuploidi (Fig. 3 D), noe som indikerer At Cdc42GAP – / – vevet led av genomisk ustabilitet. Til støtte for dette funnet Viste Cdc42GAP−/− MEF-celler en signifikant økning av doble kjerneceller under dapi-farging sammenlignet MED wt-celler ved passasje 7 (SI Fig . 12). Karyotypeanalyse av SENERE passasjer AV MEF-celler (passasje 6-7) viste videre at selv om de fleste kromosomer fra wt− celler (≈80%) forblir intakte, inneholdt 42% Av Cdc42GAP−/ – celler minst ett kromosomavvik, 20% inneholdt to eller flere avvik, og 14% inneholdt tre eller flere avvik(Fig . 3 E). Prosentandelen og graden av aneuploidi økte også signifikant i Cdc42GAP – / – MEF-celler, med > 32% av cellene som viste unormale kromosomtall fra 72 til 102, mens de fleste wt-celler var diploide (Fig. 3 E Og Si Fig. 13). Karyotypeanalyse av kromosomskader indikerer at avvikene i de homozygote mef-cellene var forskjellige, inkludert kromatidbrudd, for tidlig søsterkromatidseparasjon (et kjennetegn ved et defekt spindelmonteringspunkt), translokasjon, kromosombrudd, dicentrisk kromosom og kromosomfragmentering(Fig. 3 F Og Si Tabell 2), noe som tyder PÅ AT DNA-skadereparasjonsmaskineriet er kompromittert I Cdc42GAP – / – celler. Immunfluorescensfarging av fosfo-H2 AX i cellekjernen, EN DNA-skaderesponsmarkør (16), viser at selv om 10% av passasjen 7 Cdc42GAP – / – MEF-celler var positive for DNA-skademarkøren, <1% AV wt-cellene var positive (Fig. 3 G). Korrelasjonen mellom debut og progresjon av de aldringslignende fenotypene Til Cdc42GAP – / – mus og observert grad og alvorlighetsgrad av genomiske avvik i Cdc42GAP – / – celler støtter En Rolle Cdc42 spiller i utviklingen av progeroide trekk.For å bestemme den mulige mekanismen for de akkumulerte DNA-skader I Cdc42GAP – / – celler, sammenlignet vi NIVÅET av ENDOGENE reaktive oksygenarter (ROS) av de homozygote cellene med WT-celler, Fordi Rac1 og Rac2, to nært beslektede Rho Gtpaser, er kjente regulatorer av cellulær ROS (17). Si Fig. 14 viser At Cdc42GAP – / – celler viste EN ROS-aktivitet som ligner PÅ wt-celler, noe som indikerer At Cdc42GAP regulerer genomisk stabilitet gjennom en endogen ROS-uavhengig mekanisme. På grunn av likhetene mellom Flere Cdc42GAP – / – mus fenotyper til de av en rekke genmålrettede musemodeller AV DNA – skadereparasjonsmolekyler, inkludert Brca1−/ – p53+/ -, Ku80 – / −og Mtr−/ – Wrn-musemodeller (12, 18, 19), undersøkte vi videre responsen til De tidlige passaged Cdc42GAP−/− cellene til forskjellige DNA-skademidler. I DNA damage response growth assay viste Cdc42GAP-mangelfulle celler en bred defekt AV DNA – skadereparasjonsaktivitet (Fig. 4), som manifesterte seg som signifikant høyere prosenter av celledød blant de homozygote cellene sammenlignet med wt-celler etter behandling ved å øke doser AV H 2O2, ioniserende bestråling, camptothecin, metylmetansulfonat eller mitomycin C. dermed kan de akkumulerte forskjellige genomiske abnormiteter som finnes i De senere passasjer Av Cdc42GAP – / – celler, tilskrives, i det minste delvis, til nedsatt DNA – skadereparasjonsaktiviteter.

en konsekvens av vedvarende genomisk skade i cellene er induksjon av flere DNA-skade-respons og / eller senescensgener (20, 21). Uttrykkene for p53, p21Cip1, p16Ink4a og fosfo-p53 (Ser− 15) I Cdc42GAP−/ – MEF-celler var signifikant høyere enn FOR WT MEF-celler etter lignende passasjer, mens p19ARF i de homozygote cellene viste en lignende trend med økning med passasjer, som WT-cellene(Fig . 5 A). Proteinnivåene av p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) og dna-skademarkøren phospho− H2 AX i Cdc42GAP−/-vev fra 8 måneder gamle mus var også signifikant høyere enn i tilsvarende vev hos matchet WT-mus (Fig. 5 B). Disse resultatene gir bevis for at aktivering av p53-regulert vei, spesielt p21Cip1 og p16Ink4a, er assosiert Med Cdc42GAP-mangelindusert tidlig senescens. For å undersøke spørsmålet om forhøyet Cdc42-aktivitet I Cdc42GAP-mangelfulle celler er tilstrekkelig til å redegjøre for tidlig senescens fenotype, uttrykte vi en aktiverende mutant Av Cdc42, Cdc42F28L, i primære wt MEF-celler og analysert FOR sa-β-gal aktivitet av cellene i sammenligning MED at av matchende EGFP-uttrykke celler ved forskjellige passasjer. Cdc42F28L-uttrykk forårsaket en signifikant økning I SA-β-gal-positiv cellepopulasjon (35% I Cdc42F28L-celler sammenlignet med 7% I EGFP-ekspresjonsceller)i tidlige passerte MEF-celler (Fig . 5 C), som indikerer At Cdc42 aktivering er tilstrekkelig for induksjon av tidlig celle senescens.