Abstrakt

Bakgrunn. Ekspresjon av menneskelig CD133 (human prominin-1) i kreftceller har blitt postulert å være en markør for stemness og regnes som en antatt markør for kreftstamceller (CSCs). Vi designet en studie for å beskrive uttrykksmønsteret TIL CD133 i normal hud og i epiteliale kutane neoplasmer. Metoder. CD133 immunhistokjemisk uttrykk for førtitre eccrine og apocrine svulster ble sammenlignet med det som ble observert i andre epiteliale svulster i huden. I tillegg ble flowcytometri brukt til å oppdage CD133-ekspresjonen av fire epithelial hud-neoplasmer, inkludert en porokarsinom. Resultat. CD133 immunoreaktivitet ved den apikale eller apikolaterale overflaten av celler som danner kjertelstrukturer ble observert. Celler fra faste områder av godartede eller ondartede svulster ble ikke farget. Porokarsinom-avledede kulturceller viste 22% AV CD133-positive celler ved bruk av flowcytometri, mens plateepitelkarsinomkulturer inneholdt mindre enn 0,1%. Konklusjon. Disse observasjonene indikerer AT CD133 er en spesifikk markør for kjerteldifferensiering som kan inkluderes i det diagnostiske panelet av kutane svulster med mulig eccrine eller apokrine differensiering. BRUK AV CD133-uttrykk som markør For CSCs bør imidlertid tolkes med forsiktighet i hudforsøk.

1. Introduksjon

i de siste årene har det blitt rapportert en voksende mengde bevis som støtter forestillingen om at evnen til å opprettholde tumordannelse og vekst utelukkende ligger i en liten populasjon av celler som kalles kreftstamceller (cscs). Søk av markører som viser stamcellelignende fenotype av disse tumorinitierende cellene er et aktivt undersøkelsesområde, og flere stamcellemarkører er nylig beskrevet i hudtumorer .CD133 ER den menneskelige homologen til mus prominin-1, et fem transmembran-domene – celleoverflateglykoprotein som har fått bemerkelsesverdig oppmerksomhet på grunn av dets uttrykk begrenset til forskjellige somatiske stamcelle subpopulasjoner . Dette overflateantigen ble oppdaget som et mål for et monoklonalt antistoff definert som MAB AC133, en markør uttrykt av EN subpopulasjon AV CD34-positive hematopoietiske stamceller avledet fra humant føtal lever og benmarg . DERETTER BLE CD133 påvist i forskjellige humane normale vev, inkludert nyre, prostata, hjerne og bukspyttkjertel, og funnet å være spesielt assosiert med mikrovilli og andre plasmamembranfremspring . Videre har dette antigenet også blitt identifisert ved hematologiske maligniteter og i flere solide humane neoplasmer, inkludert glialtumorer, prostatakarsinom, nyrekarsinom, hepatokarsinom, kolorektalt karsinom og malignt melanom . Målet med mange av disse studiene var å bestemme eksistensen Av CSCs, definert som en liten gruppe kreftceller som har kapasitet til selvfornyelse, tumorinitiering og vedlikehold av tumorvekst. Antistoffer som rutinemessig brukes til rensing AV AC133-positive celler, retter seg mot dårlig karakteriserte glykosylerte epitoper med usikker spesifisitet. Selv om DEN funksjonelle aktiviteten TIL CD133 fortsatt er kontroversiell og dens fysiologiske funksjon ennå ikke er bestemt, blir det klart at dette celleoverflateproteinet er en unik markør for både plasmamembranfremspring og membranmikrodomener . DET har blitt foreslått AT CD133 i DENNE cellulære plasseringen kan fungere som en regulator av membranlipidsammensetning, eller det kan delta i mekanismene for cellepolaritet og migrasjon .

i tidligere studier som rapporterer CD133 immunhistokjemisk farging av menneskelig kjertelepitel, som spyttkjertler, lacrimalkirtler, bukspyttkjertelkanaler, endocervikale kjertler og svettekjertler, har et merkelig mønster AV CD133-uttrykk blitt beskrevet . I disse epitelene HAR CD133 vist seg å være lokalisert til plasmamembranfremspring i de apikale områdene av polariserte celler. Et LIGNENDE CD133 apikalt cytoplasmatisk fargemønster av celler som omgir et lumen har også blitt observert i karsinomer fra ovarie, kolon eller bukspyttkjertel .funnet AV CD133-antistofffarging svettekjertelceller ba oss om å designe en studie som vi nå rapporterer, for å evaluere uttrykket AV CD133 i hud eccrine og apokrine svulster.

2. Materialer og Metoder

2.1. Tilfeller

et retrospektivt søk hentet 43 tidligere diagnostiserte hud eccrine og apocrine adnexal svulster fra filene Til Institutt For Patologi På Albacete Universitetssykehus. Glassglass, parafinblokker og histopatologiske rapporter fra alle tilfellene ble oppnådd. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). Tilfeller av basalcellekarsinom () og plateepitelkarsinom () ble også inkludert i denne studien for å sammenligne resultatene oppnådd i disse neoplasmene med de som ble oppnådd i svettekjerteltumorer. FOR å evaluere CD133-uttrykket i normal hud analyserte vi hud fra forskjellige områder oppnådd fra margene av seks kirurgisk resekterte svulster i huden og fra tre obduksjoner.

for kultur av hudkreftceller ble det oppnådd syv prøver fra humane hudtumorer som korresponderte med en ekskrinporokarsinom og seks plateepitelkarsinomer. Friskt vev fra disse tilfellene ble inkludert i Dulbeccos Modified Eagle ‘ s medium (DMEM), supplert med penicillin/streptomycin og fungizon, umiddelbart etter kirurgisk reseksjon.

2.2. Immunhistokjemi

formalin faste, parafininnebygde vevsseksjoner 4 µ bred ble kuttet, deparaffinert i xylen og rehydrert i en gradert serie etanol. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% H2O2 i 5 minutter. Lysbilder ble behandlet med varmeindusert epitop henting og immunostained med tre forskjellige anti-CD133 monoklonale antistoffer: AC133 monoklonalt antistoff, 293c3 monoklonalt antistoff og AC141 monoklonalt antistoff (alle fra Miltenyi Biotec, Tyskland). Antistoffer ble testet ved forskjellige fortynninger og inkubasjonstider. CD133-deteksjon ble utført ved bruk AV ENVISION-SYSTEMET-HRP (Dako, Glostrup, Danmark) i En DakoCytomation Autostainer-plattform, i henhold til produsentens instruksjoner. Diaminobenzidin (Dab substrate system, Dako, Glostrup, Danmark) ble brukt som kromogen. Fra de tre forskjellige anti-CD133 antistoffene som ble testet, jobbet BARE ETT, AC133 monoklonalt antistoff, i paraffin. De andre to antistoffene som ble testet mislyktes fordi seksjoner inkubert med disse antistoffene viste ingen farging eller fordi immunostatingen observert når høye konsentrasjoner av antistoffene ble brukt, ble ansett som uspesifikk (lignende farging ble observert i negative kontroller). Ac133 monoklonalt antistoff ga pålitelige resultater på de testede parafininnbygde seksjonene. Vi etablerer for dette antistoffet en 1 : 10 fortynning og 40 minutters inkubasjon ved romtemperatur som de foretrukne arbeidsforholdene. Deretter ble alle forsøkene utført under disse forholdene.

Deler av huden med normale svettekjertler ble brukt som positive kontroller. I tillegg, når de er tilstede i seksjonene, ble normale svettekjertler fra huden ved siden av neoplasmaene brukt som interne positive kontroller. Negative kontroller ble utført ved å utelate ANTI-CD133-antistoffet under den primære antistoffinkubasjonen.

Immunhistokjemisk farging av faste områder og av akinære eller duktale strukturer fra svulstene ble evaluert separat. CD133 farging ble gradert ved hjelp av en semiquantitative skala. Acinar eller ductal strukturer ble vurdert som følger: ( – ) ingen flekker; ( + ) farging av sekretorisk materiale i lumen av isolerte kanaler eller acini og/eller svak farging av den apikale eller luminale grensen av få kanaler eller acini; ( ++ ) klar farging av den apikale eller luminale grensen til de fleste kanaler eller acini tilstede i svulsten; ( + + + ) farging av den apikale eller luminale grensen til alle kanaler eller acini tilstede i svulsten. CD133-uttrykket ble evaluert av to seniorpatologer (EP og SYNC) på blindet måte uten kunnskap om klinisk og patologisk informasjon. I tilfeller av avvikende vurderinger ble lysbildene revurdert av begge patologene under et multihodemikroskop, og en avtale ble oppnådd.

2.3. Kultur Av Kreftceller fra Hudtumorer

Tumorfragmenter ble mekanisk og enzymatisk disaggregert ved fordøyelse med kollagenase TYPE IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) i Hanks balanced salt solution (HBSS) ved 37°C i 2 timer. Cellene ble filtrert gjennom et 40 µ nylonnett og ble videre dissosiert ved seriell passasje gjennom serologiske pipetter. Fordøyd vev ble sentrifugert ved 1000 ×g i 10 min og pelleten vasket flere ganger for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Isolerte celler ble belagt i kulturkolber og dyrket ved 37°C i DMEM / F12 media som inneholdt 10% føtalt bovint serum og supplert med penicillin / streptomycin og fungizon.

2.4. Flowcytometrianalyse

alle forsøk ble utført på cellesuspensjoner fremstilt ved første passering av primærkultur fra tumorer. Cellene ble løsnet ved bruk av 0,02% EDTA i fosfatbufret saltvann (PBS)i 15 minutter ved 37°C og vasket MED PBS før farging. Cellesuspensjonene ble justert til celler / mL og inkubert med anbefalt antistofffortynning (1/10) i 20 minutter i mørket(4°C). Prøver uten primært antistoff ble brukt som negative kontroller. Antistoffet som ble brukt var anti-CD133 / 1 (AC133) – APC (Miltenyi Biotec). Ubundne antistoffer ble fjernet ved vask MED PBS, og celler ble resuspendert i et egnet volum buffer. Analysen ble utført PÅ ET LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Data ble analysert Ved Hjelp Av Summit V5.0. 1. 5170 programvare (Dako).

3. Resultater

3.1. Kliniske Funn

pasientkohorten besto av 29 menn og 23 kvinner i alderen 24 til 90 år (median, 49 år). Presentasjonsstedet var variabelt, de fleste av dem lokalisert på hodet og nakkeområdet. Kliniske data er oppsummert I Tabell 1. Alle pasientene gjennomgikk excisional hudbiopsi.

3.2. Immunhistokjemiske Funn

fra de tre forskjellige monoklonale antistoffene som ble testet på formalinfaste, parafininnebygde vevsseksjoner , og i samsvar med tidligere rapporter ga BARE AC133 sensitive og pålitelige resultater. Det totale immunhistokjemiske fargemønsteret observert med dette antistoffet var nært relatert til vevsarkitektur. Fargingen var hovedsakelig lokalisert til den apikale overflaten av celler som dannet duktale eller glandulære strukturer. Immunhistokjemiske funn observert i disse strukturene ved bruk av ANTI-CD133 antistoffet er oppsummert I Tabell 1 og er beskrevet nedenfor. Faste områder fra noen av de undersøkte adnexale svulstene eller fra basalcelle-og plateepitelkarsinomer som ble testet, viste IKKE CD133-positivitet.

3.2.1. Normalt Vev

CD133-ekspresjon ble observert ved endoluminal eller apikal overflate av cellene i acini og terminale kanaler av normale ekkrinkjertler (Figur 1 (a)). Intercellulære canaliculi dannet ved sidemembranen av eccrine celler som ligger i den sekretoriske del av normale svettekjertler ble tydelig farget (Figur 1(b)), Så vel som den sekresjon som finnes i lumen av eccrine kanaler. Farging av normale apokrine kjertler ved terminalkanalene ble observert ved cellens apikale kant, men med en ujevn fordeling. I acinarområder av disse kjertlene, hvor apokrine dekapitasjonssekresjonen var åpenbar, VISTE CD133 bare en svak eller negativ farging.

(a)

(a)
(b)

3.2.2. Svulster

CD133 ble ikke uttrykt i noen av de testede plateepitelkarsinomene eller basalcellekarsinomene. Ved HJELP AV ac133 antistoff adnexal svulster analysert i dette arbeidet viste følgende fargemønster (oppsummert I Tabell 1).

Godartede Svulster Med Eccrine Eller Apokrine Differensiering. Alle eccrine spiradenoma-tilfellene presenterte CD133 immunoreaktivitet ved den apikale membranen i de kanallignende strukturer som er tilstede i tumorknutene. Den luminale overflaten av epitelceller som danner unilokulære cyster av alle analyserte eccrine hidrocystom-tilfeller var også positiv. Kanaler og små cyster tilstede i tre av de seks eccrine poroma tilfeller viste intens farging av det indre cellelaget fra de prolifererte tubuli, og denne fargingen var plassert på endoluminal grensen av cellene. De andre tre poroma-tilfellene som ble analysert, viste det samme fargemønsteret i de fleste tubuli, men med ET ( ++ ) eller ( + ) fargemønster AV CD133-positivitet. Kanallignende strukturer, tilstede i de fire cylindroma-tilfellene, viste også immunoreaktivitet ved den apikale membranen i epitelceller. Fargingen av de fire chondroid syringomas var fremtredende, og alle ductules tilstede, som dannet sporadiske forgreningsstrukturer, viste intens positivitet ved den apikale membranen (Figur 2). Dilaterte og kronglete kanaler, som fører til cystisk plass i alle tilfeller av syringocystoadenoma papilliferum, viste immunoreaktivitet ved den apikale delen av epitelceller eller ved luminal overflaten av cyster, med en intensitet som varierte fra ( ++ ) til ( + + + ) (Figur 3). De fem tilfellene diagnostisert som nodulær hidradenoma viste isolerte kanallignende strukturer som var positive FOR CD133 med en apikal farging av cellene som dannet tubuli (Figur 4) som varierte i intensitet fra ( ++ ) til (+++). De to hidradenoma papilliferum tilfeller viste også uttrykk FOR CD133 på den apikale delen av kjertelstrukturer. Bare to av de seks syringom-tilfellene som ble testet, viste konsekvent farging på luminaloverflaten av de små kanalene som dannet svulstene, som vanligvis ble foret av to lag kubiske epitelceller. De apokrine hidrocystomtilfellene viste ingen positiv immunoreaktivitet.

Ondartede Svulster Med Eccrine Eller Apokrine Differensiering. Ingen immunoreaktivitet kunne påvises ved luminal overflaten av cystene i tilfelle diagnostisert som apokrin karsinom. De to mikrocystiske adnexale karsinomene som ble analysert i denne studien viste sterk CD133-positivitet ved den apikale overflaten av celler som dannet den lille og store lumina av de rørformede strukturer. CD133 immunostholdende kunne påvises ved de svært atypiske cellene som omgikk de rørformede strukturer av porokarsinom-tilfellet (Figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Karakterisering Av Primære Kulturer fra Humane Hudtumorer og Flowcytometrianalyse

Syv prøver avledet fra humane hudtumorer ble behandlet med det formål å oppnå enkeltcellesuspensjoner. På grunn av et utilstrekkelig antall celler oppnådd fra svulstene eller til sopp-eller bakteriell forurensning, ble bare fire prøver vellykket dyrket og analysert FOR celleoverflate CD133/1 epitoputtrykk. Disse vellykkede dyrkede biopsiene inkluderer en eccrine porokarsinom og tre plateepitelkarsinomer. Mikroskopisk undersøkelse av de dyrkede cellene viste forskjellige morfologier som varierte konsekvent til den histologiske svulstypen. Celler fra plateepitelkarsinom viste epiteloid-eller spindelcelleutseende, mens ekskrin-porokarsinom-avledede celler hadde mer avrundet form og gruppert sammen i små og atypiske holmer. Tilstedeværelsen av epitelceller i disse kulturene ble bekreftet gjennom e-cadherin og EpCam positivt uttrykk som epitelmarkører.For å avgjøre om hudtumorcellekulturer inneholdt EN populasjon AV CD133-positive celler, brukte vi flowcytometri for å undersøke uttrykket AV CD133 / 1 overflatemarkør med AC133-antistoffet. Alle prøver fra plateepitelkarsinom inneholdt mindre enn 0,1% av de positive cellene, mens nesten 22% av de positive cellene ble påvist i ekskrinporokarsinom. Figur 6 viser representative histogrammer fra de to hudtumortypene som er evaluert.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Plateepitelkarsinom viser negativ farging FOR CD133 og 0% positive CD133-celler på flowcytometri.

4. Diskusjon

Fremgang i kutan stamcellebiologi, og i karsinogeneseforståelse, avhenger sterkt av tilgjengeligheten av markører som er spesifikke for særegne stamcellepopulasjoner . Kjente markører av hudstamceller eller stamceller som er identifisert i andre organer eller svulster, kan brukes til påvisning av kutane Csc-er. EN av disse markørene som kan testes i huden er CD133-proteinet (prominin-1). De første DATAENE som rapporterte CD133-uttrykk ved bruk av det monoklonale antistoffet AC133, produsert mot et nytt stamcelleglykoproteinantigen, viste at CD133 ble selektivt uttrykt på CD34 hematopoietiske stamme-og stamceller avledet fra humant føtal lever og benmarg, så vel som fra blod . Siden da har flere rapporter vist at prominin-1 kan brukes til å identifisere og isolere humane stamceller fra forskjellige kilder, inkludert hematopoietisk system , prostata , bukspyttkjertelen eller nyrene . I tillegg har monoklonale antistoffer mot CD133 blitt brukt til identifisering og isolering av en antatt populasjon av tumorinitierende celler eller CSCs i et antall humane karsinomer og i malignt melanom . I gliom har det økte antallet CD133-positive kreftceller, samt tilstedeværelsen av klynger av disse cellene, blitt foreslått som en signifikant prognostisk faktor, uavhengig av andre faktorer som tumorgrad . Imidlertid har andre studier, ved hjelp av forskjellige og nye ANTI-CD133 kloner, antydet at uttrykket AV CD133 ikke er begrenset til stamme-og stamceller og synes å være uttrykt i voksne epitelceller av mus og humant vev . For eksempel, ved hjelp AV EN CD133 klone, kalt 13A4, avledet fra mus prominin-1, Weigmann et al. demonstrert uttrykk for prominin-1 på den apikale overflaten av nevroepiteliale celler og voksne nyre proksimale tubuli, Og Karbanová et al. ved bruk av et monoklonalt antistoff (80B258) generert mot et humant prominin-1 polypeptid, observeres immunoreaktivitet i voksent humant vev, spesielt i kjertelepitel. Disse resultatene indikerer behovet for videre studier for å avklare om AC133-antigenet, som tidligere ble funnet i flowcytometri, skal begrenses TIL CD34-positive stamceller, uttrykkes i voksne epitelceller . Det har blitt foreslått at det observerte VARIABLE CD133-uttrykket er relatert til differensialaffiniteten til de forskjellige antistoffene til forskjellige glykosylerte FORMER FOR CD133 . DET monoklonale antistoffet AC133 gjenkjenner en glykosylert epitop av prominin-1, og interessant kan glykosyleringen av dette proteinet endres avhengig av tilstanden av cellulær differensiering, eller det kan endres under prosessen med ondartet transformasjon . I vår studie på menneskelige hudtumorer har VI observert AT CD133-uttrykk er sterkt avhengig av dannelsen av svettekjertelkanaler og svettekjertelsekresjon. CD133 immunoreaktivitet ble hovedsakelig sett på den apikale / endoluminale overflaten av kanallignende strukturer eller cyster av de fleste godartede og maligne ekkrintumorer. Ingen av de undersøkte svulstene, verken godartede eller ondartede, presenterte isolerte eller små klynger AV CD133-positive neoplastiske celler i faste områder. LIGNENDE CD133-fargemønster av den apikale cellemembranen i sekretoriske celler har tidligere blitt rapportert i normale rørformede strukturer som proksimale nyretubuli eller i tumorkjertler av kolorektal kreft . CD133-farging ble også funnet på den apikale / endoluminale overflaten av celler som danner et lumen i eggstokkreft . I disse tilfellene har den apikale plasseringen AV CD133 blitt implisert i en mulig sekretorisk funksjon av dette molekylet. Den morfologiske fordeling av cd133-fargingen viser en korrelasjon med anerkjente sekretoriske strukturer av normalt vev og kjertler, noe som tyder på et funksjonelt forhold MELLOM CD133 og sekresjon. Faktisk, i vår studie, tumorer mistenkt for å være oppstått i ductal områder av svettekjertlene, som syringomas, viste en mindre intens mønster av flekker enn de som oppsto på acinar deler. CD133-uttrykket på celleoverflaten til differensierte tumorceller er et argument mot CD133 som en spesifikk kreftstamcellemarkør i huden. Eksistensen AV en LITEN CD133 + CSC-populasjon kan imidlertid ikke helt utelukkes, som det har blitt påvist i andre organer, hvor CD133 uttrykkes på celleoverflaten til Både CSCs og differensierte tumorceller . Samlet viser våre funn et spesifikt immunhistokjemisk uttrykk FOR AC133-antistoffet på sekretorisk overflate av differensierte normale og neoplastiske celler i ekkrinkjertler. Eksperimenter som bruker dette antistoffet som en markør For CSCs i huden bør tolkes med forsiktighet. Ac133-antistoffet er en sensitiv og spesifikk markør for kutan glandulær differensiering, nyttig for diagnose av svulster med mulig eccrine eller apokrine differensiering.

Takk

forfatterne er takknemlige For Pedro Javier Benito Castellanos og Laura Abendañ for teknisk støtte.