Resultater

Karakterisering Av Plasmacytoid Dendritiske Celler i Tynntarmen.

vi brukte standardprosedyrer for å isolere immunceller som ligger i epitelet (intraepitelial, IE) og LP fra tarmen. I begge cellepreparater fant vi en distinkt populasjon Av CD11c + B220 + Ly6C + celler som utgjorde opptil 1% av alle celler. I motsetning til pDC var myeloid (M) DC (CD11c + MHCII + CD3-B220-Ly6C – − kun til stede ved svært lave tall I IE-preparatet (Fig. 1 A). Både pDC AV LP og IE forberedelse viste lave nivåer av OVERFLATEN MHC klasse II uttrykk (Fig. 1 A). Videre analyse viste At CD11c + B220 + Ly6C + celler av begge preparater jevnt uttrykke pDC markører PDCA1 SAMT 120G8 (Fig . 1 B). Cytospiner fra sortert pDC (CD11c+B220+Ly6C+) og myeloid DC (mDC) i IE-preparatet viste en rund og jevn, plasmacellelignende morfologi av pDC, mens mDC viste de karakteristiske dendrittene (Fig. 1 C). For ytterligere å karakterisere lokaliseringen av pDC i tarmen brukte vi anti-B220, anti-120g8 og ANTI-CD3 mAb i immunhistologi. Micrographs ble tilfeldig tatt fra seksjoner og, som vist I Fig. 1 D, plasseringen AV 120G8 + B220 + CD3-celler ble bestemt i forhold til epitelceller ved hjelp av bildeanalyse (analyse; Olympus, Hamburg, Tyskland). Ved vurdering av posisjoneringen av ≈150 pDC observerte vi at 4,9% av disse cellene var tydelig plassert innenfor epitelcellelaget, mens ytterligere 6,7% befant seg innenfor en avstand på 5-10 µ fra den apikale spissen av epitelcellene (Fig. 1 D). Disse dataene viser at en viss mengde pDC befinner seg innenfor eller nær tarmepitelet, mens > 80% av de analyserte cellene ble plassert på avstander >15 µ, som gjør dem TIL LP-celler (Fig . 1 D). Fordi lignende antall pDC var til stede i IE og LP forberedelse følgende standard isolasjon prosedyrer, det er foreløpig uklart om pDC AV LP forurense IE forberedelse eller om pDC lokalisere til epitel er mer effektivt isolert. Fordi vi nesten ikke finner noen mDC i IE-forberedelsen, favoriserer vi sistnevnte mulighet. Likevel gjenstår det å avgjøre om begge populasjonene tjener forskjellige funksjoner eller tilhører en felles cellepopulasjon. Fordi pDC AV IE-preparatet, i motsetning til pDC AV LP-preparatet, kan isoleres ved ganske milde prosedyrer, ble utelukkende pDC av IE-preparatet brukt til funksjonelle analyser i denne studien.

CCR9 Uttrykk På Intestinal pDC.

for å identifisere molekylære mekanismer som tillater migrasjon av pDC til tarmen, analyserte vi uttrykket av homing molekyler. Selv om det er godt etablert at integrin aE (CD103) medierer lymfocyttadhesjon til epitelceller i tarmen, klarte vi ikke å identifisere uttrykk for dette integrinet på intestinal pDC. TILSVARENDE CCR7 (Fig. 1 E), i hovedsak involvert i homing av lymfocytter i perifere lymfoide organer er ikke uttrykt av pDC i tarmen. I motsetning til DETTE observerte vi høye nivåer AV CD18 (β2-integrin) og mellomliggende nivåer av α4β7 mens ≈50% av pDC express-p-selectin-ligander (Fig. 1 E). Av interesse uttrykte det store flertallet av intestinal pDC høye mengder av kjemokin-reseptoren CCR9(Fig. 1 E), mens mDC av LP uttrykte nei, eller lave nivåer AV CCR9 .

CCR9 Ekspresjon av pDC Isolert Fra Forskjellige Lymfoide Organer.

Med tanke på det ensartede uttrykket AV CCR9 på intestinal pDC, analyserte vi uttrykk FOR CCR9 på pDC isolert fra sekundære lymfoide organer, inkludert milt, huddrenerende LN, mesenterisk LN og Peyers flekker (PP; Fig. 2 A) og brukte CD4 + CD8 + thymocytes, kjent for å uttrykke høye NIVÅER AV CCR9, som en positiv kontroll (11); Fig. 2 B). Interessant, bare en brøkdel av pDC tilstede i noen av disse organene uttrykt CCR9(Fig. 2 A), mens ≈95% av pDC isolert fra BM bar denne reseptoren (Fig . 2 C). De FLESTE bm pDC uttrykker OGSÅ CCR5 og CXCR3 mens CCR2 er tilstede på bare omtrent 25% av cellene. CXCR4, kjent for å beholde celler TIL BM, er bare svært svakt uttrykt (Fig. 2 C). Sammen viser disse dataene at pDC er utstyrt med forskjellige kjemokin-reseptorer før de frigjøres fra BM. Denne funksjonen tillater antagelig homing ikke bare til steder av betennelse, men også til noninflamed tarmen.

Kjemotaksanalyse Av Flt3L-Utvidet pDC.

Basert på det sterke uttrykket AV CCR9 på BM og intestinal pDC, sammenlignet vi migrasjonskapasiteten til pDC og mDC mot kjemokinen CCL25/TECK, som er den eneste kjente liganden for denne reseptoren (12). Frekvensen av pDC varierer mellom forskjellige musestammer, og DET er velkjent AT FOR EKSEMPEL c57bl / 6 (B6) mus har mye mindre pDC enn 129sv mus (13). Uavhengig av den genetiske bakgrunnen er imidlertid antallet pDC som kan isoleres fra musevev utilstrekkelig til å utføre standard in vitro kjemotaksistester. For å overvinne denne begrensningen utvidet VI DC-populasjonen in vivo ved å implantere En Flt3-l-sekreterende tumorcellelinje (B16-FL) I b6-mus i 14 dager (14).

i løpet av denne tidsperioden økte prosentandelen CD11c+ – celler tilstede i milten fra 3% til 30-35% (data ikke vist). Åtti prosent av den in vivo utvidede pDC uttrykte CCR9, med nivåer som ligner de som er tilstede PÅ BM pDC (Figs. 2 C Og Fig. 4 C) mens in vivo utvidet mDC uttrykte bare små mengder av denne reseptoren (Si Fig. 6B). Milt pDC ble beriket Med CD11c + MAC-sortering, noe som resulterte i 95% renhet For CD11c + celler som inneholdt ≈15% Ly6C + B220 + pDC. In vitro transwell migrasjonsanalyser viste sterk kjemotaktisk respons av pDC TIL CCL25, så vel som TIL CXCL9, en ligand FOR CXCR3 og TIL CXCL12, som er en ligand FOR CXCR4. Bare en svak respons ble observert mot CCL19, som fungerer som en ligand FOR CCR7. mDC viste liten kjemotaktisk respons mot CCL25 OG CXCL9 og moderat respons mot CXCL12 og CCL19 (Fig. 3 A).

Redusert antall pDC i Tynntarmen AV CCR9-Mangelfulle Mus.

Basert på disse observasjonene karakteriserte vi fordelingen av pDC i CCR9-mangelfulle mus. Vi fant lignende prosenter av pDC i lunge og lever (SI Fig. 7) så vel som i inguinal og mesenteriske lymfeknuter, mens antall milt pDC var noe økt I CCR9 – / – mus. I motsetning observert vi en > 90% reduksjon av tarm og en 50% reduksjon AV PP pDC (Fig. 3 B).

pDC Fortrinnsvis Migrere Til Tynntarmen.

Basert på funnene beskrevet så langt, virket det sannsynlig at pDC krever CCR9 for homing til tynntarmen. For å bevise denne hypotesen overførte vi adoptivt celler Fra b6 og CCR9−/− donorer som hadde En Flt3-l-sekreterende tumor i 14 dager. Under påvirkning Av Flt3L pDC utvidet i tilsvarende grad I B6 OG CCR9 – / – mus− Fig. 4 A Og Fig. 8) og var uutslettelig med hensyn TIL uttrykket AV CCR2, CCR5 og CXCR3, MENS CCR9 bare ble påvist på pDC avledet Fra B6, men IKKE CCR9-mangelfulle donorer (Fig. 4 C). Uten ytterligere rensing ble splenocytter av disse donorene merket med henholdsvis 5 (6)-karboksyfluoresceindiacetat N-succinimidylester(CFSE) og 5 (6)-karboksytetrametylrhodamin n-succinimidylester (TAMRA). En blanding AV wt og CCR9-mangelfulle celler, justert for å inneholde like mange pDC, ble i.v. overført I b6 mottakere. Etter 18 timer med overføring analyserte vi først sammensetningen av adoptivt overførte wt-celler tilstede i IE samt LP-preparatet og la merke til at 54% og 25% av alle celler gjenvunnet fra HENHOLDSVIS IE og LP-fraksjonen var pDC (Fig . 4 B). Disse funnene viser at blant de ulike cellepopulasjoner overført pDC hjem mest effektivt til tarmen. Disse konkurransedyktige overføringene viste også AT CCR9-mangelfull pDC i stor grad er svekket i deres evne til å hjem til tarmen som reflektert av det lave migreringsforholdet AV CCR9-mangel vs. wt pDC funnet I IE og LP-preparatet (Fig . 4 D). I motsetning migrerte CCR9-mangelfull og b6 pDC med tilsvarende effektivitet som perifere og mesenteriske lymfeknuter (Fig. 4 D). Naturen til cellemerkingen hadde ingen innvirkning på disse forsøkene fordi utveksling av fargestoffer Mellom B6 og CCR9−/− celler ga identiske resultater (data ikke vist). Selv om disse dataene tydelig viser at pDC krever CCR9 for effektiv homing til tarmen, bør det nevnes at smuglingsegenskapene til pDC fra Flt3-ligandbehandlede mus kan være forskjellige fra de som er tilstede under fysiologiske situasjoner.

pDC Rekrutteres til Betent Tarm.

fordi det er kjent at pDC spiller en viktig rolle i antiviral immunitet (4, 10), spekulerte vi på at pDC kan rekrutteres til tarmen under inflammatoriske prosesser for å styrke førstelinjeforsvaret. Koleratoksin (CT) er kjent for å indusere tarmbetennelse når det administreres oralt, og det er rapportert at innen 2 timer etter oral påføring øker antall mDC transiently rekruttert til tarmen 4 ganger (15). Vi observerte at i tillegg til mDC økte pDC-tallene også 3 ganger ved mating Av b6-mus med 10 µ CT (Fig. 4 E). Av interesse resulterte det identiske eksperimentelle oppsettet aldri i noen økning av pDC verken I IE eller LP-forberedelsen AV CCR9-mangelfulle mus etter 1, 2 eller 3 h CT-behandling(Fig . 4 E og data ikke vist). Det spesifikke kravet TIL CCR9 på pDC for rekruttering til tarmen under inflammatoriske prosesser ble bekreftet ved adoptiv overføring AV WT og CCR9-mangelfull pDC til CCR9-mangelfull mottakere etterfulgt av anvendelse AV CT som beskrevet ovenfor. Mens adoptivt overført wt pDC var rikelig tilstede I IE og LP forberedelse, CCR9-mangelfull pDC var nesten helt utelukket fra disse avdelinger(Fig. 4 F). Sammen viser disse resultatene at under inflammatoriske hendelser kan pDC rekrutteres til tarmslimhinnen, og at denne mekanismen i stor grad er avhengig AV CCR9.

En Rolle For Intestinal pDC For Rask Mobilisering AV Lp Myeloid DC.

det har nylig blitt vist at oral bruk AV TLR7 / 8 ligand resiquimod (R848) resulterer i rask mobilisering AV LP DC, og At TNFa, muligens utgitt av pDC, er involvert i denne prosessen (16). Vi spekulerte dermed på at intestinal pDC kan være kilden Til TNFa som potensielt utløser mobilisering av nærliggende mDC. For å teste denne hypotesen stimulerte vi in vitro b6 pDC AV IE og LP-preparatet for 16 h Med R848. Faktisk utskilte pDC betydelige mengder TNFa, men klarte ikke å produsere detekterbare mengder IL-2, IL-4, IL-5 Eller IFNy (Fig. 5 A). Vi analyserte deretter mobiliseringen AV lp mDC in vivo etter oral bruk Av R848. Mens ubehandlede B6− og CCR9−/ – mus ikke var forskjellige med hensyn til tilstedeværelsen av intestinal mDC (Fig. 5 B), innen 2 h oral r848 induserte mobilisering av ≈60% av mDC i WT, men bare 10,8% I CCR9 – / – mus. Det er viktig at NÅR CCR9-mangelfulle mus i. v. mottok milt pDC Av Flt3L-behandlede wt-donorer 16 h før oral bruk Av R848, kunne denne mangelen i intestinal mDC-mobilisering bli fullstendig reddet (Fig . 5 C). Disse forsøkene viser AT EN CCR9-avhengig homing av pDC til tarmen er involvert i rask mobilisering av intestinal mDC etter oral bruk AV EN TLR7 / 8 ligand. Fordi det har blitt vist av andre i rottemodellen at bruk av LPS også induserer mobilisering AV lp mDC (17), brukte vi 50 µ AV LPS ip til WT og CCR9-mangelfulle dyr. Av interesse, under disse eksperimentelle forholdene klarte vi ikke å observere noen forskjell MELLOM wt og CCR9-mangelfulle dyr angående mobilisering AV LP mDC(SI Fig. 9).