Studiedesign

VX-765 studie: Fem måneder gamle vehicle-injisert WT (WT + vehicle; n = 18) Og J20 mus (J20 + vehicle: n = 14), OG VX-765-injisert J20 mus (j20 + vx-765: n = 13) mus Ble vurdert i lengderetningen på fem forskjellige tidspunkter: Baseline før behandling (baseline ubehandlet j20 ble gruppert sammen; n = 19), etter tre IP-injeksjoner per uke MED VX-765 eller vehicle (Behandling 1), etter ytterligere seks injeksjoner i løpet av 2 uker (Behandling 2), etter 4 ukers utvaskingsperiode( WO), og etter ytterligere tre injeksjoner i løpet av 1 uke (Behandling 3) (Fig. 1a). Alle testede dyr ble inkludert i analysene med mindre (a) dyret døde under forsøket, eller (b) dyret ikke reagerte atferdsmessig. Totalt 25 kull, spredt over fire forskjellige kohorter og testet på forskjellige tidspunkter, ble brukt. Tre av disse kohortene gjennomgikk nor og open field testing, mens kohort 4 ble brukt Til Barnes maze. Etter at dyr ble testet ved baseline for å bekrefte At j20-dyr var atferdsunderskudd, ble j20-dyr randomisert til enten vehicle-eller VX-765-behandling uavhengig av atferdsytelse. Av alle dyr som ble brukt, viste fire J20-mus ingen atferdsunderskudd i begynnelsen av forsøket og ble ikke brukt. To J20 + kjøretøy mus ikke flytte i det hele tatt under forsøket og deres atferdsdata ekskludert; imidlertid ble disse dyrene holdt og ble fortsatt brukt til post mortem analyse.

Casp1 valideringsstudie: For å validere Casp1-spesifikke effekter AV VX-765 ble J20-mus generert På Casp1 – / – bakgrunn. Syttitre mus ble brukt (n = 12-13 per genotype, seks forskjellige genotyper), som alle ble avlet gjennom in vitro befruktning (IVF) fra 35 donorhunner. Avl detaljer er beskrevet i Dyreforsøk nedenfor. Alle mus ble atferdsvurdert mellom 7 og 8 måneders alder, og ingen dyr ble ekskludert fra denne studien.

alle mus ble ofret og behandlet ved 8 måneders alder. Behavioral scoring ble blindet for musgenotype og behandling, og alle dyr ble randomisert for enten biokjemisk eller histologisk analyse og blindt analysert.

VX-765, VRT-043198 IC50-analyser på rekombinante caspaser

Dyrestudier

alle dyreprosedyrer fulgte canadian Council on Animal Care guidelines og ble godkjent av Mcgill University Animal Care committee. J20 transgen mus linje (Jax Lager Nr. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) uttrykker de svenske (670/671KM→NL) og Indiana (717V→F) humane APP-mutasjoner under PDGF-ß. Mannlige J20-mus ble brukt som oppdrettere og deres sæd ble brukt TIL IVF-koloniutvidelse.

Genotyper ble bestemt ved halebiopsi og RT-PCR. Mus var gruppehus (2-4 dyr per bur) i standard makrolonbur under en 12-h omvendt lys / mørk syklus og kontrollerte miljøforhold. Mat og vann var tilgjengelig ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) ble oppløst i 20% cremophor i dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) og administrert intraperitonealt. Kjøretøybehandlede j20-og WT-mus fikk kun cremophor.

blod–hjerne-barrierepermeabilitetsanalyse

fem måneder Gamle j20-og wt-mus ble bedøvet med isofluran og den høyre halspulsåren ble separert. Et lite snitt ble gjort langs karotidveggen og et mikrokateter ble satt inn i inngangen til den indre halspulsåren. Kateteret ble festet på plass ved hjelp av sutur tråd. VX-765 (50 mg kg-1) ble infundert ved 50 µ min−1 (totalt volum 90-120 µ). Mikrokateteret ble igjen ytterligere 5 min for å tillate diffusjon, hvoretter blod ble samlet inn ved intrakardial punktering. Musen ble transcardialt perfusert med iskald saltvann og hippocampus og cortex ble dissekert ut. Prøver ble sendt Til biopharmacy-plattformen (Université De Montreal) for væskekromatografi og tandem massespektrometri analyse.

Atferdsanalyse

Åpent felt: lokomotorisk aktivitet ble målt ved HJELP AV ET HVS2100 automatisert sporingssystem (HVS Image, Hamptom, UK). Mus ble plassert i det åpne feltkammeret (40 × 40 cm Plexiglas boks, ingen tak og hvitt gulv) og fikk lov til å utforske i 5 min.

Novel object recognition (NOR): mus ble foreksponert for to identiske objekter i det åpne feltkammeret i 5 min. To timer etter pre-eksponering ble mus plassert tilbake i kammeret og utsatt for en kjent gjenstand og en ny gjenstand i 5 min. Mus ble utsatt for et bestemt objekt bare en gang på tvers av ulike testøkter, og ny objektplassering ble motvektet innenfor hver behandlingsgruppe. Prosentvis berøringer av det nye objektet i testfasen og diskrimineringsindeksen ((# berører roman − # berører kjent)/total berøring) ble vurdert.Barnes maze: Barnes maze-plattformen (91 cm diameter, forhøyet 90 cm fra gulvet) besto av 20 hull (hver 5 cm i diameter). Alle hull ble blokkert bortsett fra ett målhull som førte til en innfelt fluktboks. Romlige signaler, sterkt lys og hvit støy ble brukt til å motivere musene til å finne flukten under hver økt. For tilpasningsfasen utforsket hver mus plattformen for 60 s. enhver mus som ikke fant fluktboksen, ble guidet til den og ble der i 90 s. for oppkjøpsfasen fulgte hver prøve den samme protokollen, med målet å trene hver mus for å finne målet og gå inn i fluktboksen innen 180 s. Mus ble igjen i esken i ytterligere 60 s. Fire forsøk per dag, omtrent 15 min fra hverandre, ble utført i 4 påfølgende dager. I sondetesten (dag 5) utførte hver mus en 90 s-prøve. Målet var fortsatt plassert i samme posisjon, men fluktboksen ble blokkert. Latens og feil for å nå målet, pluss antall mus pokes til hvert av hullene (mål preferanse) ble målt. Y-Labyrinten var sammensatt av en symmetrisk Y-formet labyrint med tre armer 120° fra hverandre, betegnet A, B og C. Dyr ble plassert i den distale enden Av arm A og fikk lov til å utforske labyrinten i 5 min. Total arm oppføringer og spontan veksling, definert som påfølgende oppføringer i tre forskjellige armer, ble registrert. Prosentvis veksling ble bestemt.

vevsbehandling

for immunhistokjemi ble mus (n = 4-6 per gruppe) bedøvet med isfluoran og transkardialt perfusert med iskald saltvann etterfulgt av iskald 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) i 0,1 M fosfatbufret saltvann. Hjerner ble postfiksert i 10% nøytral-bufret formalin (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) i 16 timer og overført til 70% etanol. Hjerner var parafin innebygd og seksjonert til 4 µ.

for western blot og ELISA (n = 4-8 per gruppe) ble bedøvede mus cervicalt dislocated, hippocampus og cortex dissekert ut og umiddelbart frosset på tøris. Proteiner ble ekstrahert i 5× volum/vekt med radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-deoksykolat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Av Proteasehemmere Cocktail (Sigma-Aldrich)) på is med en vevshomogenisator (Omni International, kennesaw, ga, usa). Prøvene ble sentrifugert (20 000 × g, 4 °C) i 20 minutter, supernatanten gjenvunnet og proteinkvantifisert VED BRUK AV bca-metoden. DEN RIPA-uoppløselige pelleten ble ytterligere ekstrahert i 70% maursyre i dH2O, fordampet og oppløseliggjort i 200 mM Tris-HCl, pH 7.5.

Immunhistologisk farging

Epitoper ble demaskert i enten citrat (10 mM Tris-Na Citrat, pH 6,0) eller EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) antigen henting buffer, og immunostained Bruker Dako Autostainer Pluss automatisert lysbilde prosessor Og EnVision Flex system (Dako, Burlington, On, Canada). Etter deparaffinisering og rehydrering ble seksjonene peroksidase behandlet, blokkert i serumfri proteinblokk og immunisert med følgende antistoffer fortynnet i EnVision Flex Antistoff Fortynningsmiddel: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-Gfap (Dako Z-0334), 1:2000 rabbit anti-Aß1-40 (f25276, laboratorium utviklet), og 1:1000 mus antisynaptofysin (sigma-aldrich s5768). Seksjonene ble behandlet med riktig mus ELLER KANIN HRP-konjugert sekundært antistoff og visualisert MED DAB. Seksjonene var hematoksylin counterstained, dehydrert og dekket Med Permount (Fisher Scientific). Seksjonene ble digitalt skannet MED MIRAX SCAN for analyse(Zeiss, Don Mills, ON, Canada). Etter deparaffinisering og rehydrering ble lysbildene farget med filtrert 1% vandig Tioflavin-S (Sigma-Aldrich).

Kvantitativ immunhistologisk analyse

Iba1-positive celler i cortex og fremre del AV CA1-regionen i hippocampus ble kvantifisert ved hjelp av en modifisert versjon av arealet telleramme48. Kort sagt ble hvert femte lysbilde kvantifisert (noe som resulterte i fire seksjoner per hjerne). Flere ×80 bilder ble tatt med MIRAX-SKANNINGEN innenfor interesseområdet, og Antall Iba1-positive celler ble telt manuelt. Den numeriske tettheten (antall celler mm−3) i den fremre CA1-regionen og cortex ble estimert. Et minimum antall 150 treff per område var nødvendig for å gjøre et pålitelig estimat. Ytterligere seksjoner ble talt hvis vi ikke klarte å nå vårt minimumsnummer. Kvantifisering ble utført blindet for behandling og genotype. ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA) ble brukt til å måle Enß akkumulering, GFAP og synaptofysin immunopositive flekker I CA1 regionen og cortex. Fire seksjoner per hjerne ble analysert, og flere bilder ble tatt i hver seksjon for å dekke CA1-regionen og cortex. Terskel ble like justert på tvers av alle hjerner for å markere det fargede området, og partikler ble analysert for å bestemme det totale arealet av farging. Resultatene uttrykkes som totalt areal farget per analysert totalareal (µ 2 mm−2). Representative bilder har bare blitt beskåret for å overholde størrelsesbegrensninger og har ikke gjennomgått noen etterbehandling.

Western blotting

Proteinprøver Fra Mus (25-100 µ) ble tilberedt I Laemmli (5% 2-β-merkaptoetanol, 1 Mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Cocktail Av Proteasehemmere (Sigma-Aldrich)), kokt i 5 minutter og separert av polyakrylamidgelelektroforese (SIDE). Prøver ble undersøkt med følgende primære antistoffer, fortynnet i enten 5% nonfat tørr melk I Trisbufret saltvann og 0,1% Tween-20 eller PBS blokkerende buffer( Termovitenskapelig): 1: 1000 mouse anti-human Aß 1-16 (6e10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 KANINANTI-App C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 kaninanti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 kaninanti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 kaninanti-Caspase-3 (Cellesignalering 9665), 1:1000 Musantiaktiv Caspase-8 (Cellesignalering 8592), 1:1000 kaninanti-caspase-9 (cellesignal 9504), Og 1:5000 Mus Anti Β-aktin (sigma-aldrich a5441). Blott ble påvist med 1:5000 HRP-koblet anti-mus (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) eller 1: 5000 anti-kanin (Dako P0217) sekundært antistoff etterfulgt AV ECL (GE Amersham). Immunoreaktive bånd ble visualisert Ved Hjelp Av ImageQuant LAS 4000 imaging system (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), og densitometriske analyser ble utført med Image Gauge analysis software (Fujifilm USA). Lysstyrke/kontrast av raw blots ble likt justert over hele bildet Med Adobe Photoshop CS5 programvare (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) for å generere representative bilder. Ingen ytterligere endringer ble gjort. CanvasTM x software (Acd system, Plantation, FL, USA) ble brukt til å lage endelige tall. Rå blotter for western blots er tilgjengelig I Supplerende Figur 11.

ELISA

pro-og anti-inflammatoriske cytokiner, og Enß nivåer i musens hjerne ble bestemt ved hjelp av elektrokjemiluminescens immunanalysesett Fra Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Standarder og prøver ble utarbeidet i henhold til produsentens protokoller og kjørt i to eksemplarer. Den ten-plex mus proinflammatory panel ble brukt for mus hippocampus og kortikale og prøver. Et Enkelt Il-1β-sett ble brukt til å måle museplasma. Det fire-plex humane proinflammatoriske panelet ble brukt TIL hpn-prøver (se nedenfor). Det fire-panel menneskelige Aß 6E10-settet ble brukt til mus hippocampus og cortex og HPN-prøver.

rna ekstraksjon og cDNA syntese

Total RNA ble ekstrahert fra mus hippocampus og cortex (n = 3 per gruppe) Med Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA) etterfulgt av homogenisering med en 20-gauge nål. MiRNeasy mini kit, inkludert på-kolonne DNase behandlingstrinn, ble brukt til å rense total RNA (Qiagen). RNA-kvalitet og kvantitet ble bestemt ved hjelp av et spektrofotometer (DS-11 FX+, Denovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produktene ble visualisert På RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada) farget 2% agarose geler. Pcr-eksperimenter i sanntid ble utført MED SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, GAITHERSBURG, MD, USA) på En Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-systemmaskin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genforsterkning ble utført med følgende primere: (18s) 5 ‘- GTAACCCGTTGAACCCCAT-3 ‘og 5′ – CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’; (IDE) 5 ‘- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3 ‘og 5′ – GGTCTGGTATGGGAAATG-3’; (Neprilysin) 5 ‘- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3 ‘og 5′ – CTCCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. Resultatene uttrykkes som foldeinduksjonsverdier normalisert til å bety hprt og 18s referansegener ved Bruk Av Pfaffls metode.

mus synaptisk plastisitet RT2-Profiler PCR array

mus synaptisk plastisitet RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profiler uttrykket av 84 gener involvert i synaptiske endringer under læring og minne og fem housekeeping gener (β-actin; β-2-mikroglobulin; glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase, GAPDH; β-glukuronidase, Gusb; Varmesjokkprotein 90 alfa (cytosolisk), Hsp90ab1) med sanntids PCR. Totalt RNA (465 ng for hver prøve) ble revers transkribert (som inkluderte et genomisk DNA eliminasjonstrinn) etter produsentens protokoll (First Strand cDNA Synthesis Kit, Qiagen). Sanntids PCR-reaksjonen ble utført I en sanntids cycler ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) ved HJELP AV RT2 SYBR Green / ROX PCR master mix (Qiagen). Sykkelforholdene var som følger: 2 min ved 50 °C, 10 min ved 95 hryvnias C, 40 sykluser, 15 s hver ved 95 hryvnias C og 1 min ved 60 hryvnias C. Terskel og baseline ble satt manuelt i henhold til produsentens instruksjoner. Data ble normalisert til det geometriske gjennomsnittet av de fem housekeeping-genene og analysert med den komparative Ct-metoden (2−Δ).

Neuronal cellekultur og aksonal degenerasjonsanalyse

Tolv til seksten uker gamle føtale kortikale vev ble oppnådd fra Fødselsdefekter Research Laboratory (University Of Washington, Seattle, USA) i samsvar med en godkjent protokoll Av McGill institutional review board. HPN ble dyrket fra hjerner som ble dissosiert med trypsin, behandlet med deoksyribonuklease I, og filtrert gjennom 130, 70 og 30 µ nylon mesh21. Dissosierte celler ble sentrifugert i 10 minutter ved 300 × g og resuspendert i minimalt essensielt medium (MEM) med Earles salter, og supplert med 5% dekompementert BCS, 1× Penicillin-Streptomycin, 1 mM natriumpyruvat og 2 mM l-glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cellene ble sådd med en tetthet på 3×106 celler ml-1 på 5 µ mL-1 poly-l-lysin-belagte seksbrønnskulturplater (Sigma-Aldrich). MEM medium ble endret hver 2. dag og astrocytproliferasjon var begrenset med fluorodeoksyuridince (FdU) antimitotisk behandling (1 mM, Sigma) de første 4 dagene. Nevronkulturer ble dyrket 7-10 dager før de utførte eksperimenter. Fire forskjellige neuronpreparater på forskjellige tidspunkter ble testet. En av nevronpreparatene var ikke stabil, og kulturen, inkludert Serum + – kontrollen som ikke mottok noe stoff, døde midt i forsøket. Derfor ble tre forskjellige neuronpreparater fra tre genetisk forskjellige donorer brukt.

vx-765 toksisitet ble vurdert med 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT). Nevroner ble behandlet med 25-200 µ VX-765 eller 0,1% DMSO (høyeste DMSO-konsentrasjon brukt) i 72 timer. Nevroner ble deretter inkubert med 0,5 µ ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) i 4 timer ved 37 °C (5% CO2). Formazan-krystallene ble oppløst i 100 µ DMSO i 30 minutter. Absorbans ble målt ved 560 og 670 nm ved Bruk Av Synergy H4 plateleser.

Aksonal degenerasjon ble indusert enten VED APPWT-transfeksjon eller serummangel. VX-765 ble administrert enten som en forbehandlingsstrategi (1 time før stressor) eller som en postbeading behandlingsstrategi(48 timer etter stressor). Neuroner ble transfisert Av Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canada) med gullperler belagt med pBudCE41-eGFP for fluorescens visualisering. Neuroner SOM VAR APPWT stresset ble transfisert med pBudCE41-eGFP / APPWT. I korte trekk ble nevroner behandlet med medium supplert med 25 ELLER 50 µ VX-765, 5 µ Casp1-hemmer Z-YVAD-fmk eller DMSO. Fluorescensbilder ble tatt hver 24.time (opptil 72 timer etter behandling) med Et Nikon Eclipse Ti-mikroskop (Nikon, Mississauga, ON, CA) og Photometrics coolSNAP HQ2 CCD-kamera (Photometrics, Tucson, Az, USA) ved HJELP AV nis Elements AR 3.10-programvare (Nikon). Prosentandel neuronal beading ble målt ved å telle antall beaded eGFP-positive nevroner over totalt antall eGFP-positive nevroner ved hvert tidspunkt. Minst 150 eGFP-positive nevroner ble talt for hver tilstand. Kondisjonert medium ble samplet (supplert med 1 Mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µ ml−1 Proteasehemmere Cocktail (Sigma-Aldrich)), og nevroner ble høstet i cellelysebuffer (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) for analyse.

Statistiske analyser

antall dyr eller uavhengige eksperimenter, og statistisk analyse brukt (ANOVA og post-hoc sammenligninger) er alle angitt i figuren legender. Alle verdier er uttrykt som middelmådig s.e. m., med F-og p-verdier angitt i figuren legender. Alle statistiske analyser ble utført ved Hjelp Av GraphPad Prism 7 programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).