Diskusjon

denne studien har avdekket en rolle FOR SR luminal Ca-bindende protein, CSQ2 i regulering av eksitasjon-sammentrekning kobling og CICR i hjertet. Spesielt viser Vi At Ad-mediert overuttrykk AV CSQ2 dramatisk økte størrelsen på både celle-gjennomsnittlige Ica-induserte Ca-transienter og spontane Ca-gnister i isolerte hjerteceller. Analyse av den stigende fasen og endringshastigheten for Disse Ca-signalene indikerte at deres forstørrede størrelse skyldtes redusert avslutning av underliggende Ca-release-flukser fra SR. I tillegg til å forlenge aktiv Ca-frigjøring, ble dynamikken i funksjonell oppladning av SR Ca-butikker også redusert i celler med forhøyede CSQ2-proteinnivåer, som indikert ved redusert gjenopprettingstid for repeterende Ca-gnister. Vi oppnådde i hovedsak de motsatte resultatene i myocytter, hvor CSQ2-nivåene ble redusert Ved Ad-mediert antisenstransduksjon. Disse myocyttene viste kortere Ca-frigjøring, men akselerert restitusjon av Ca-utgivelsessteder. Videre, i periodisk stimulerte myocytter med reduserte CSQ2 nivåer, forårsaket anvendelse av isoproterenol arytmogene svingninger av intracellulær . Disse resultatene viser AT CSQ2 er en viktig determinant AV sr Ca releasing funksjon som fungerer ved å styre Ca-release varighet og release site refraktoritet. I lys av de observerte isoproterenolavhengige forstyrrelsene i rytmisk Ca-sykling i myocytter som underuttrykker CSQ2, er resultatene våre relevante for å forstå de cellulære mekanismene til katekolamininduserte arytmier knyttet til mutasjoner AV CSQ2-genet.

Molekylære Mekanismer AV CSQ2-Virkning. Vi tilskriver de observerte effektene AV CSQ2 PÅ SR Ca-frigjøring til dette proteinets evne til å fungere som en molekylær buffer som styrer det frie I SR luminalrommet (se foreslått skjema I Fig. 5). Fra lipid-dobbeltlagsstudier er det kjent at binding Av Ca til luminalaspektet I RyR-komplekset (dvs. luminal Ca-sensor) øker kanalaktiviteten, mens ved senket luminal reduseres kanalaktiviteten (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Fordi mange RyRs ville være i en aktivert tilstand ved normale hvilende Luminal Ca-nivåer (≈1 mM), ville senking av luminal under frigjøringsprosessen derfor redusere total kanalaktivitet( en prosess kalt luminal Ca-avhengig deaktivering; ref. 3). Våre resultater tyder på at ved å stabilisere den lokale frie luminal i Nærheten Av RyRs under frigjøringsprosessen, reduserer CSQ2 den luminale Ca-avhengige lukningen Av RyR-kanalen, og øker dermed Mengden Ca som frigjøres fra sr til cytosol. CSQ2 styrer også gjenopprettingsdynamikken til fri intra-SR under Ca-gjenopptak ved å fungere som en vask For Ca i sr lumen. DERMED forsterker CSQ2 IKKE BARE sr Ca-effluks, men stabiliserer OGSÅ CICR ved å modulere funksjonell restitusjon, eller beredskap, Av Ca-frisettingssteder etter hver frisetting. Nylig påberopte vi en lignende mekanisme for å forklare effektene av Ca-chelatorer med Lav affinitet (organiske salter) lastet inn I SR på Ca-frigjøring (3). Betydningen av våre nåværende funn er at de viser hvordan frigjøringsprosessen styres av ET endogent, Sr-bosatt Ca-bindende protein, CSQ2. De avslører også de patologiske konsekvensene av reduserte CSQ2-mengder i SR av hjerteceller.

DET er foreslått AT CSQ2 kan påvirke Ca-frigjøringskanalfunksjonen gjennom direkte interaksjoner med proteiner som utgjør Ca-frigjøringskanalkomplekset (Dvs. RyR, junctin og / eller triadin) (ref. 13; for gjennomgang, se ref. 9). Våre studier har ikke vist noen signifikante forskjeller i parametrene FOR SR Ca-frigjøring mellom celler som inneholder omtrent 3 ganger forhøyede nivåer AV CSQ2-protein og celler der organiske buffere ble lastet inn I SR (3). Dermed er den enkleste forklaringen på våre funn at de dominerende effektene AV CSQ2 på SR Ca-frigjøring skyldes bufferhandlingene til dette proteinet inne I SR. Klargjøring av den detaljerte mekanismen SOM CSQ2 og tilhørende proteiner som junctin og triadin regulerer Ca-frigjøring må avvente studier som involverer manipulering av nivåer og uttrykk for mutantformer av disse proteinene med endrede evner til å samhandle mellom seg selv og RyR.

den maksimale frekvensen Av Ca-frigjøring fra stimulerte myocytter var lik uavhengig av mengden CSQ2 uttrykt i Sr (Figs. 2B og 3D). Disse resultatene støtter forestillingen OM AT CSQ2 kontrollerer avslutning av frigjøringsprosessen, men disse resultatene er ikke hva man nødvendigvis ville forutsi basert på forventede bufferingseffekter av dette proteinet i SR. faktisk vil den maksimale frigjøringshastigheten forventes å være høyere i celler med økte Luminale Ca-bufferstyrker forårsaket av redusert nedgang av den frie intra-SR , fordi i disse cellene vil den forsinkede reduksjonen I Ca-gradienten over SR-membranen forventes å gi større Ca-fluxintensiteter. Flere mulige årsaker forklarer hvorfor dette ikke ble observert. En mulighet er at den første frie intra-SR kan være lavere I CSQ2-overexpressing enn I CSQ2-underexpressing celler. Selv om det frie i et lukket rom som SR ved steady state ikke bør påvirkes av Antall Ca-bindingssteder (dette bør bare påvirke kinetikken der steady state intra-SR er oppnådd), er det mulig at en sann steady state ikke ble oppnådd i våre eksperimenter (dvs.myocytter som gjennomgår lavfrekvent stimulering). En annen mulighet er at tilstedeværelsen av forhøyede NIVÅER AV CSQ2-protein bremser diffusjonen Av Ca i luminalrommet, og derved senker exodus Av Ca gjennom de åpne kanalene. Klart mer forskning, både eksperimentell og teoretisk, er nødvendig for å løse dette problemet.

Oppsigelse AV CICR. Hvordan CICR, en prosess med en iboende tilbøyelighet til selvregenerering, avsluttes, har vært gjenstand for intens forskning, først ved å bruke målinger av globale Ca-transienter og nylig ved å undersøke Ca-gnister (3, 27-30). En mulighet som har blitt vurdert er At RyR-kanalene gjennomgår Ca-avhengig inaktivering eller tilpasning som følge av økningen av på den cytosoliske siden av kanalen (27-29). En annen mulighet er at nedgangen i intra-SR gir et aktivt signal for lukning av RyRs etter at de apner (3, 30-32). Vi har nylig funnet direkte eksperimentelle bevis for en rolle av luminal Ca-induserte endringer I RyR-aktivitet (dvs. luminal Ca-avhengig deaktivering) ved avslutning AV SR Ca-frigjøring ved å klemme nivåene av intra-SR med Lavaffinitets Ca-buffere lastet inn I SR-cisternae (3). Ved å bruke disse bufferne forlenget vi dramatisk varigheten av aktiv Ca-frigjøring som ligger til grunn for både fokale Og globale Ca-transienter i myocytter. I samsvar med disse funnene, våre nåværende resultater viser at å øke nivåene av HØY kapasitet SR luminal Ca buffer CSQ2 forlenger Ca-release varighet, mens redusere mengder av denne endogene buffer forkortet release varighet, tilsynelatende ved å bremse eller akselerere luminal Ca-avhengig lukking av RyRs, henholdsvis. Sammen gir disse resultatene overbevisende bevis for rollen som luminal Ca-avhengig deaktivering Av RyRs ved avslutning av CICR. Selv om vi viser viktigheten av endringer i luminal Ca ved avslutning av SR Ca-utgivelse, utelukker ikke resultatene våre nødvendigvis muligheten for at ytterligere mekanismer, for eksempel RyR-inaktivering eller tilpasning på cytosoliske Ca-reguleringssteder, også kan påvirke avslutning av Ca-utgivelse.

selv om det foreligger klare bevis for en rolle for endringer i luminal Ca ved avslutning av hjerte gnister (ref. 3; tidligere studier indikerte At Ca gnister i skjelettmuskulatur ikke kan ledsages av betydelig uttømming AV SR . Lacampagne et al. (33) brukt kinetisk analyse av Høy temporal oppløsning Ca gnist opptak for å foreslå At Ca-release flux underliggende Ca gnist er konstant i amfibiske muskelfibre. Fordi SR Ca flux må avta når SR faller, kan dette resultatet bety at luminal Ca nivåer forblir stabil under Ca gnister. Dermed eksisterer muligheten for at de grunnleggende mekanismene som er ansvarlige for gnistavslutning, er forskjellige i hjerte – og skjelettmuskulatur. Utførelsen av komplementære studier i disse to celletypene (dvs.modulering AV CSQ-proteinnivåer i skjelettmuskelfibre og raske ca-gnistkinetikkmålinger i hjertemyocytter) bør bidra til å avklare dette problemet.

Relevans TIL CPVT. Et av de viktigste aspektene ved resultatene våre er at de viser hvordan reduserte CSQ2-nivåer kan forårsake hjertearytmier på mobilnivå. CPVT er en arytmogen sykdom preget av synkope og plutselig død induserbar ved trening og katekolamininfusjon (34). Så langt har fire mutasjoner vært knyttet TIL CPVT. Tre av disse mutasjonene ser ut til å resultere i redusert CSQ2-uttrykk (17), og en mutasjon er foreslått å føre til forstyrret binding Av Ca (16). Våre resultater tyder på at den underliggende årsaken TIL CPVT kan være relatert til unormal restitusjon av Ca-frigjøringsmekanismen forårsaket av reduserte CSQ2-nivåer (Fig. 5). På grunn av den lavere konsentrasjonen Av Ca-bindingssteder i sr av celler som underuttrykker CSQ2, skjer påfylling av Ca-butikken ved SERCA-pumpen raskere enn i normale celler. Butikkopplading blir enda raskere når AKTIVITETEN TIL SERCA stimuleres av proteinkinase a, som potensielt regner med avhengigheten av kliniske episoder AV CPVT på katekolaminer. I myocytter med reduserte CSQ2-nivåer førte for tidlig utvinning Av Ca-frigjøringskanaler fra en luminal Ca-avhengig ildfast tilstand til spontane ekstrasystoliske utslipp AV sr Ca-butikker. Det er kjent at spontan Ca-frigjøring kan indusere innadgående strømmer og svingninger i membranpotensialet, noe som resulterer i utløst arytmi (4-7). De observerte forstyrrelsene i Ca-håndtering kan derfor, i det minste delvis, forklare patogenesen av CPVT forbundet med genetiske defekter som resulterer i enten redusert Ca-bindingsaktivitet (16) eller reduserte ekspresjonsnivåer AV CSQ2 (17).

Sammenligning Med Tidligere Studier I Transgene Mus. Våre funn skiller seg fra tidligere resultater oppnådd hos transgene mus som overuttrykker CSQ2 (14, 15). I disse studiene økte EN 10 til 20 ganger overuttrykk AV CSQ2 SR Ca lagringskapasitet for isolerte hjerte myocytter; luminal Ca var imidlertid ikke tilgjengelig for frigjøring, noe som førte til deprimerte globale og lokale Ca-frigjøringssignaler. Disse endringene i Ca håndtering ble ledsaget av flere strukturelle, funksjonelle og biokjemiske endringer på cellulære og subcellulære nivåer og utvikling av hjertehypertrofi og svikt. På den annen side opprettholder denne studien CSQ2 proteinnivåer nærmere fysiologiske nivåer under akutte snarere enn kroniske forhold; dermed vil disse dataene sannsynligvis mer nøyaktig gjenspeile de direkte fysiologiske konsekvensene av endringer I CSQ2-proteinnivåer på intracellulær Ca-håndtering. Disse resultatene fremhever de potensielle problemene ved å tolke effektene av konstitutiv høyt nivå ekspresjon av proteiner i transgene dyremodeller og verdien av komplementære studier i mer akutte innstillinger.

Konklusjon. Som konklusjon har VI funnet UT AT CSQ2 er en viktig determinant av SR-evnen til å lagre Og frigjøre Ca i hjertemuskelen. CSQ2 ser ut til å fungere som et reservoar For Ca som er lett tilgjengelig for CICR og også som en aktiv Ca-buffer som modulerer lokal Luminal Ca-avhengig lukking Av RyRs. SAMTIDIG stabiliserer CSQ2 cicr-mekanismen ved å bremse funksjonell oppladning AV sr Ca-butikker. Unormal repriming oppførsel Av Ca-release kanaler kan utgjøre, eller bidra til, ventrikulære arytmier assosiert med mutasjoner I CSQ2 genet.