Soppen Candida guilliermondii er utbredt i naturen, inkludert den humane mikrobiota i hud-og slimhinneoverflater.22 selv om denne arten viser redusert virulens i forhold Til Andre Candida-arter, 3 er det for tiden ansett som et fremvoksende patogen, med en stor forekomst i Latin-Amerika.18C. guilliermondii har blitt anerkjent som det etiologiske middel til et bredt spekter av kliniske infeksjoner, inkludert disseminerte, hovedsakelig hos immunkompromitterte pasienter, 22 og nosokomiale utbrudd hos kirurgiske pasienter med intravaskulære enheter.13 for tiden inkluderer den anbefalte behandlingen for invasiv candidiasis hos nøytropene pasienter caspofungin (CFG) eller micafungin (mfg) som førstelinjeterapi, liposomal amfotericin B (LAMB) og anidulafungin (AFG) som alternativer, mens flukonazol (FLC) kun anbefales når mottakelighet for dette legemidlet er bekreftet.23 imidlertid har flere studier vist At c. guilliermondii har en redusert følsomhet for FLC8,15,19, og terapeutisk svikt assosiert med isolater med høye amfotericin B (AMB) minimale hemmende konsentrasjoner (MICs) er rapportert.9,12,24 selv om nesten 90% av isolatene viser echinokandiner Mic lik eller lavere enn kliniske brytningspunkter (CBP) av følsomhet (2µ / ml), 17 ligner Andre Arter Av Candida, Som C. parapsilose, viser noen isolater Av C. guilliermondii Mic betydelig høy.8,15 tilgjengelige data vedrørende AFG-effekt ved invasiv candidiasis er begrenset, og den potensielle rollen til dette legemidlet i klinisk praksis er dårlig kjent.23 i denne sammenheng kan dyreforsøk spille en viktig rolle for en bedre forståelse av in vitro–in vivo korrelasjonen.11 derfor var vårt hovedmål å evaluere IN vitro og in vivo aktiviteter AV AFG mot forskjellige isolater Av C. guilliermondii, sammenligne resultatene MED DE AV AMB og FLC.
Materialer og metodersoppisolater
Fire kliniske isolater Av C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 og UTHSC 10-3207) ble brukt i in vitro-studien, og to av dem (UTHSC 11-685 og UTHSC 11-142) ble valgt for murine-modellen på grunnlag av deres forskjellige in vitro-følsomhet. Isolatene ble identifisert ved å sekvensere den interne transkriberte spaceren (DENS) region og D1-D2-domenene til rRNA, sammenligne sekvensene med de av typen stamme av denne arten.in vitro-studier in vitro-følsomheten for DE fire stammene TIL AMB, FLC og AFG ble evaluert ved hjelp av en referansebuljongmikrodilusjonsmetode, 6Candida parapsilosis ATCC 22019 og Candida krusei atcc 6258 ble inkludert som kvalitetskontroller.
Time-kill kurver ble utviklet for alle stammer i henhold til tidligere studier.5,20 kort sagt ble en lagerløsning av hver antifungal fremstilt, AMB (Sigma–Aldrich Co. St. Louis, usa) OG AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spania) ble oppløst i dimetylsulfoksid og FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spania) i destillert vann. Videre ble legemiddelfortynninger fremstilt i 9 ml STANDARD rpmi 1640 medium for å oppnå konsentrasjoner av 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 og 32µ / ml av hvert legemiddel. Isolatene ble subkulturert til 35 hryvnias C for 24 timer på potet dextrose agar (PDA) plater. Kulturer Av C. guilliermondii ble suspendert i steril saltvann og de resulterende suspensjonene ble justert til 5×106 kolonidannende enheter (CFU) / ml ved hemocytometertall og ved serieplating på PDA for å bekrefte levedyktighet. Fortynninger og kontroller (legemiddelfrie) ble inokulert med 1 ml av soppsuspensjonene, noe som resulterte i et startinokulum på 5×105cfu / ml og inkubert til 35°C. Det ble samlet inn et aliquot på 100µ fra hvert rør ved 0, 2, 4, 6, 8, 24, og 48 timer etter inokulering og fortynnet i destillert vann; 30 µ av dem ble dyrket på PDA-plater og inkubert ved 35°C i 48 timer for CFU/ml bestemmelse. EN REDUKSJON I cfu på 99,9% eller 3 log10-enheter sammenlignet med startinokulum ble ansett som soppdrepende, mens en reduksjon på
log10-enheter ble ansett som fungistatisk. Grensen for deteksjon var 50CFU / ml. All time-kill kurve studier ble utført i duplicate.In vivo studier
Mann av-1 mus (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spania) med en gjennomsnittlig vekt på 30g ble brukt i forsøket. Mus ble plassert i standardkasser med fri tilgang til mat og vann. Alle dyreprosedyrer ble overvåket og godkjent av Universitat Rovira I Virgili Animal Welfare And Ethics Committee.Mus ble nøytropen en dag før infeksjon med en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av 200 mg/kg cyklofosfamid (Genoxal; Laboratorios Funk Sa, Barcelona, Spania) pluss en intravenøs (i.v.) injeksjon av 5-fluorouracil (Fluorouracilo, Ferrer Farma SA, Barcelona, Spania) ved 150 mg / kg.10,14 på infeksjonsdagen ble mus smittet i. v. med 1×108CFU/dyr av hver Av De to stammene Av C. guilliermondii, UTHSC 11-685 og UTHSC 11-142, i 0,2 ml steril saltvann i den laterale halevenen.3,4
Grupper på åtte dyr ble tilfeldig etablert for hver stamme og stoff. Gruppene ble behandlet som følger: amfotericin b deoksykolat (AMBd) (Xalabarder Pharmacy, Barcelona, Spania) i doser på 0,8 mg / kg i.v. en gang daglig (QD); liposomal amfotericin b (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spania) ved 10 mg / kg i. v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spania) ved 25 mg/kg muntlig (p.o.) av gavage, to ganger daglig (BID); OG AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Storbritannia) ved 10 mg / kg kroppsvekt / dose i. p., QD. Alle behandlinger begynte 24 timer etter utfordring, og varte i 7 dager. Kontrollene fikk ingen behandling. For å forhindre bakterieinfeksjoner fikk alle musene 5 mg/kg dag ceftazidim subkutant fra dag 1 til 7 etter infeksjon. Mus ble sjekket daglig og ble euthanized på dag 8 etter infeksjon AV CO2 anoksi. Effekten av hvert legemiddel ble evaluert ved reduksjon av vevsbyrden og histopatologiske studier. Nyrer ble aseptisk fjernet, og en av dem ble veid og homogenisert i 2 ml steril saltvann. Serielle 10-fold fortynninger av homogenatene ble belagt på PDA og inkubert i 48 timer ved 35°C for CFU/g beregning. For histopatologistudien ble den gjenværende nyren festet med 10% bufret formalin, dehydrert, parafin innebygd og skåret i 2µ seksjoner, som ble farget med hematoksylin-eosin (H-E) og periodisk syre-Schiff (PAS) flekk for undersøkelse ved lysmikroskopi.Kolonitelling fra vev ble analysert Ved Hjelp Av Mann-Whitney U-test, Ved Hjelp Av Graph Pad Prism 4.0 For Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Når p-verdiene var under 0,05, ble forskjellene ansett som statistisk signifikante.
Resultaterin vitro-studier
MICs for AMB var 0,25–1Μ / ml, 0,06-0,25@g/ml FOR AFG og 0,5–1µ / ml FOR FLC. Etter cut-offs av følsomhet FOR AMB, FLC og AFG mot C. guilliermondii, 16 alle isolater var utsatt for de tre legemidlene. Kvalitetskontroll stammer susceptibilities var innenfor de aksepterte områdene.6
drepekinetikken TIL AMB viste en rask fungicid aktivitet som økte med legemiddelkonsentrasjon. Ved konsentrasjoner som tilsvarer MIC, viste dette stoffet en fungicid effekt mot tre av de fire isolatene som ble testet (Fig. 1). Denne aktiviteten startet umiddelbart etter inokulering ved konsentrasjoner over 1µ / ml, og det fungicide endepunktet ble nådd etter 4 timer ved 32@g / ml. AFG ved konsentrasjoner over 0,5 µ/ml viste fungicid aktivitet som startet etter 4 timers inkubasjon. Det fungicide endepunktet ble nådd ved inkubasjonstid på 12-24 timer ved 32µ / ml (Fig. 2). FLC viste fungistatisk aktivitet mot alle fire isolater (Fig. 3).
in vivo studier
LAM ved 10 mg/kg var det eneste stoffet som kunne redusere soppbelastningen i nyrer av mus infisert med hver av de to stammene, og var reduksjonen betydelig høyere enn for de andre terapiene (P≤0,04). AMBd og FLC var bare i stand til å redusere vevsbyrden hos mus infisert med stammen som viste de laveste Mikrofonene for disse to legemidlene, dvs. 0,25 µ / ml FOR AMB og 0,5 µ / ml FOR FLC (P≤0,008). VED AFG var soppbelastningsreduksjonen beskjeden og lavere enn For AMBd, og det reduserte signifikant vevsbelastningen i nyre bare med hensyn til kontrollgruppe FOR STAMME UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 og FLC 50; cP0. 05 versus AFG 10 og FLC 50.
den histologiske studien viste fokal infiltrering av soppceller i nyrer av ubehandlede dyr og hos mus behandlet Med AMBd, FLC eller AFG. Nyrer av mus behandlet MED LAM viste bare en mild soppinvasjon. Det ble heller ikke observert tegn på nekrose, inflammatorisk respons eller parenchyma-endringer i kontroller hos behandlede dyr (Fig . 5).
tilstedeværelse av soppinfiltrasjon (svart pil) i nyredelen av en kontrollmus infisert Med C. guilliermondii, 8 dager etter infeksjon (periodisk syre Schiff-farging, forstørrelse 1000×). Bar=10µ
Diskusjon
in vitro-studiene viste ikke redusert følsomhet For c. guilliermondii-isolater overfor FLC eller AFG. I samsvar med tidligere studier, tid-kill kurver AV AMB viste en konsentrasjonsavhengig fungicid aktivitet mot alle isolater, 4, 5, 7 og FLC viste en fungistatisk effekt uavhengig av konsentrasjonen testet.7 Det er kjent At AMBd utviser en høyere effekt enn lipidformuleringen, spesielt i nyre, når den administreres begge i samme doser.1 farmakokinetiske studier viste imidlertid at Etter administrering av 0,75 mg/kg AMBd var Cmax FOR AMB oppnådd i musserum 0,30 µ / ml.25 IMIDLERTID ER AMB MIC av en av de to isolatene som er testet, høyere enn denne verdien; derfor brukte vi en høy dose LAM FOR å nå høyere konsentrasjoner.1 faktisk var administrasjonen AV LAM ved 10 mg / kg effektiv for å redusere soppbelastningen av begge stammer. Dette korrelerte med drepingskurver, hvor AMB oppnådde sin fungicide aktivitet mot de to isolatene som ble testet in vivo, i konsentrasjoner på 1µ / ml. Så vidt vi vet er dette den første studien som forsøkte å etablere et forhold mellom drapskinetikken og den in vivo eksperimentelle effekten AV AFG og FLC mot kliniske isolater Av C. guilliermondii. Bare en tidligere studie på echinocandiner eksisterer, spesielt på caspofungin (CFG) i disseminert infeksjon Av C. guilliermondii. CFG ved 1 mg / kg var effektiv for å redusere nyresoppbelastningen hos mus infisert Med En stamme C. guilliermondii med en MIC på 8µ / ml, mens tidsmording viste at ingen fungicid aktivitet ble oppnådd ved konsentrasjoner på 64µ / ml.4 Omvendt viste vår studie en konsentrasjonsavhengig AKTIVITET AV AFG, som ved 32 hryvnias/ml hadde en fungicid aktivitet,som tidligere rapportert, 17 ved 24 timer og ved 8 hryvnias / ml. Tidligere studier rapporterte AFG-konsentrasjoner i serum og nyre på ca. 13µ / ml etter 7 dagers behandling med doser på 10 mg / kg.21 HER VAR AFG kun i stand til å redusere soppbelastningen i nyrer av nøytropene mus infisert med en av de to testede stammene, noe som ikke synes å være relatert til den lave AFG MICs-forskjellen mellom de to testede stammene (1 fortynning), noe som tyder på at responsen PÅ AFG-behandling er belastningsavhengig. PÅ SAMME måte VAR FLC også bare i stand til å redusere litt soppbelastningen i nyre av mus utfordret med en av de to stammene til tross for dosen administrert som når serumkonsentrasjoner over MICs, 2 som heller ikke var overraskende på grunn av sin fungistatiske aktivitet.som konklusjon viste studien vår HØYERE aktivitet og effekt AV LAM mot De To stammene Av C. guilliermondii, i motsetning til den dårlige effekten AV FLC og AFG. Videre studier med flere isolater Av C. guilliermondii som representerer ET bredere spekter AV AFG MICs bør imidlertid utføres for å vurdere om det finnes noen sammenheng mellom MIC-verdier og AFG-effekt.
Interessekonflikt
ingen å erklære.
