RNA-蛋白質複合体を同定するincPRINT法

生体内のRNA–蛋白質相互作用を系統的に同定するために、任意のタグ付き試験RNAと任意のタグ付き試験タンパク質との間の細胞相互作用を測定する方法を開発しました。 IncPRINTの原理は、ゲノム的に統合されたプラスミドからのMS2コートタンパク質（MS2CP）に融合したルシフェラーゼ検出器を安定的に発現するHEK293T細胞におけるMS2タグ付き試験RNAとFLAGタグ付き試験タンパク質の一過性の二重発現である（図。 1). 試験ＲＮＡは、ＭＳ２−ＭＳ２ＣＰ相互作用を介してルシフェラーゼ検出器に連結され；ＲＮＡ−ルシフェラーゼ複合体は、抗ＦＬＡＧ抗体によって細胞溶解物から免疫沈降されたＦＬＡＧ 1). ＤＮＡによって架橋された間接的なＲＮＡ−タンパク質相互作用は、細胞溶解ステップの後のＤｎａｓｅ処理によって排除される。 各ＲＮＡ−タンパク質相互作用を検出するために、試験フラグ標識タンパク質と共精製されたＲＮＡ−ＭＳ２を、定量可能なルシフェラーゼ発光によって測定する（図 1). 試験タンパク質発現レベルを制御するために、試験タンパク質の存在量を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された第２の抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡに 1). IncPRINT法はスケールが柔軟で、低スループットまたは高スループットのアッセイとして使用できます。 細胞RNA-タンパク質相互作用の体系的、高スループット同定を可能にするために、我々は∼3000既知のRBPsを含むhuman1500ヒトフラグタグ付きタンパク質のカスタマイズされた 10,11)、≥1300転写因子12、および≥170クロマチン関連タンパク質。 タグ付けされたタンパク質含量は、所望の実験設定に適合するように適合させることができる。

incPRINTは、細胞RNA–タンパク質相互作用を確実に検出します

incPRINTを確立するために、我々はXist(A)13と呼ばれるaリピートと呼ばれるlncrna Xistの≤1kb保存領域を用いた一連の小規模実験を行った。 いくつかのXist(A)-タンパク質相互作用が十分に確立されている7ので、彼らは私たちの最初のincPRINT実験でコントロールとして役立った。 本発明者らは、Ｘｉｓｔ（Ａ）−ＭＳ２を発現する構築物を設計し、ｘｉｓｔ（Ａ）−ＭＳ２ＲＮＡが、以前に同定されたＸｉｓｔ結合タンパク質の選択されたセットと相互作用する能力をアッセイ 非識別性ポリ（Ａ）結合タンパク質ＰＡＢＰＣ３をＲＮＡ発現の制御に使用し、ｅｇｆｐ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を陰性対照として使用した。 ＩＮＣＰＲＩＮＴ発光は、ＸＩＳＴ（Ａ）−ＭＳ２のＳＰＥＮ、ＲＢＭ１ ５、ＲＢＭ１ ５Ｂ、ＹＴＨＤＣ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＳＲＳＦ７、およびＲＡＬＹとの特異的相互作用を検出したが、ＨＮＲＮＰＵは、完全長Ｘｉｓｔに結合するが、特異的にはＸｉｓｔ（Ａ）７には結合しないと報告され、ＥＧＦＰは 2a）。 Ｒｎａｓｅによる処理は、ルシフェラーゼによって測定されたＲＮＡ−タンパク質相互作用シグナルを廃止したが、ＥＬＩＳＡによって検出された試験タンパク質の発現は、大部分が変化しなかった（図１）。 図２Ａ、補足図２Ｂ、補足図２Ｂ。 図1a)に示すように、タグ付けされたタンパク質とルシフェラーゼ検出器との間の相互作用がRNAによって架橋されたことを示している。

テストされたRNAをタグ付けするために使用されるMS2stemループの数を最適化するために、Xist(A)を二つ、四つ、六つ、十または24MS2stemループと融合させ、対照タンパク質のセットとの相互作用を小規模なincPRINT実験で試験した。 発光強度の増加は、ＥＧＦＰ対照への結合の顕著な増加を伴わずに、最大１ ０個のｓｔｅｍループまでのＭＳ２ｓｔｅｍループの数の増加と直接相関した（補足図１）。 1b）。 したがって、すべての後続のincPRINT実験では、Rnaは十MS2ステムループでタグ付けされました。

incPRINTによって検出されたRNA–タンパク質相互作用が実際に細胞内で発生したか、細胞lysis16、17、18後にin vitroでのみ発生したかどうかを決定するために、二つの独立した実験からのルミネセンシグナルを測定し、比較した。 最初の実験では、Ｘｉｓｔ（Ａ）−ＭＳ２ＲＮＡおよびＦＬＡＧタグ付き試験タンパク質を、上記と同じ細胞集団中で共トランスフェクトした。 第二の実験では、Ｘｉｓｔ（Ａ）−ＭＳ２ＲＮＡおよびＦＬＡＧタグ付き試験タンパク質を、２つの異なる細胞集団中で別々にトランスフェクトし、細胞溶解工程の後にのみ一緒にプールして、ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成を排他的にｉｎ ｖｉｔｒｏで可能にした（補足図１）。 1c）。 本発明者らは、Ｘｉｓｔ（Ａ）−ＭＳ２ＲＮＡおよびＦＬＡＧタグタンパク質が共トランスフェクトされたときに、相互作用が優先的に検出されることを見出した（標準的なＩｎｃＰｒｉｎｔ条件； 2b）。 これらの結果は、incPRINTによって相互作用シグナルが検出されたときはいつでも、細胞内で形成されたRNA–タンパク質複合体に由来することを示唆しているが、細胞溶解後のRNA–タンパク質複合体の会合は、incPRINT特異的条件下では無視できる背景として現れた（図。 2b）。 一緒に取られて、これらの実験は、incPRINTは発光読み出しを使用して細胞RNA–タンパク質相互作用を測定することを確立します。

RNA-タンパク質相互作用のハイスループット検出

RNA–タンパク質相互作用の体系的な同定のためのincPRINTのスケーラビリティをテストするために、我々は–3000フラグタグ付きヒトタンパク質（1500以上の既知のRbps10、11、1300以上の転写因子12、および170以上のクロマチン関連タンパク質を含む）のカスタマイズされたライブラリをxist（A）-MS2で尋問した。 IncPRINT同定されたRNA-タンパク質相互作用の信頼性を強化するために、すべての相互作用は、二つの発光（RNA–タンパク質相互作用強度）と各試験RNA–タンパク質 不十分なレベルで発現されたタンパク質を除外した後（”方法”のセクションを参照）、相互作用データを2405タンパク質について分析した。 ＩｎｃＰｒｉｎｔの再現性は、両方の発光についての生物学的重複の相関スコアを計算することによって評価された（図１ ０Ａ）。 2c;R2=0.Ｅｌｉｓａシグナル（図８ ７）およびＥＬＩＳＡシグナル（図８ ７） 2d;R2=0.99)。 注目すべきことに、発光値とＥＬＩＳＡ値との間に相関は検出されず、相互作用強度がタンパク質発現レベルの単なる反射ではなかったことを示している（図 2e）。 要約すると、我々のデータは、incPRINTが再現可能に細胞内のRNA-タンパク質相互作用を測定するスケーラブルな高スループット方法であることを示しています。

incPRINTは、低発現Rnaのプロテオームを識別します

次に、incPRINTは堅牢に低内因性レベルで発現転写物と相互作用するタンパク質を同定することがで 低コピー数Rnaに関連するタンパク質の同定は、一般的にRNA精製の効率が低く、質量分析に必要な大量の材料のために、RNAアフィニティキャプチャ-MSアプロー Firreは染色体間で高次核アーキテクチャを調節する機能的に重要なlncRNAであり、かなり低い内因性の存在量（異なるマウス組織間のRNA-Seqデータに基づいて、細胞当たり≥20分子）であるため、我々はincPRINTとそのRBPインターラクトームを評価した。 ＭＳ２によってタグ付けされた全長Ｆｉｒｒｅ転写物は、ＩｎｃＰｒｉｎｔに使用されたＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞において、内因性ＦＩＲＲＥよりも４ ０倍以上高く発現された（補足図１ ４Ａ）。 2a）。 内因性転写１ ９について報告されているように、Ｆｉｒｒｅ−ＭＳ２は、核に優先的に局在化した（補足図１ ９）。 2b）。 約3000個のタンパク質のライブラリーを調べたところ、incPRINTは特定のタンパク質のセットをFirre相互作用因子として同定した（図。 一方、タンパク質の大部分はＦｉｒｒｅと相互作用しなかった（図３Ａ、赤い点；補足データ１）。 3aの灰色の点;補足データ1）。 重要なことに、incPRINTは、既知および新規Firre相互作用タンパク質の両方を同定した。 Ｆｉｒｒｅに結合し、その機能にとって重要であることが２つの独立した研究によって以前に報告されたＣＴＣＦおよびＨＮＲＮＰＵもまた、ＩｎｃＰｒｉｎｔによって同定された（図２ ０）。 3a）。 新規Firreインターアクターの結合を検証するために、我々はエンコードeCLIP data21を分析しました。 ７つのＩＮＣＰＲＩＮＴで同定されたＦｉｒｒｅ相互作用Ｒｂｐについて入手可能なＥＣＬＩＰデータは、Ｋ５ ６ ２細胞株におけるＦｉｒｒｅへのそれらの結合を確認し、ＩＮＣＰＲＩＮＴ法をさらに検証した（補足図１）。 2c;補足データ2)。 核組織におけるFirreの役割と一致して19、incPRINTによって同定されたFirreインターアクターセットは、CHD1、POU5F1、JARID2、EPC1、SATB1、MECP2、AEBP2、およびCTCF（補足データ1）を含むクロマ タンパク質ドメイン解析は、FIRRE相互作用タンパク質がRNA認識モチーフ（RRM）のために有意に濃縮されたことを示した（図。 3b;補足データ3)。

INCPRINTが低内因性レベルのRNAに結合するタンパク質を正常に同定するためにRNAの過剰発現が必要かどうかを判断するために、上記のような過剰発現からHEK293t細胞における内因性FIRREに匹敵するレベルまでの異なる濃度のFirre-MS2でタンパク質のセットを試験した（補足図）。 2d、e）。 ＲＮＡの過剰発現は、背景スコアからのそれらのより良好な分離を可能にするより高い相互作用スコアをもたらしたが、Ｆｉｒｒｅ−ＭＳ２の希釈物を使用したとき、ルシフェラーゼシグナルは、背景シグナルよりも頑健に検出可能であった（補足図１）。 2d）。 重要なことに、このシグナルは、試験タンパク質発現レベルと関連していなかった（補足図１ ０Ａ）。 2e）。 一緒に、これらのデータは、低内因性レベルで発現転写物に関連付けられているタンパク質を同定する際にincPRINTの有用性を示しています。

incPRINTは、RNA領域特異的相互作用パートナーを識別します

多くのlncrnaは、離散RNAドメイン1、5に特定のRBPsの結合を可能にする、モジュラー足場として機能するため、我々はincPRINTは、RNAドメイン特異的相互作用の同定を可能にするかどうかをテストしようとしました。 理想的な原理証明分子は、哺乳類のX染色体不活性化（XCI）22,23におけるその重要な役割、およびそのモジュラー構造と機能を考えると、lncRNA Xistです。 17kbの長いXist転写産物には、遺伝子サイレンシングの開始（aリピート）、X不活性状態（FリピートおよびBリピート）の維持、適切な染色体局在およびXist（CリピートおよびEリピート）の局所蓄積13,24,25,26,27,28,29,30,31,32など、XCIプロセス中に異なる機能を果たすいくつかの保存された配列領域（リピートAからFと呼ばれる）が含まれている。 4a）。 さらに、いくつかの独立した研究は、以前に同定され、フルレングスXist7と機能的なタンパク質相互作用のセットを検証しています,14,15,26,28,33,34,35. 我々は、マウスＸｉｓｔの３つの保存領域、すなわち、Ｘｉｓｔ（Ａ）、Ｘｉｓｔ（Ｆ）、およびＸｉｓｔ（Ｃ）にＩｎｃＰｒｉｎｔを適用しようとした（図３）。 4a）。 ＩＮＣＰＲＩＮＴに使用されるＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現された場合、各Ｘｉｓｔ−ＭＳ２断片は、内因性Ｘｉｓｔと比較して異なるレベルの発現を示し、Ｘｉｓｔ（Ａ）の６ ０倍以上の増加からＸｉｓｔ（Ｃ）の近 3a）。 全ての個々のＸｉｓｔ−ＭＳ２断片は、それらの完全長の内因性の対応物と同様に、核に優先的に局在化された（補足図１ ０Ａ）。 3b）。 各Xist領域（すなわち、Xist（A）、Xist（F）、およびXist（C））は、-3000タンパク質の私たちのライブラリで尋問されました。 異なるレベルで表現された個々のＸｉｓｔ領域にわたる信号を比較するために（補足図４）。 3c)、各Xist領域の相互作用スコアをMS2RNA結合データを使用して正規化した(補足データ4)。 正規化のために、MS2RNAデータセット内のトップランキングルシフェラーゼスコアを持つ200タンパク質のセットは、すべてのMS2タグ付きRnaの共通結合 次に、共通結合剤を各データセットで同定し、それらの中央値相互作用スコアを試験した各RNAについて計算し、各データセット内の生の発光強度を正規化 特に、多くのＲｂｐがｍｓ２タグ内にも存在する低複雑性ＲＮＡモチーフ３ ６を認識し、ＭＳ２へのタンパク質結合が試験ＲＮＡとの潜在的な機能的相互作用を排除しな Ｆｉｒｒｅと同様に、本発明者らは、大部分のタンパク質が試験されたＸｉｓｔ断片のいずれにも結合しないことを見出した（図１ ０Ａ）。 一方、タンパク質の特定のセットは、各個々のＸｉｓｔ領域と相互作用することが同定された（図４Ｂ−ｄ、灰色の点；補足データ４）。 4b–dの赤い点;補足データ4）。 重要なことに、incPRINT同定されたXist相互作用タンパク質の中で、我々は完全長転写7、14、15（図に示される）に結合するために以前の研究で同定されたXistのよく知られた相互作用パートナーを発見した。 図4b–d、補足表1)。 IncPRINTで同定されたタンパク質のセットと、各質問されたXist領域の相互作用スコア（補足データ4）を比較すると、各Xist断片は対応する領域に特異的なタンパク質のセットと相互作用し、3つのXist領域すべてに結合するrbpsのわずかな画分であることがわかりました（図4）。 4e）。 従って、ＸＩＳＴの３つの保存された領域にＩｎｃＰｒｉｎｔを適用することは、完全長Ｘｉｓｔ転写物に結合すると予め決定されたＲｂｐの特定のＲＮＡ領域の同定および割り当てを可能にした７、１ ４、１ ５（図１ ５）。 図4e;既知のXist相互作用タンパク質が右に示されている）。 例えば、ＩＮＣＰＲＩＮＴは、ＳＰＥＮをＸｉｓｔ（Ａ）特異的相互作用因子として同定した（図１）。 4e),以前の発見を確認します7,8. 同様に、ＲＢＭ１ ５、ＲＢＭ１ ５ＢおよびＹＴＨＤＣ１は、ＩｎｃＰｒｉｎｔによって、Ｘｉｓｔ（Ａ）およびＸｉｓｔ（Ｆ）と特異的に相互作用するが、Ｘｉｓｔ（Ｃ）とは特異的に相互作用しないことが同定され、Ｘｉｓｔ７、９の５’末端への 4e）。 さらに、本発明者らは、以前にＸｉｓｔ局在化に関与していることが示されたＨＮＲＮＰＵ（ＳＡＦ−Ａとしても知られる）とのＸｉｓｔ（Ｃ）特異的相互作用を同定した７、１ ４、３ ３（図７）。 図4e、補足表1)。 ＲＮＡ領域特異的Ｘｉｓｔ−タンパク質相互作用を検証するために、１ ４個のＩｎｃＰｒｉｎｔで同定されたタンパク質（そのうちのいくつかは新規Ｘｉｓｔ相互作用Ｒｐｂであり、Ｋ５ ６ ２系統のＸＩＳＴへの結合を確認した）のために利用可能なＥＣＬＩＰデータ２ １をエンコードした（補足図１）。 3d;補足データ2)、さらに我々の方法の特異性を裏付ける。 三つのＸｉｓｔ領域の蛋白質インターラクトーム間の機能的差異を遺伝子オントロジー（Ｇ Ｏ）項濃縮解析により確認した。 個々のXist領域について報告された差動機能と一致して、XIST(A)-およびXist(F)-関連タンパク質は、RNA処理に関与するRBPsのために濃縮されたが、Cリピート領域は優先的に転写調節に関与するDNA結合タンパク質と相互作用した（補足図。 3e、f）。 タンパク質ドメイン解析は、GO解析と一致して、SPOC(Spen paralogおよびortholog C末端)およびRRMタンパク質ドメインに対してXist(A)相互作用タンパク質が濃縮され、RRMドメインに対してXist(F)相互作用タンパク質が濃縮され、Xist(C)相互作用タンパク質は特に濃縮されていないことを示した(図1)。 4f;補足データ3)、各Xist領域に対するincPRINT同定されたタンパク質セットの特異性をさらに強調している。 要約すると、incPRINTは正常に既知のXist-タンパク質相互作用を取得し、新規RBPsを発見しました。 モジュラー lncRNAの個々の保存された領域と相互作用するタンパク質の特定のセットを識別することにより、我々はincPRINTはRNA-タンパク質相互作用の領域特異的

incPRINTは、機能的なRNA–タンパク質相互作用を識別します

Xistは、XCI中の遺伝子サイレンシングでよく特徴付けられた細胞機能 焦点は、３つの試験されたＸｉｓｔ領域全てと相互作用するＺＺＺ３タンパク質、およびＸｉｓｔ（Ａ）およびＸｉｓｔ（Ｆ）領域へのより特異的な結合を示すＲＢＭ６にあった（図２Ｂ）。 4e）。 最初に、我々はマウス胚性幹（ES）細胞の両方のタンパク質とXist共沈をテストすることにより、内因性条件下でRBM6とZZZ3とXistの相互作用を確認しました。 タンパク質は、分化31、37、38、39の非存在下でXCIをトリガ、ドキシサイクリン誘導Xist発現を可能にする多型TX1072ES細胞株でHAタグ付けされました。 ドキシサイクリンによるＸｉｓｔの誘導および細胞のＵＶ架橋後のＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）、続いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ｒｂｍ６およびＺＺＺ３タンパク質によるＸｉｓｔ転写物の有意な濃縮が同定され、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの相互作用が確認された（図１）。 5a、b）。 特に、incPRINTはまた、Rbm6がFirreと相互作用していると同定した。 ＲＩＰ ｑＲＴ−ＰＣＲは、Ｒｂｍ６とＦｉｒｒｅの特異的相互作用を検出したが、ＺＺＺ３との特異的相互作用は検出しなかったので、内因性条件下でＦｉｒｒｅ−ＲＢＭ６の結合を確認し、我々のＩＮＣＰＲＩＮＴ結果を 5a、b）。