ケーススタディ：電圧ゲートナトリウムチャネルの阻害剤の発見
上記で概説したイオンチャネル創薬に関連する問題を説明する方法として、この記事の残りの部分は、慢性神経障害性疼痛を治療するための電圧ゲートナトリウムチャネル阻害剤の同定に焦点を当てたケーススタディについて説明する。 苦痛の処置は深刻な医学問題であり、この条件のための新しい療法を開発する製薬産業に主要な努力があります。 特に、国際疼痛研究協会（IASP）によって「末梢神経系の原発性病変または機能不全に起因する慢性疼痛」と定義される神経因性疼痛の治療は、依然として、主要な満たされていない医学的必要性のままである。
電圧ゲートナトリウム（Nav1）チャネルは、痛みのシグナル伝達に必要な感覚神経活動電位の発生と伝播に重要な役割を果たすことは明らかである。 Nonsubtype選択的なナトリウムチャネルのブロッカーのローカル適用は、novocaineのような、伝導のブロックを通して完全な痛みの軽減を提供します。 ただし、痛みの軽減へのこのアプローチは非常に少数の適用にナトリウムチャネルが中心、CNS、骨格筋およびnonnociceptive感覚的なニューロンの伝導にまた重大であるので、歯科プロシージャのような限られています、限られています。 Nav1スーパーファミリーは10人のメンバーで構成されている（Yu and Catterall、2004）。 これらのサブタイプ、Nav1.1、Nav1.3、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、およびNav1.9のうちの7つは、末梢神経系（PNS）に存在する。 これらのうち、Nav1.7、Nav1.8、およびNav1.9は、侵害受容ニューロン、およびNav1で主に発現されています。3は主に胚性であるが、傷害後の成人PNSでは上方調節される。 この限られた発現パターンは、これらのサブタイプは、新規鎮痛剤の開発のための魅力的なターゲットになります。 しかし、疼痛シグナル伝達、特に神経因性疼痛シグナル伝達へのそれらの相対的寄与は不明であり、疼痛の異なる病因および感覚的性質によって異な
一つのNav1サブタイプの分子選択性がない場合、ナトリウムチャネル依存性インパルス伝導を維持しながら、特定の立体配座状態でNav1チャネ このタイプの州依存した阻止はlamotrigineおよびリドカインのようなanticonvulsantsそしてantiarrhythmicsを、妨げるナトリウムチャネルと見られる治療上の窓のための基礎です。 これらの薬物は、開いた状態および／または不活性化された状態のチャネルに対して、休止状態の閉じたチャネルよりも高い親和性を有する。 この阻害機構は、急速に発火した組織または部分的に脱分極した組織における結合を促進する。 Neuropathic苦痛は脱分極、subanesthetic線量で全身的に管理されるリドカインの臨床効力によって支えられる仮説の傷害誘発区域から起こると考えられるのでこの抑制 さらに、非サブタイプ選択的、状態依存性ブロックは、Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8、またはNav1の個々のノックアウト以来、最大の有効性を得ることができる。9は、神経因性疼痛シグナル伝達におけるこれらのチャネルのいずれかの支配的な役割のための説得力のある証拠を提供していませんでした。
この根拠に基づいて、nav1.7、Nav1.5（一次心臓ナトリウムチャネル）およびNav1.8について関心のある化合物を並行して試験することにより、分子選択性を監視しながら、最初に非サブタイプ選択的、状態依存性Nav1阻害剤を追求することが決定された。
膜電位ベースのアッセイは、組換え細胞株で安定に発現したnav1.8上の≥200,000化合物をスクリーニングするために使用されました。 このＨＴＳアッセイは、Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｒｉｓｔ ｅ ｔ ａ ｌ．）によって開発された膜電位感受性色素対の２つのメンバー間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいていた（Ｐｒｉｓｔ ｅ ｔ ａ ｌ．）。, 2004). Nav1.8チャネルは、細胞外ナトリウムの非存在下で試験化合物と化学アゴニストデルタメトリンとpreincubatedました。 ナトリウムのその後の添加は、膜脱分極をもたらし、Nav1ブロックは、その細胞脱分極プロセスとの干渉として定量化されました。
nav1の最初の画面が。8は様々なヒットをもたらし、単一の化合物だけが薬用化学の努力のための実行可能なリードと考えられていました。 このリードにリソースをコミットする前に、化合物、BPBTS（N-{メチル}-N’-（2,2′-ビチエン-5-イルメチル）スクシンイミド）と呼ばれる二置換スクシンイミドは、手動全セル電圧ク BPBTSは、同様の効力を有するすべてのNav1サブタイプを阻害することが見出され、阻害は膜電位および刺激頻度に依存していた。 この阻害機構は，休止状態のチャネルと比較して，開放状態および不活性化状態のチャネルに対する化合物の高い親和性と一致した。 さらに、BPBTSは臨床的に使用された抗けいれん薬および抗不整脈Nav1遮断薬よりも二桁強力であり、Nav1.8、Nav1.7、Nav1.5、およびNav1.2の不活性化状態を阻害し、Ki値は0.09、0.15、0.08、および0.14μ m、kr値は1.5、1.3、0.3、および1.2μ mであった（Priest et al., 2004).そのように、BPBTSは薬用化学にとって魅力的なリードでした。
; その主な負債は貧弱な薬物動態プロファイルである。 BPBTSの類似体だけでなく、公開されたNav1阻害剤をプロファイリングの過程で、膜電位ベースの蛍光スクリーニングアッセイを使用して、蛍光アッセイで、電気 これらの不一致は、これらの化合物とnav1.7チャネルを開くために使用されるアゴニストveratridineとの間の相互作用にトレースされました。 続いて、ｎａｖ１チャネルを生理的細胞外ナトリウム濃度の試験化合物で予めインキュベートし、アゴニスト添加によりＮａｖ１依存性脱分極を開始するように蛍光アッセイを修正した（図１）。 1). この修飾アッセイで測定されたチャネル阻害力は、Ｎａｖ１阻害剤の多くの構造クラスにわたって電気生理学によって決定された不活性化状態阻害と非常によく相関した（Ｆｅｌｉｘ ｅ ｔ ａ ｌ．，ＮａＶ１阻害剤の多くの構造クラスにわたって決定された不活性化状態阻害）。 ら、２ ０ ０ ４；Ｌｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2006).Nav1.7チャネルの機能的、膜電位FRETベースのアッセイ。
Nav1.7チャネルの機能的、膜電位FRETベースのアッセイ。
細胞を過分極することができ、他のイオン伝導度の非存在下では、Nav1.7チャネルの異種発現は、細胞休止膜電位でほとんどのチャネルが非導電性不活 ベラトリジンの添加による高速不活性化の除去は、チャネルの平衡を導電性の開いた状態にシフトさせ、ナトリウムの侵入が細胞の脱分極につながることを可能にする。 電圧の変化は、一対のＦＲＥＴ電圧検出色素、クマリンおよびオキソノールを用いて監視することができる。 細胞の脱分極は、膜全体のオキソノールの分布を変化させ、FRETシグナルの変化を引き起こす。 Nav1.7阻害剤の存在下では、チャネル平衡は、ベラトリジン修飾のために利用可能になるチャネルの数を減らし、アゴニスト誘発性フレットシグナル フレット信号のベラトリジン誘発変化の用量応答曲線は、nav1.7チャネルの少数の変更は、細胞の脱分極を引き起こすのに十分であることを示唆し、急
BPBTSの類似体は効力の最初の鉛を上回ることができなかったが、薬用化学は薬物動態プロファイルを改善することに成功し、最終的にtrans-N-{methyl}-N-methyl-N’-cyclopentane-1,2-dicarboxamide（CDA54）を生成し、44％の経口生物学的利用能、一時間の半減期、および14ml/分/kgのクリアランス率を生成した（Brochu et al., 2006). 神経障害性疼痛の二つのラットモデルでは、CDA54（10mg/kg、経口投与）が有意に44–67％によって神経損傷誘発行動過敏症を減少させた。 CDA54の同じ用量/血漿濃度は、急性侵害受容（ラットホットプレートアッセイ）、運動協調（ラットロトロッドアッセイ）、または心臓伝導（心血管犬で測定された電気 これらの特性は、臨床で使用されている現在のナトリウムチャネル遮断薬の特性とは対照的であり、ラットでは運動協調障害を引き起こし、ヒトでは全有効用量でCNSの副作用を引き起こす。 興味深いことに、経口投与時に、CDA54の脳対血漿比は0.03であった。 対照的に、臨床的に使用されるNav1遮断薬は、メキシレチンのための10より大きい血漿比に脳で、CNSに蓄積します。 CDA54で得られたこれらのデータは強く単独でPNSナトリウムチャネルの阻害は、神経因性疼痛の動物モデルで有効であることを示唆し、Nav1阻害剤のCNS
NAV1.7の阻害剤のスクリーニングに記載されている膜電位ベースのアッセイを用いたUHTSキャンペーンは、新規な1-ベンザゼピン-2-ワンチャネル阻害剤を発見した（Hoyt et al. ら、２ ０ ０ ７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007). 阻害剤のこのクラスは、定義された構造活性の関係を示し、in vivoで評価したとき、このシリーズのメンバーは、げっ歯類の神経因性疼痛およびてんかんモデルで経口的に有効であった。 重要なことに、このクラスの一部のメンバーは、Nav1.7チャネルの分子選択性を示した（Williams et al., 2007). 例えば、図２の化合物２が挙げられる。 2は高度に状態依存性であり、nav1.7とNav1.8とNav1.5よりもnav1.7に対して≥10倍選択的であった。 サブタイプ選択的ではないが、このクラスのNav1.7阻害剤の最も強力なメンバー（化合物1、BNZA；図10B）は、Nav1.7阻害剤のサブタイプ選択的ではないが、最も 2）をトリチウム化した。 BNZAは、組換えNav1.7チャネルに高親和性（1.6nMのKd）で結合する。 これは、Nav1.7に結合する高親和性リガンドの最初のデモであり、Nav1.7選択的化合物を検索するための貴重なスクリーニングツールを提供します。 1-ベンザゼピン-2-one構造シリーズで得られたデータは、Nav1ことを示唆している。7-選択的類似体を同定することができ、適切な薬物動態学的および薬物代謝特性を有するこのような化合物は、鎮痛剤として開発することができ、潜在的に神経障害性疼痛を治療するために使用される既存の薬物よりも改善された忍容性を示す可能性がある。 新規鎮痛薬としてのサブタイプ選択的ナトリウムチャネル阻害剤の開発の実現可能性の支持は、腹腔内に与えられた高親和性Nav1.8選択剤の最近の, 2007).
1-ベンザゼピン-2-One Nav1阻害剤。 二つの1-ベンザゼピン-2-one Nav1阻害剤の構造は、機能膜電位、FRETベースのアッセイで決定されるhnav1.5、hnav1.7、およびhnav1.8チャネルのためのそれらの効力 電気生理学的記録から決定されるように、hnav1.5およびhnav1.7チャネルの不活性化状態のためのこれらの化合物の推定効力も提示される。 化合物2のみがhnav1.7チャンネルの選択性を表示することに注意してください。 両方の化合物は、hnav1.8チャネルの弱い阻害剤である。
サブタイプ選択的ナトリウムチャネル阻害剤を検索する潜在的な代替アプローチは、チャネルゲート機構を標的とする化合物をスクリーニングすることであろう。 いくつかのペプチドは、以前にナトリウムチャネルのゲーティングを変更することが示されているが、いくつかの小分子、特に阻害剤は、このように機 このような薬剤の１つは、Ｔａｒａｎｔｕｌａ ｖｅｎｏｍから精製された３ ０−アミノ酸ペプチドであるＰｒｏｔｘ−ＩＩであり；このペプチドは、ナトリウムチャネルを遮断し、Ｎａｖ１．, 2007). Ｐｒｏｔｘ-ＩＩはナトリウムチャネルの静止状態に結合し，チャネル活性化の電圧依存性をより脱分極電位にシフトさせる。 強力な脱分極は、このタイプのゲーティング修飾ペプチドの特徴であるチャネル阻害を克服する。 ゲーティング修飾ペプチドの小分子模倣物を同定するための一つの可能な戦略は、生物学的に活性な形で放射性標識ProTx-IIに、異種細胞株で発現Nav1.7チャ ProTx-IIの結合を調節する小さい分子のためのスクリーニングは膜に仕切り、それによりチャネルの開始を防ぐゲートのかいの動きと干渉するチャネルの抑制剤の新しいクラスを明らかにすることができる。 このタイプのUHTの追加の利点は、高濃度の試験化合物を採用することができることであり、多くの小有機分子の高濃度で典型的に起こる蛍光干渉のた いくつかのゲーティング修飾ペプチドは、スーパーファミリー内の特定のチャネルに固有の領域に結合することを考えると、サブタイプ選択的阻害剤は、このような戦略を使用して同定される可能性があります。
