再構成のためのタンパク質成分の調製

翻訳因子およびaaRSを含む大腸菌翻訳装置の成分は、前述のように調製された46。 RNaseP成分、M1RNA、およびC5タンパク質の調製も、前に記載されたように調製した29。 我々は、C5タンパク質のプロトコルを80％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させ、バッファー A（50mM酢酸ナトリウムpH6.5、5mM EDTA、0.25M NaCl、および7mM2-メルカプトエタノール）に対して透析することによって溶解することによって変更した。 得られた沈殿を遠心分離により回収し、50mM HEPES-KOH pH7.6、100mM Nh4Cl、6M尿素、および10mMジチオトレイトール(DTT)を含む緩衝液Bに対して透析することによ Ｃ５タンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、回収し、緩衝液Ｄ（５ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯ Ｈ ｐＨ７．尿素、7mm2-メルカプトエタノール）を、次いで尿素を含まない緩衝液dに対してさらに透析する。 得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ｋＤａ（＃ＵＦＣ８ ０ ０ ３ ２ ４、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して濃縮し、５ ０％グリセロールを含有する尿素を含まない緩衝液Ｄに対して透析した。 精製されたC5タンパク質は-30℃で保存された。

ivttrnaの修飾酵素の調製

ivttrnaの修飾酵素は、以下のようにして調製した。 大腸菌ａ１ ９ゲノムから、適切なプライマーを用いて、Ｔｓａｂ、Ｔｓａｃ、Ｔｓａｄ、Ｔｓａｅ、Ｔｒｍｄ、Ｇｌｙａ、Ｍｎｍｃ、Ｍｎｍｅ、およびＧｉｄａの大腸菌遺伝子を増幅した（補足データ５）。 Ｔｓａｃ、Ｔｓａｄ、Ｔｓａｅ、Ｇｌｙａ、Ｍｎｍｃ、Ｍｎｍｅ、およびＧｉｄａのための増幅された遺伝子を、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＳＵＭＯタンパク質、および修飾酵素がタンデム的に配置された、小さなユビキチン様修飾（ＳＵＭＯ）タンパク質−融合 TsaBおよびTrmDの遺伝子は、His-tag融合タンパク質としてpet15bにクローニングされた。 全ての遺伝子をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（＃Ｅ２ ６ １ １，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）でクローニングした。 得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換し、1L LB培地中で37℃で0.6〜1.0のOD660に成長させた。 過剰発現は、Ｔｓａｂ、Ｔｓａｃ、Ｔｓａｄ、Ｔｓａｅ、およびＴｒｍｄについては１ｍ Ｍ、またはＧｌｙａ、Ｍｎｍｃ、Ｍｎｍｅ、およびＧｉｄａについては０.１ｍ Ｍの最終濃度へのＩＰＴＧの添加によって誘導された。 37℃で3時間培養した後、細胞を回収した。 ＴｓＡｂ、Ｔｓａｃ、Ｔｓａｅ、Ｔｒｍｄ、およびＭｎｍｅ過剰発現細胞を、４ ０ｍＬの溶解緩衝液（５ ０ｍ Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯ Ｈ、ｐＨ７.６、１Ｍ Ｎ Ｈ４Ｃｌ、１ ０ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、および７ｍ Ｍ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、超音波処理によ 得られた溶解物を遠心分離し、上清を回収し、５ｍＬの完全Ｈ Ｉ ｓ−ｔａｇ精製樹脂（＃０ ５ ８ ９ ３ ８ ０ １ ０ ０ １、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と１時間ｒｏｔａｔｏｒで混合した。 樹脂を溶解緩衝液100mLで洗浄し、次いでタンパク質を溶出緩衝液25mL(50mM Hepes-KOH、pH7.6、400mM KCl、10mM Mgcl2、400mMイミダゾール、および7mM2-メルカプトエタノール)で溶 ＴＳＡＢおよびＴｒｍｄを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ｋＤａ（＃ＵＦＣ８ ０ ０ ３ ２ ４、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）によって濃縮し、次いでストック緩衝液（５ ０ｍ Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯ Ｈ、ｐＨ７）に対して透析した。６、５ ０ ０ｍ Ｍ Ｋｃｌ、１ ０ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、７ｍ Ｍ２−メルカプトエタノール、および３ ０％グリセロール）。 Ｔｓａｃ、Ｔｓａｅ、およびＭｎｍｅについて、Ｕｌｐ１（＃１ ２ ５ ８ ８ ０ １ ８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を回収画分に加えて最終濃度２ ３μ ｇ／ｍｌにして、Ｈｉｓタグ付きＳＵＭＯタンパク質を除去した。 分画を切断緩衝液（50mM Hepes-KOH、pH7.6、100mM KCl、および7mM2-メルカプトエタノール）に対して一晩透析したが、切断緩衝液はMnmE調製のために500mM KClを含んでいた。 透析された試料を、ｒｏｔａｔｏｒを用いて５ｍｌの完全Ｈ Ｉ ｓ−ｔａｇ精製樹脂と再び混合した。 次いで、修飾酵素を含むフロースルー画分を収集した。 回収された試料を、ＴｓａｅについてはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ｋＤａ、またはＴｓａｃおよびＭｎｍｅについてはＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１ ０ｋＤａ（＃ＵＦＣ９ ０ １ ０ ２ ４、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）によって濃縮した。 Ｇｌｙａ調製のために、全ての緩衝液は１ ０％グリセロールを含み、他の手順はＭｎｍｅ調製と同じであった。 ＴＳＡＤは、超音波処理後に不溶性であることが見出された。 したがって、タンパク質を４℃で２ ０，４ ０ ０×ｇで４ ５分間遠心分離することによってペレット化し、４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０を補充した溶解緩衝液中に再懸濁した。 懸濁液を再び２ ０，４ ０ ０×ｇで４ ５分間遠心分離することによりペレット化した。 ペレットを６Ｍ尿素を補充した溶解緩衝液で溶解した。 他の手順は、すべての緩衝液が２Ｍ尿素を含有することを除いて、Ｍｎｍｅ調製物と同じであった。 Ｍｎｍｃ調製では，ＨｉｓタグＳＵＭＯ蛋白質の除去までのすべてのステップはＧｌｙａ調製と同じであった。 ＭｎｍｃはＨｉｓ-ｔａｇ精製樹脂に非特異的に結合しているため，陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を選択した。 ６、１ ０ ０ｍ ＭのＫｃｌ、１ ０ｍ ＭのＭｇｃｌ２、および７ｍ Ｍの２−メルカプトエタノール）に対して透析し、次いでそれらを５ｍＬのＨｉｔｒａｐ Ｑ ｈ ｐカラム（＃１ ７ １ １ ５ ４ ０ １、ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上に塗布した。 カラムを２ ５ｍＬのＩＥＸ緩衝液で洗浄し、次いで、Ｍｎｍｃを、ｉｅｘ緩衝液中で１ ０ ０ｍ Ｍ〜１Ｍ Ｋｃｌのライナー勾配で溶出した。 Ｍｎｍｃを含有する画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ３ ０ｋＤａ（＃ＵＦＣ９ ０ ３ ０ ２ ４、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）によって濃縮し、ストック緩衝液に対して透析し、液体窒素でフラッシュ凍結し、−８ ０℃で保存した。各ＩＶｔｔＲＮＡの遺伝子の調製（補足データ１）を、Ｘｂａｉ制限部位とＢａｍｈｉ制限部位との間のｐＧＥＭＥＸ−１ベクター（＃Ｐ２ ２ １ １、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）にクローニングした。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ＩＶｔｔＲＮＡの調製（補足データ１）を、Ｐｇｅｍｅｘ−１ベクター（＃Ｐ２ ２ １ １、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ） 得られたプラスミドを鋳型として、in vitro転写のためのDNA鋳型を、t7プロモータープライマーをフォワードプライマーとして、各iVTtRNAの適切な逆プライマーを用いてPCR増幅した（補足データ1）。 各逆プライマーは、余分なヌクレオチド28のテンプレート非依存性の添加を防ぐために、5’末端から第二のヌクレオチドで2′-メトキシ修飾を含んでいた。 生成物は、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）抽出によって精製され、エタノール沈殿に続いて、沈殿剤は水に溶解した。 Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). C5タンパク質とM1RNAからなるRNase P成分は、その後、150nmで反応混合物に添加され、27余分なヌクレオチドの除去のために、反応は1時間37℃でインキュベー ＩＶＴＴＲＮＡｓを含む試料を、１ ０ｍｌのＨｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（＃１ ７ １ １ ５ ４ ０ １、ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上にロードし、Ｑ緩衝液（２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯ Ｈ ｐＨ７． ＩＶＴＴＲＮＡｓを、Ｑ緩衝液中で２ ０ ０ｍ Ｍから１Ｍ Ｋｃｌまでの線状勾配で溶出した。 尿素-PAGEによって決定された標的ivttrnaを含む画分は、イソプロパノール沈殿によって回収され、沈殿したivttrnaを水に溶解し、使用するまで-80℃で保存された。 私達は私達が要求のプラスミドのすべてを共有してもいいことに注意します。

iVTtRNAの修飾

T6A37修飾を、50mM Hepes-KOH、pH7を含む反応混合物中で行った。6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.１単位／μ ｌ組換えＲｎアーゼ阻害剤（＃２ ３ １ ３Ａ、Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、１ ０μ Ｍ Ｇｌｙａ、３μ Ｍ Ｇｉｄａ、３μ Ｍ Ｍｎｍｅ、２.５μ Ｍ Ｍｎｍｃ、６Ａ２ ６ ０単位／ｍｌ ｔｒＮＡｇｌｕｕｕｃまたはｔｒＮＡｇｌｕｃｕｃ。 37℃で2時間t6a37とm1g37修飾または4時間mnm5u34修飾のためのインキュベーションの後、trnaはクロロホルム/イソアミルアルコール（10：1）抽出に続いて酸性フェノール抽出で処理し、イソプロパノール沈殿によって回収した。 沈殿したｔＲＮＡを水に溶解し、−８ ０℃で保存した。 Mnm5u34修飾のために、反応は再び回収されたtRNAを用いて行われた。 それらは、酸性フェノール抽出に続いてクロロホルム/イソアミルアルコール（10：1）抽出で処理され、マイクロスピンG-25カラム（＃27532501、GEヘルスケア、米国）によって脱塩され、イ 修飾効率を定量化するために、1mM Thrの代わりに57.1μ M Thrを使用し、TsaDを含まない混合物をT6A37修飾の対照として使用した。tRNAを沈殿させたtRNAを水に溶解し、-80℃で保存した。 36.４μ Ｍのｓ−アデノシル−メチオニンを使用し、Ｔｒｍｄのない混合物をＭ１Ｇ修飾の対照として使用し、Ｇｉｄａのない混合物をＭＮＭ５Ｕ３ ４修飾の対照として使用した。 ３ ７℃で培養した後、アリコート（１ ０μ Ｌ）を回収し、Ｗｈａｔｍａｎ２ ５ｍ ｍ ＧＦ／Ｃフィルターディスク（＃１ ８ ２ ２−０ ２ ５、ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上で発見した。 フィルターディスクを１ ０％ＴＣＡで２回洗浄し、次いでエタノールで洗浄し、続いて液体シンチレーションカウンターによる放射能の測定を行った。 Mnm5u修飾の定量のために、tRNAを上記のように精製し、次いで0.02A260単位を代わりにフィルターディスク上に発見した。

アミノアシル化

アミノアシル化実験は、以前の報告に従って行われた47。 ６、１ ５ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、４ ０ｍ Ｍ Ｋｃｌ、１ｍ Ｍ ＤＴＴ、４ｍ Ｍ ＡＴＰ、１単位／μ Ｌ組換えＲｎアーゼ阻害剤（＃２ ３ １ ３Ａ、Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）、各アミノ酸に対応する５ ０ｎＭまたは１． メチル化を測定するために、0.6μ m Metと3.4μ m cold L-メチオニンの混合物を代わりに使用した。 Cysは、50mM DTTでシスチンを37℃で15分間還元することによって得られた。 天然のｔＲＮＡ混合物を使用した場合、代わりに４ ０個のＡ２ ６ ０単位／ｍｌ ｔＲＮＡ混合物（＃１ ０ １ ０ ９ ５ ４ １ ０ ０ １、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した。ｔｒｎａ混合物を使用した場合、４ ０個のＡ２ ６ ０単位／ｍｌ ｔＲＮＡ混合物（＃１ ０ １ ０ ９ ５ ４ １ ０ ０ １、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した。 ３ ７℃で３ ０分間インキュベーションした後、アリコート（８μ Ｌ）を取り出し、Ｗｈａｔｍａｎ２ ５ｍ ｍ ＧＦ／Ｃフィルターディスク（＃１ ８ ２ ２−０ ２ ５、ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上に発見した。 フィルターディスクを１ ０％ＴＣＡで２回洗浄し、次いでエタノールで洗浄し、続いて液体シンチレーションカウンターによる放射能の測定を行った。

PUREシステムによるオクタペプチド合成

オクタペプチドをコードするDNAテンプレートを、T7プロモーター配列とリボソーム結合部位（Shine-Dalgarno配列）をテンプ 増幅されたＤＮＡ鋳型を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（＃２ ８ １ ０ ４，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。 オクタペプチド合成反応には50mM HEPES-KOH pH7が含まれていた。6、100mMグルタミン酸カリウム、13mM酢酸マグネシウム、2mMスペルミジン、1mM DTT、2mM ATP、2mM GTP、1mM UTP、1mM CTP、20mmクレアチンリン酸、10μ g/mL10-ホルミル-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸酸、0.2μ Mリボソーム、4nM DNAテンプレート、翻訳因子および酵素を含むタンパク質性純粋な系成分、アミノ酸、およびtRNA。 タンパク質性の純粋な系成分の濃度は、以前のプロトコール46に記載されていたとおりであった。 我々は、すべての20aaRSsは関係なく、DNAテンプレートとテストコドンの、この実験に含まれていたことに注意してくださ 試験コドンに依存するアミノ酸の組成および濃度は、補足データ2に記載されている。 ＩＶＴｔｒＮＡｓの組成は鋳型に依存し、反応は、試験ＩＶＴｔｒＮＡｓの存在下または非存在下で、基礎ＩＶＴｔｒＮＡｓ（補足データ２）を用いて実施した（補足データ２）。 各ＩＶｔｔＲＮＡの濃度を６μ Ｍに固定した。 天然のｔＲＮＡ混合物を使用した場合、代わりに５ ６個のＡ２ ６ ０単位／ｍＬ ｔ ＲＮＡ混合物（＃１ ０ １ ０ ９ ５ ４ １ ０ ０ １、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した。 反応を３ ７℃で６ ０分間実施し、アリコートを取り出し、Ｗｈａｔｍａｎ３Ｍ Ｍ濾紙（＃１ ８ ２ ２−０ ２ ５、ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）上に点眼し、１ ０％ＴＣＡ中で９ ０℃で３ ０分間煮沸してアミノアシル−Ｒｎａを脱酸させた。 10%TCA不溶性画分中の放射能は、液体シンチレーションカウンターで測定した。０キット（＃ＰＦ２ ０ １，Ｇｅｎｅｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて、溶液ｉ中のｔＲＮＡ混合物（Ｂｕｆｆｅｒ ｍｉｘ）を用いないでタンパク質合成実験を行った。 0を追加しました。２μ ＭのＭＥＴ、ＤＨＦＲまたはｓＦＧＦＰ発現のための４ｎＭのＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレート（補足データ３）、および特定量のＩＶｔｔＲＮＡ混合物または天然のｔＲＮＡ混合物。 反応は30または37℃で12時間行い、合成されたタンパク質を分析した。合成されたタンパク質の分析

合成されたDHFRおよび放射性Metを含むsfGFPを15%SDS-PAGEで分析し、bas-5000bio-imaging analyzer（GE Healthcare、USA）を用いてゲル画像を可視化した。 Ｓｔｅｐｏｎｅ ｑＲＴ−ＰＣＲシステム（＃４ ３ ７ ６ ３ ７ ３，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して３分ごとにＳＦＧＦＰ蛍光を測定することにより、ｓｆｇｆｐ発現の経時分析を行った。 反応混合物中で合成されたＳＦＧＦＰの蛍光画像は、ＬＡＳ−４ ０ ０ ０装置（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて得た。 合成されたＤＨＦＲの活性は、前に記載されたように測定した４ ４。 反応混合物（2mL）は、50mM MES-KOH pH7.0、25mM TRIS-HCl pH7.0、25mMエタノールアミン、100mM NaCl、10mM2-メルカプトエタノール、0を含有した。１ｍ ＭのＥＤＴＡ、１ ０ ０μ Ｍのジヒドロ葉酸、および１ ０μ Ｌのアリコートの純粋な反応混合物を、３ ７℃で１ ５分間インキュベートした。 次に、最終濃度２ ０ ０μ ｍになるように２ ０ｍ ＭのＮＡＤＰＨを添加し、３ ４ ０ｎｍでの吸光度の低下を、Ｖ−５ ５ ０分光光度計（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）で１ ０分間にわたって測定した。 DHFRの一つの単位は、1μ molのジヒドロ葉酸を1分間で37℃で処理するために必要な酵素の量として定義された。

合成されたタンパク質のLC-MS分析

dhfrをその末端にFLAG配列を持つ(補足データ3)PUREfrex2で合成した。溶液ｉ（緩衝液混合物）中のｔＲＮＡ混合物を含まないキット（＃ＰＦ２ ０ １、Ｇｅｎｅｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）。 さらに、そのＣ末端にＦＬＡＧ配列でタグ付けされたＤＨＦＲのための４ｎＭ ＰＣＲ増幅ＤＮＡ鋳型（補足データ３）および特定量のＩＶｔｔＲＮＡ混合物または天然のｔＲＮＡ混合物を添加した。 合成されたＤＨＦＲを、抗ＦＬＡＧ Ｍ２磁気ビーズ（＃Ｍ８ ８ ２ ３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で精製した。 反応混合物のアリコート（５ ５μ ｌ）を、ＦＬＡＧ洗浄緩衝液（５ ０ｍ Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯ Ｈ、ｐＨ７）２ ４ ５μ ｌと混合した。ビーズをＦＬＡＧ洗浄緩衝液２ １ ０μ ｌで洗浄した後、Ｍｇ（Ｏａｃ）２を含まない緩衝液（２ １ ０μ ｌおよび１ ８ ０μ ｌ）で２回洗浄した。 次いで、ＤＨＦＲを、Ｍｇ（Ｏａ ｃ）２を含まないＦＬＡＧ洗浄緩衝液５ ０μ ｌで溶出したが、１時間穏やかに混合した後、１ ０ ０μ ｇ／ｍｌの３ＸＦＬＡＧペプチド（＃Ｆ４ ７ ９ ９、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を補充した。 濃密なＰＴＳ緩衝液（１ ０ ０ｍ Ｍデオキシコール酸ナトリウム、１ ０ ０ｍ Ｍ Ｎ−ラウロイルサルコシネートナトリウム、および５ ０ ０ｍ Ｍ Ｎ Ｈ４ＨＣＯ３）４μ ｌを、溶出試料４ ０μ ｌに添加した。 それらは10mM TCEPで37℃で30分間還元され、20mMヨードアセトアミドで37℃で30分間アルキル化され、20mM Cysで急冷された。 各反応溶液を２つの部分に分割した。 １つを、１ ０ｎｇ／μ ｌのＬｙｓ−Ｃ（＃９ ０ ０ ５ １、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）および１ ０ｎｇ／μ ｌのトリプシン（＃９ ０ ０ ５ ７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって、３ ７℃で一晩消化した。 他のものを、１ ０ｎｇ／μ ｌのＡｓｐ−Ｎ（＃９ ０ ０ ５ ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）により、３ ７℃で一晩消化した。 消化後、１ ０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１％の最終濃度に添加し、反応溶液を１ ５，０ ０ ０×ｇで５分間遠心分離して、界面活性剤を沈殿させた。 上清を自己調製したステージチップ49を用いて脱塩し、SpeedVacで乾燥させた。 ＬＣ−ＭＳ分析は、ｎａｎｏｓｐｒａｙイオン源（Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）およびｎａｎｏ−ＬＣシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３ ０ ０ ０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を装備したＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて行った。 乾燥したペプチド混合物を5％アセトニトリルおよび0.1％TFAを含む溶液に溶解し、各試料をナノLCシステムに適用した。 ペプチドをｔｒａｐカラムを用いて濃縮した（＃１ ６ ４ ５ ３ ５，０．０ ７ ５×２ ０ｍｍ、３μ ｍ、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｅｐｍａｐ１ ０ ０Ｃ１ ８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて分離し、次いで、ナノキャピラリーカラム（＃ＮＴＣＣ）を用いて分離した。-360/100-3-153, 0.1 × 150 １％ギ酸）および勾配（５分間５％Ｂ、４ ５分間５〜４ ５％Ｂ、１分間４ ５〜９ ０％Ｂ、４分間９ ０％Ｂ）を有する２つの移動相Ａ（０.１％ギ酸）およびＢ（アセトニトリルおよび０.１％ギ酸）を用いて、５ ０ ０ｎｌ／分 溶出は、MS（正モード、200〜1500m/zの走査範囲、60,000FWHM分解能）に直接エレクトロスプレー（2.2kV）された50。