ZVAD-fmkは、カスパーゼの活性化だけでなく、BPD-MAと光でHeLa細胞の治療によるCVB3感染またはアポトーシスの誘導後のPARPとDFFの切断を阻害します。 （Ａ）細胞溶解物を、カスパーゼ３特異的基質Ａ ｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣを含む反応緩衝液中でインキュベートした。 37℃で1時間インキュベーションした後、蛍光レベルを400nmの励起波長および505nmの発光波長で決定した。 ＣＶＢ３感染後１ ０時間、およびＢＰＤ−Ｍ Ａおよびｌｉｇｈｔによる処置後２時間で、ＺＶＡＤ−ＦＭＫ（５ ０〜２ ０ ０μ Ｍ）で処理したＨｅｌａ細胞におけるカスパーゼ活性化の欠如に留意されたい。 （Ｂ）処理したＨｅｌａ細胞から細胞溶解物を採取し、抗ＰＡＲＰ抗体を用いて免疫ブロット分析を行った。 ＺＶＡＤを含まないＣＶＢ３感染Ｈ Ｅｌａ細胞におけるＰＡＲＰの同等の切断に留意されたい。ＺＶＡＤを含まないＦＭＫおよびＢＰＤ−Ｍ Ａおよび光処理Ｈ Ｅｌａ細胞。fmk. ズヴァッドＨｅｌａ細胞のｆｍｋ処理（５ ０〜２ ０ ０μ Ｍ）は、ＢＰＤ−Ｍ Ａおよび光処理されたＨｅｌａ細胞におけるＰＡＲＰ処理を防止したが、ＣＶＢ３処理されたＨｅｌａ細胞では、ＰＡＲＰ処理は、ＺＶＡＤでの処理によって制限されたが、完全には阻害されなかった。50または100μ mのfmk。 （Ｃ）ＣＶＢ３感染後の１ ０時間およびＢＰＤ−Ｍ Ａおよびｌｉｇｈｔによる処置後の２時間におけるＤＦＦ切断のイムノブロット分析は、切断パターンがＰＡＲＰのそれと類似していたこ 偽感染した培養物は、ウイルスなしで、感染した培養物と同じように扱われました。

ZVADの効果。ＣＶＢ３感染またはＢＰＤ−Ｍ ＡおよびＨｅｌａ細胞の光治療後の細胞形態学的変化に対するｆｍｋ治療。 ＨｅＬａ細胞をＺＶＡＤで処理した。fmkを0-200μ mで感染させた後、CVB3に感染させるか、またはBPD-MAおよび光で処理した。 感染後10時間で、カスパーゼを処理し、基質をウイルス感染細胞で切断し、2時間後の光処理で、カスパーゼを処理し、基質をBPD-MA処理細胞で切断した。 CVB3感染および光力学的に処理されたHeLa細胞の形態学的外観の違いに注意してください。 CVB3感染HeLa細胞は、Bpd-MAと光で処理されたHeLa細胞は、細胞の不均一性と、広範な膜blebbingと収縮を表示しながら、滑らかな細胞表面で、丸みを帯びたように見えた。 高濃度のＺＶＡＤ-ｆｍｋでは，ＢＰＤ-Ｍ ａおよび光処理によって生じる形態学的変化は阻害され，細胞外観は対照Ｈｅｌａ細胞のそれと同様であった（ＢＰＤ-Ｍ Ａ処理および光なし）。 CVB3感染HeLa細胞では、形態学的変化は、ZVADの濃度の増加とともに阻害されなかった。ｆｍｋは形態学的変化がカスパーゼ処理および基質の切断に依存しないことを示唆した。Picornaviridae科のウイルスの古典的な特徴は、感染後の細胞性CPEである。 ポリオウイルスの増殖のための神経外細胞培養技術の発見以来（17）、細胞形態の変性変化が注目されている。 Robbinsらによって最初に記述された。 (48)1950年には、これらの細胞変性変化には、核収縮、クロマチンの凝縮、細胞の丸め、単分子層からの放出が含まれ、最終的には好酸性細胞質への進行、核pyknosis、核クロマチンの断片化（karyorrhexis）（47）が含まれる。

細胞死メカニズムの最近の理解は、宿主細胞死タンパク質の検査のための段階とCVB3感染のCPEにおけるそれらの可能な役割を設定します。

多くのウイルスは、細胞傷害、炎症反応、またはウイルスの持続性の特徴的な側面を伝える戦略である細胞死を阻害または活性化する。 上記のように、以前のピコルナウイルス研究は、細胞収縮、DNA断片化、および核凝縮（を含むアポトーシス細胞死の形態学的特徴を明らかにした21、32、47）。

カスパーゼ3、tecaenorhabditis elegansタンパク質Ced-3(77)と相同性を持つシステインプロテアーゼは、細胞死の実行段階に関与する重要なタンパク質の一つと考えられている。 Fas、TNF、エトポシド、スタウロスポリン、光力学療法、電離放射線、および成長因子撤退を含む複数の刺激によって誘導されるアポトーシスは、プロカスパーゼ3(15, 23, 30, 33, 51). CVB3との7から8hのpostinfectionで始まって、プロcaspase3は減り、caspaseの活発化の試金はこの蛋白質が活動的な形態に開裂されることを示しました。 いくつかのタンパク質はカスパーゼ3を活性化することができ、カスパーゼ8（TNFまたはFas受容体を介したシグナル伝達を介して）（55）、細胞傷害性リンパ球からのグランザイムB（62）、カスパーゼ9（ミトコンドリアのシトクロムcの放出およびアポトーシス性プロテアーゼ活性化因子の組み立てを介して）（36）などがある。 活性化されると、カスパーゼ3は特定の基質を分解することができ、細胞プロセスの恒常性調節の構造変化および喪失をもたらす。 多くのタンパク質は活性化カスパーゼによって切断されることが示されている。 カスパーゼ3の活性化と一致して、PARPとDFFの両方がCVB3感染後に切断されます。 カスパーゼ活性化およびＤＮＡ断片化は、ＤＦＦの切断を介して直接連結される（３ ７）。 DFFは45kDaと40kDaの二つのサブユニットからなるヒト細胞質因子であり、そのうちの大きなものはカスパーゼ3によって小さなポリペプチドに分解される。 Enariらによる最近の研究では。 (16)マウスリンパ腫細胞を用いて、エンドヌクレアーゼ、カスパーゼ活性化DNase(CAD)を単離した。 DFFタンパク質のマウス当量を単離し、CADの阻害剤と呼ばれた（50）。 CAD（DFF）の阻害剤のカスパーゼ3切断は、CAD核転座とDNA分解を可能にします。 ＤＦＦは、感染後９時間で開始して切断され、３ ０−ｋＤａ断片が得られる（図１ ０Ａ）。 ら１ １−ｋＤａ断片に処理することができる（３ ７）。 PARPは核に位置し、DNA修復に関与しています。 PARPの切断は、カスパーゼがサイトゾルで活性化されると、それらが核局在基質にアクセスすることができることを示唆し、感染後9時間で開始されます。

注目すべきは、一般的なカスパーゼ阻害剤ZVADによるカスパーゼ阻害である。fmkは、感染後のCVB3によって誘導されるCPEを防ぐことはできませんでした。 6と7時間の感染後の間で、CPEは私たちのCVB3感染モデルにおけるコントラスト顕微鏡によって明らかになった。 感染とＣＰＥの出現との間の時間は、対照顕微鏡によって観察されたように、ＺＶＡＤで一貫していた。ｆｍｋ濃度は５ ０〜２ ０ ０μ Ｍである。 CPEまでの時間に影響を与えないことに加えて、ZVAD。ｆｍｋ処理により、未処理の感染細胞と同様の形態学的外観を有する細胞が得られた（図１ ０Ａ）。 5). 我々は、HeLa細胞におけるアポトーシスを誘導する別の方法としてBPD-MAと光による治療を使用した（22、23）。 阻害剤ZVADによるカスパーゼ活性化の阻害。fmkはアポトーシス表現型を防止した（図。 5). これらの結果から，カスパーゼ活性と基質の切断はピコルナウイルス感染に関連する特徴的なＣＰＥを説明するのではなく，形態学的変化に続いて活性化されると結論した。

ウイルス複製サイクルと宿主細胞死経路の活性化の交点はまだ決定されていない。

ウイルス複製サイクルと宿主細胞死経路の活性化 ピコルナウイルス感染はすぐに細胞RNAおよびタンパク質合成の阻害をもたらす（19、74）。 ピコルナウイルス誘発代謝変化とウイルス誘発CPEの関係の初期の研究は、タンパク質およびRNA合成の阻害が直接細胞の形態学的変化に関連していな タンパク質およびRNA合成阻害剤は、細胞死を遅らせたが、細胞はピコルナウイルス感染細胞（したよりも少ない形態学的変化を示した5）。 アクチノマイシンD、ピューロマイシン、ジフテリア毒素などの複数の薬剤のいずれかによるタンパク質およびRNA合成の阻害は、アポトーシスをもたらす（39）。 ポリオウイルス感染システムで行われた初期の研究では、ウイルスおよび宿主タンパク質の翻訳阻害剤であるピューロマイシンが細胞変性変化の発症を遅らせることが示されており、特定のウイルスタンパク質が直接細胞傷害性である可能性があることが示唆されています(4)。 ほとんどすべての宿主タンパク質の翻訳は、この研究で使用されるような比較的低いMOI（25）で3時間以内に遮断されているが、MOIを増加させると、CPE（未発表の観察）のより迅速な発症につながる（MOI=5）。 最近では、コクサッケウイルスとポリオウイルスによってコードされた2Bタンパク質は、plasmalemmaと小胞体を含む細胞膜画分と関連し、Ca2+のサイトゾルへの移動を含むイオン運動を破壊することが示されている（1、67）。 Ca2+流入はアポトーシス（7、44）で発生するが、流入がカスパーゼ活性化の前または後に発生するかどうかは明らかではない。 カスパーゼのイオン要件を検討することにより、カルシウムイオン濃度がカスパーゼ活性にほとんど影響を及ぼさないことが決定されている（56）。 Coxsackievirus感染後の初期のカルシウム流入は、膜透過性に対する2Bタンパク質の影響から生じる可能性があり、大きな後期カルシウム流入（>6h感染後）（67）は、カスパーゼ活性化の下流の効果である可能性がある。感染の初期段階の間に、ウイルスが宿主細胞死を阻害し、それによってウイルス子孫の最大産生を可能にすることが有利であろう。

ウイルスのライフサイクルの後期段階では、ウイルスが壊死ではなくアポトーシスを誘導することも有益であろう。 このような死のメカニズムは、周囲の組織への放出中のウイルスによる宿主免疫系回避の潜在的な手段である。 アポトーシスは、炎症性サイトカインの放出なしに影響を受けた細胞の急速な食作用によって特徴付けられる（53）。

ウイルスは、アポトーシス経路の様々なレベルで相互作用することが示されている。 いくつかのガンマヘルペスウイルス（カポジ肉腫関連ヒトヘルペスウイルス8を含む）および腫瘍形成性軟体動物伝染病ウイルスには、Fasアダプタータンパク質FADDと相互作用し、カスパーゼ8のリクルートおよびその後の活性化を阻害するために競合するフリース阻害タンパク質が含まれている（61）。 牛痘ウイルスセルピンCrmAの発現は、カスパーゼ1およびカスパーゼ3などの下流カスパーゼのカスパーゼ8媒介活性化をブロックする（55）。 Iap（アポトーシスの阻害剤のための）タンパク質は、ウイルス感染またはカスパーゼ1（78）によって誘導されるアポトーシスをブロックするバキュロウイルスによ さらに、タンパク質のBcl-2ファミリーのいくつかのウイルス相同体が発見されています(2, 8, 20, 70). アデノウイルス（9、20、57）、アフリカ豚熱ウイルス（41）、およびエプスタイン-バーウイルス（26、41、59）は、Bcl-2ファミリーのプロ生存遺伝子に配列相同性を示すタン

アポトーシスを直接誘導するウイルスタンパク質の同定は、細胞死を阻害するウイルスタンパク質の同定ほど広く文書化されていない。 レンチウイルスヒト免疫不全ウイルスおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの発現を減少させながら、ｆａｓリガンドの発現を増加させることが示されている転写調節因子ＴａｔおよびＴａｘをコードする（７ ９、８ ０）。 ヒトアデノウイルスでコードされたE1A、E3、およびE4遺伝子産物は、細胞培養における発現後の細胞死を引き起こす。 アデノウイルスの死誘導遺伝子は、感染サイクルの後半に発現し、最終的にはウイルスコードされた死を阻害する遺伝子（を圧倒されている38）。

我々のデータは、カスパーゼ3の活性化は、感染したHeLa細胞におけるCVB3誘導変性形態学的変化に先行するのではなく、次のことを示しています。

活性化カスパーゼは、PARPおよびDFFを含む特定の基質を処理する。 しかし、カスパーゼ活性の阻害は、コントラスト顕微鏡によって決定されるように、ウイルス感染細胞の形態学的外観（CPE）を排除しません。 カスパーゼ処理と基質の切断は、感染細胞における正常な恒常性プロセスの最終的な変化に重要であり、ウイルス感染細胞の最終的なクリアランスを容易にする可能性があります。 ウイルスプロテアーゼ2A、3C、および3CDは、異なるアポトーシス表現型を達成するために別々の基質を切断カスパーゼの作用に類似した方法で、CPEと一致する形態学的変化をもたらす、特定の構造タンパク質を切断することができる。

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