研究デザイン

vx-765研究:生後5ヶ月のvx-765を注射したwt(WT+vehicle;n=18)およびJ20マウス(J20+vehicle:n=14)、およびVX-765を注射したJ20を注射したwt(WT+vehicle;n=18)マウス(J20+vehicle:n=14)マウス(J20+vehicle:n=18)マウス(J20+vehicle:n=18)マウス(J20+vehicle)マウス（j20+vx-765：n=13）マウスを5つの異なる時点で縦方向に評価した：治療前のベースライン（ベースライン未処理のj20を一緒にグループ化した; （ｎ＝１ ９）、ＶＸ−７ ６ ５またはビヒクルの週に３回のＩＰ注射後（処置１）、２週間にわたる６回の追加注射後（処置２）、４週間の洗浄期間（ＷＯ）後、および１週間の追加３回の注射後（処置３）（ 1a）。 （Ａ）動物が実験中に死亡したか、または（ｂ）動物が行動的に反応しなかった場合を除き、試験されたすべての動物を分析に含めた。 合計25リットル、四つの異なるコホートに広がり、異なる時間にテストされた、使用されました。 これらのコホートのうち3つはNORおよびオープンフィールド試験を受け、コホート4はバーンズ迷路に使用されました。 Ｊ２ ０動物が行動的に欠損していることを確認するために動物をベースライン試験した後、Ｊ２ ０動物を、行動性能とは無関係に、ビヒクルまたはＶＸ−７ ６ ５処置のいず 使用されたすべての動物のうち、四つのJ20マウスは、実験の開始時に行動の赤字を示さず、使用されませんでした。 二つのJ20+ビヒクルマウスは、実験中に全く移動しなかったし、その行動データは除外されました; しかし、これらの動物は飼育され、死後の分析にはまだ使用されていました。

Casp1検証研究：VX-765のCasp1特異的効果を検証するために、J20マウスをCasp1-/-バックグラウンドで生成した。 七十から三マウスを使用した（n=12-13遺伝子型あたり、六つの異なる遺伝子型）、すべてが35ドナー女性から体外受精（IVF）を介して飼育された。 繁殖の詳細については、以下の動物研究のセクションに記載されています。 すべてのマウスは、生後7ヶ月から8ヶ月の間に行動的に評価され、この研究から除外された動物はなかった。

すべてのマウスを犠牲にし、生後8ヶ月で処理した。 行動スコアリングは、マウスの遺伝子型と治療に盲目にされ、すべての動物は、生化学的または組織学的分析のいずれかのためにランダムに割り当てら

vx-765、vrt-043198組換えカスパーゼに関するIC50アッセイ

動物研究

すべての動物手順は、Canadian Council on Animal Care guidelinesに従い、McGill University Animal Care committeeによって承認されました。 Ｊ２ ０トランスジェニックマウスライン（ＪＡＸ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ． ０ ０ ６ ２ ９ ３，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈ Ａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）は、ＰＤＧＦ−γプロモーター下でスウェーデン（６ ７ ０／６ ７ １ＫＭ→ＮＬ）およびインディアナ（７ １ ７Ｖ→Ｆ）ヒトＡＰＰ変異を発現する。 雄のJ20マウスはブリーダーとして使用され、その精子はIVFコロニー拡張のために使用された。遺伝子型は尾部生検およびRT-PCRによって決定した。

遺伝子型は尾部生検およびRT-PCRによって決定した。 マウスは、グループ収容された（ケージあたり2-4動物）標準的なマクロロンケージで12時間逆光/暗サイクルと制御された環境条件の下で。 食料と水は、ad libitum利用可能でした。ＶＸ−７ ６ ５（Ａｄｏｏｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃ Ａ）を、Ｄ Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）中の２ ０％ｃｒｅｍｏｐｈｏｒに溶解し、腹腔内投与した。 車両処理されたJ20およびWTマウスは、cremophorのみを受けた。

血液脳関門透過性分析

五ヶ月齢のJ20およびWTマウスをイソフルランで麻酔し、右頸動脈を分離した。 頚動脈壁に沿って小さな切開を行い，内頚動脈の入口にマイクロカテーテルを挿入した。 カテーテルは縫合糸を用いて所定の位置に固定した。 Ｖ Ｘ−７ ６ ５（５ ０ｍｇ ｋｇ−１）を、５ ０μ ｌ分−１（９ ０〜１ ２ ０μ ｌの総体積）で注入した。 マイクロカテーテルをさらに５分間放置して拡散を可能にし、その後、心臓内穿刺によって血液を採取した。 マウスを氷冷生理食塩水で心外に灌流し，海馬と皮質を解剖した。 試料は、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析分析のために、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄ ｅ Ｍｏｎｔｒｅａｌ）に送られた。

行動分析

オープンフィールド: 運動活性は、Ｈ ＶＳ２ １ ０ ０自動追跡システム（ＨＶＳ Ｉｍａｇｅ，Ｈａｍｐｔｏｍ，ＵＫ）を使用して測定した。 マウスを野外室（40×40cmプレキシガラス箱、天井なし、および白い床）に入れ、5分間探索させた。

新規オブジェクト認識（NOR）：マウスは、5分間オープンフィールドチャンバー内の二つの同一のオブジェクトに事前に暴露しました。

新規オブジェクト認識（NOR）： 曝露前の２時間後に、マウスをチャンバに戻し、１つの身近な物体および１つの新規な物体に５分間曝露した。 マウスは、異なる試験セッション間で一度だけ特定のオブジェクトにさらされた、と新規オブジェクトの配置は、各治療群内で相殺されました。 試験段階の間の新規オブジェクトのタッチの割合および識別指数（（＃touches novel-＃touches familiar）／合計タッチ）を評価した。

Barnes maze：Barnes mazeプラットフォーム（直径91cm、床から90cmの高さ）は20個の穴（直径5cm）で構成されていました。 凹んだ脱出箱につながった一つの目標穴を除いて、すべての穴がブロックされました。 空間的な手がかり、明るい光、およびホワイトノイズは、各セッション中に脱出を見つけるためにマウスをやる気にさせるために使用されました。 適応フェーズでは、各マウスは60秒間プラットフォームを探索しました。脱出ボックスを見つけられなかったマウスはそれに導かれ、90秒間そこに残りました。獲得フェーズでは、各試験は同じプロトコルに従い、各マウスがターゲットを見つけて180秒以内に脱出ボックスに入るように訓練することを目標としました。マウスはさらに60秒間ボックスに残りました。1日あたりの4回の試験は、約15分離れて、4日間連続して行われました。 プローブ試験（５日目）では、各マウスは１回の９ ０ｓ試験を行った。 ターゲットはまだ同じ位置に位置していましたが、脱出ボックスはブロックされました。 目標に到達するための待ち時間とエラー、プラス各穴へのマウスのポークの数（目標の好み）を測定しました。 動物を腕Ａの遠位端に配置し、５分間迷路を探索させた。Ｙ迷路は、互いに１ ２ ０°の３つの腕を有する対称Ｙ形の迷路で構成され、Ａ、Ｂ、およびＣと指定された。 三つの異なる腕の連続したエントリとして定義された総腕エントリと自発的な交替を記録した。 割合交替を決定した。免疫組織化学のために、マウス（群あたりｎ＝４〜６）をイソフルオランで麻酔し、氷冷食塩水で経心灌流し、続いて氷冷４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を０． 脳を１ ０％中性緩衝ホルマリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）中で１ ６時間後固定し、７ ０％エタノールに移した。 脳はパラフィンが埋め込まれ、4μ mで切断された。

ウェスタンブロットとELISA（n=4-8グループあたり）のために、麻酔マウスは、子宮頸管脱臼し、海馬と皮質を解剖し、すぐにドライアイス上で凍結しました。 ２ ５％ｎ ａ−デオキシコール酸塩、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍ Ｍ Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍ Ｍ Ｎａｆ、１ｍ Ｍ ＰＭＳＦ、１ ０μ ｌ ｍ ｌ−１のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて、組織ホモジナイザー（ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｅｓａｗ，Ｇ Ａ，ＵＳＡ）を用いて、５×体積／重量）。 試料を２ ０分間遠心分離（２ ０，０ ０ ０×ｇ、４℃）し、上清を回収し、ｂｃ Ａ法を用いてタンパク質を定量した。 ＲＩＰＡ不溶性ペレットを、Ｄ Ｈ２Ｏ中の７ ０％ギ酸中でさらに抽出し、蒸発させ、そして２ ０ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．エピトープは、クエン酸塩（10mM Tris-Naクエン酸塩、pH6.0）またはEDTA（10mM Tris塩基、1mM EDTA、0.05％Tween-20、pH9）のいずれかで脱マスクした。

免疫組織学的染色

エピトープは、クエン酸塩（10mM Tris-Naクエン酸塩、pH6.0）またはEDTA（10mM Tris塩基、1mM EDTA、0.05％Tween-20、pH9。Ｄａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｐｌｕｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｌｉｄ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒおよびＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｆｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて免疫染色した。 １：２ ０ ０ ０ウサギ抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ０ １ ９−１ ９ ７ ４ １，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）、１：８ ０ ０ ０ウサギ抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ Ｚ−０ ３ ３ ４）、１：２ ０ ０ ０ウサギ抗Ａ Β１−４ ０（Ｆ２ ５ ２ ７ ６，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、および１：２ ０ ０ ０ウサギ抗Ａ Β１−４ ０（ｆ２ ５ ２ ７ ６，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）で希釈した以下の抗体で免疫染色した。（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｓ５ ７ ６ ８）。 切片は、キット付属の適切なマウスまたはウサギHRP共役二次抗体で処理し、DABで可視化した。 切片はヘマトキシリン対染色し、脱水し、パーマウントでカバーした（Fisher Scientific）。 切片を、分析のためにＭＩＲＡＸ ＳＣＡＮ（Ｚｅｉｓｓ，Ｄｏｎ Ｍｉｌｌｓ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いてデジタルスキャンした。 脱脂および再水和の後、スライドを、濾過した１％チオフラビン−Ｓ水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。

定量的免疫組織学的分析

海馬のCA1領域の皮質および前部におけるIba1陽性細胞を、面積計数フレームの修正バージョンを用いて定量した48。 簡単に言えば、5回目のスライドごとに定量化しました（脳あたり4つの切片が得られました）。 複数の×80の画像を、関心領域内のMIRAXスキャンで撮影し、Iba1陽性細胞の数を手動でカウントした。 前方CA1領域および皮質における数値密度（細胞mm−3の数）を推定した。 信頼性の高い推定を行うためには、エリアあたり150ヒットの最小数が必要でした。 私たちが最小数に達することができなかった場合、追加のセクションがカウントされました。 定量は、治療および遺伝子型のために盲検化を行った。 ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、ＣＡ１領域および皮質におけるＡ Β蓄積、ＧＦＡＰおよびシナプトフィシン免疫陽性染色を測定した。 脳あたりの四つのセクションを分析し、複数の画像は、CA1領域と皮質をカバーするために、各セクション内で撮影されました。 閾値は、染色された領域を強調するために全ての脳を横切って均等に調整され、粒子は染色の総面積を決定するために分析された。 結果は、分析された総面積（μ m2mm−2）ごとに染色された総面積として表される。 代表的な画像は、サイズの制約に適合するようにのみトリミングされており、後処理は行われていません。マウスタンパク質試料（２ ５〜１ ０ ０μ ｇ）を、Ｌａｅｍｍｌｉ（５％２−β−メルカプトエタノール、１ｍ Ｍ Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍ Ｍ Ｎａｆ、１ｍ Ｍ ＰＭＳＦ、１ ０μ ｌ ｍｌ−１のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中で調製し、５分間煮沸し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。 １％Ｔｗｅｅｎ−２ ０またはＰＢＳ遮断緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：１：１ ０ ０ ０マウス抗ヒトＡ Β１−１ ６（６Ｅ１ ０）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ８ ０ ３ ０ ０ １，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）、１：１ ０ ０ ０マウス抗ヒトＡ Β１−１ ６（６Ｅ１ ０）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ８ ０ ３ ０ ０ １，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）、１：１ ０ ０ ０マウス抗ヒトＡ Β１−１ ６（６Ｅ１ ０）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ８ ０ ３ ０ ０ １，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）、１：１ ０ ０ ０:Ｃ末端（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ８ ７ １ ７）、１：１ ０ ０ ０ウサギ抗ネプリリシン（Ａｂｃａｍ ａ ｂ７ ９ ４ ２ ３）、１：５ ０ ０ウサギ抗ＩＤＥ（Ａｂｃａｍ ａ ｂ３ ２ ２ １ ６）、１：１ ０ ０ ０ウサギ抗カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ９ ６ ６ ５）、１：１ ０ ０ ０マウス抗活性カスパーゼ−８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ８ ５ ９ ２）、１：１ ０ ０ ０ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ−９（Ｃｅｌｌ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ９ ５ ０ ４）、および１：５ ０ ０ ０マウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ ａ５ ４ ４ １）。 ブロットは、１：５ ０ ０ ０ＨＲＰ連結抗マウス（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｎ Ａ９ ３ １ ０、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ、Ｃ Ａ）または１：５ ０ ０ ０抗ウサギ（Ｄａｋｏ Ｐ０ ２ １ ７）二次抗体、続いてＥＣＬ（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。 免疫反応性バンドを、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ ＬＡＳ４ ０ ０ ０ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｉｌｌｉｍ ＵＳＡ、Ｖａｌｈａｌｌａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して可視化し、濃度測定分析を、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｕｉｌｉｍ ＵＳＡ）を使用して行った。 Ｒａｗブロットの輝度／コントラストを、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ５ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃ Ａ）を用いて画像全体にわたって均等に調整して、代表的な画像を生成した。 追加の変更は行われませんでした。 ＣａｎｖａｓｔＭ Ｘソフトウェア（Ａｃｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ）を使用して、最終的な図を作成した。 西部のしみのための未加工しみは補足図11で利用できる。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して、マウス脳におけるプロおよび抗炎症性サイトカイン、およびＡ Βレベルを決定した。

ＥＬＩＳＡ

マウス脳 標準およびサンプルは製造業者の議定書に従って準備され、重複して動かしました。 Ten-plexマウス炎症誘発パネルは、マウス海馬および皮質およびサンプルに使用された。 マウス血漿を測定するために単一のＩｌ−１βキットを使用した。 Ｆｏｕｒ−ｐｌｅｘヒト炎症誘発性パネルをＨＰＮ試料に使用した（下記参照）。 四パネルヒトA Β6E10キットは、マウス海馬および皮質、およびHPNサンプルのために使用されました。RNA抽出およびcDNA合成

総RNAは、Qiazol（Qiagen、Valencia、CA、USA）でマウス海馬および皮質（グループあたりn=3）から抽出し、20ゲージ針で均質化した。

RNA抽出およびcDNA合成

総RNAは、20ゲージニードルホモジナイゼーションに続いた。 オンカラムＤｎａｓｅ処理ステップを含むＭｉｒＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を精製した。 ＲＮＡの品質および量を、分光光度計（ＤＳ−１ １Ｆ Ｘ＋、Ｄｅｎｏｖｉｘ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて決定した。 Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). 生成物を、Ｒｅｄｓａｆｅ（Ｆｒｏｇｇａｂｉｏ，Ｎｏｒｔｈ Ｙｏｒｋ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）染色した２％アガロースゲル上で可視化した。 リアルタイムＰＣＲ実験は、ＡＰＰＬＩＥＤ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７ ５ ０ ０Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）上で、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った。 遺伝子増幅は、以下のプライマーを用いて行った：（１ ８ｓ）５’−ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＡＴ−３’および５’−ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ−３’；（ＩＤＥ）５’−ＡＣＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’および５’−ＧＧＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧ−３’; （ネプリリシン）５’−ＴＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣ−３’および５’−ＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＣＡＴ−３’。 結果は、Ｐｆａｆｆｌの方法を使用して、ＨＰＲＴおよび１ ８ｓ参照遺伝子を平均するように正規化された倍誘導値として表される。

マウスシナプス可塑性RT2プロファイラPCRアレイ

マウスシナプス可塑性RT2プロファイラPCRアレイ（PAMM-126Z、Qiagen）は、学習とメモリと五つのハウスキーピング; 熱ショックタンパク質90α（細胞質）、Hsp90Ab1）リアルタイムPCR。 総ＲＮＡ（各試料について４ ６ ５ｎｇ）を、製造業者のプロトコール（Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）に従って逆転写（ゲノムＤＮＡ除去ステップを含む）した。 リアルタイムＰＣＲ反応を、ＲＴ２ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、リアルタイムｃｙｃｌｅｒ ＡＢＩ７ ５ ０ ０（Ｆａｓｔ Ｂｌｏｃｋ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。 サイクル条件は以下の通りであった：50℃で2分、95℃で10分、40サイクル、95℃でそれぞれ15秒、および60℃で1分。 しきい値およびベースラインは、製造業者の指示に従って手動で設定した。 データは、五つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均に正規化され、比較Ct法（2-Δ CT）によって分析された。＜Ｈ３＞神経細胞培養および軸索変性アッセイ（Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｘｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）＜／ｈ３＞＜ｐ＞１ ２〜１ ６週齢の胎児の皮質組織を、Ｍｃｇｉｌｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄによって承認されたプロトコ HPNは、トリプシンで解離し、デオキシリボヌクレアーゼIで処理し、130、70、および30μ mナイロンメッシュ21を介して濾過された脳から培養した。 解離した細胞を、３ ０ ０×ｇで１ ０分間遠心分離し、Ｅａｒｌｅの塩を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中に再懸濁し、５％脱複合ＢＣＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１ｍ Ｍピルビン酸ナトリウム・ピルビン酸、および２ｍ Ｍ ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を補充した。 細胞を、５μ ｇのＭＬ−１ポリ−ｌ−リジン被覆６ウェル組織培養プレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に３×１ ０ ６個の細胞ｍｌ−１の密度で播種した。 MEM培地は2日ごとに変更され、アストロサイト増殖は、最初の4日間fluorodeoxyuridince（FdU）抗ミトーシス治療（1ミリメートル、シグマ）で制限されていた。 神経細胞培養は、実験を行う7-10日前に成長させた。 異なる時間に四つの異なるニューロン調製物を試験した。 ニューロン製剤の一つは安定ではなく、任意の薬物を受けなかった血清+コントロールを含む培養は、実験の途中で死亡した。 したがって，三つの遺伝的に異なるドナーから三つの異なるニューロン調製物を使用した。

VX-765毒性は3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化(MTT)で評価しました。 ニューロンを25〜200μ M VX-765または0.1％DMSO（使用される最高DMSO濃度）で72時間処理し、次いで、0.5μ g ml−1MTT（Sigma-Aldrich）と37℃（5％CO2）で4時間インキュベートした。 ホルマザン結晶を１ ０ ０μ ｌのＤＭＳＯに３ ０分間溶解した。 Ｓｙｎｅｒｇｙ ｈ４ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用して、５ ６ ０および６ ７ ０ｎｍで吸光度を測定した。

軸索変性は、APPWTトランスフェクションまたは血清剥奪ストレスのいずれかによって誘導された。 VX-765は、前処理戦略（ストレッサーの1時間前）またはビーズ後治療戦略（ストレッサーの48時間後）のいずれかとして投与された。 蛍光可視化のためにＰＢＵＤＣＥ４ １−ＥＧＦＰで被覆された金ビーズを用いて、ｇｅｎｅ ｇｕｎ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）によりニューロンをトランスフェクトした。 APPWTストレスを受けたニューロンは、pbudce41-eGFP/APPWTでトランスフェクトされました。 簡単に説明すると、ニューロンを、２ ５または５ ０μ ＭのＶＸ−７ ６ ５、５μ ＭのＣａｓｐ１阻害剤Ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ、またはＤＭＳＯを添加した培地で処理した。 １ ０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｔ Ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃ Ａ）およびＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｃｏｏｌｓｎａｐ Ｈ Ｑ２ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｓｏｎ，Ａ Ｚ，ＵＳＡ）を用いて、２ ４時間ごと（治療後７ ２時間まで）に蛍光画像を撮影した。 神経ビーズのパーセンテージは、各時点でのｅｇｆｐ陽性ニューロンの総数に対するビーズｅｇｆｐ陽性ニューロンの数をカウントすることによって測定された。 150eGFP陽性ニューロンの最小値は、各条件のためにカウントされました。 馴化培地をサンプリングし（１ｍ Ｍ Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍ Ｍ Ｎａｆ、１ｍ Ｍ ＰＭＳＦ、１ ０μ ｌ ｍ ｌ−１のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した）、分析のために細胞溶解緩衝液（５ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ、０.１％ＣＨＡＰＳ、０.１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）

統計分析

動物の数または独立した実験、および使用される統計分析（ANOVAおよび事後比較）はすべて図の凡例に示されています。

すべての値は平均±s.e.m.として表され、Fおよびp値は図の凡例に示されています。 全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用して行った。