要約

カルベンダジムは、殺菌剤として、農業、林業、および獣医学の真菌病 本研究では、カルベンダジムの急性および生殖毒性は、事前に農業生産とアプリケーションでこの殺菌剤の潜在的なリスクを評価するために、モデルと 結果は、c.elegansの成長が0.01μ g/L carbendazimによって阻害されたことを示した。 0.1μ g/Lのカルベンダジムの治療は、歩行行動の有意な減少と生殖および抗酸化系への重大な損傷を引き起こし、線虫の寿命を大幅に短縮させた。 これらの結果は、カルベンダジムの環境リスクのより良い理解を提供し、安全性に関する新たな懸念を提起する。

1. はじめに

農薬、化学的または生物学的試薬の一種は、広く作物の成長を促進し、作物の収量を向上させることができ、植物の成長を調節し、病気や害虫を制御するために農業で使用されています。 しかし、農薬の広範な使用は、作物や食品中の残留物の異なる程度につながり、したがって、人間の健康に影響を与えます。 残留農薬の問題は、消費者の大きな注目を集めているだけでなく、食品の安全性に影響を与える重要な要因の一つとなっています。

Carbendazimは、広域殺菌剤として、農業、林業、および獣医学における真菌性疾患を制御するために使用されてきました。 しかし、carbendazimは世界保健機関によって化学物質の危険なカテゴリに分類され、欧州委員会によって内分泌撹乱化学物質の優先リストに分類されています。 近年、範囲外および過剰摂取によるカルベンダジムの広範な使用およびカルベンダジムが分解されにくいという事実は、農業におけるカルベンダジム残基の問題につながることは明らかである。 カルベンダジムの毒性は1980年代から報告されているが、カルベンダジムの毒性は環境内分泌かく乱物質に対する懸念が高まっているため、ホットな話題となっている。 カルベンダジムは、開発や生殖障害、毒性、変異原性などの環境や健康への悪影響のために、いくつかの国で禁止されています。 肝臓、腎臓、内分泌腺およびそれらのホルモンレベルにおける生化学的、病理組織学的、および血液学的パラメータに対するカルベンダジムの有害作用がラットで示されている。 さらに、それはcarbendazimの残余による低い集中のそれ以上の調査を必要とします。

Caenorhabditis elegans（c.elegans）は、重要な研究モデルとして、いくつかの評価を行うために広く使用されています。 Amrit et al. 、C.elegansに実験室で培養することの小型、急速な世代時間、容易なおよび短い大人の寿命のような多くの利点が、あります。 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを低濃度のカルベンダジムの毒性を評価するためのモデル生物として選択した。

2. 材料および方法

2.1. 化学物質および株

Carbendazim(純度≥99%;Aladdin®Biochemical Technology Co. ＬＴＤ，Ｓｈａｎｇｈｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃ Ｏ．Sinopharm Chemical Reagent）に溶解した。、株式会社、上海、中国）1つのg/L carbendazimの元の解決を作り出すため。 DMFの濃度は、最終的な暴露溶液中で0.1％であった(0.01, 0.1, 1, 10, 100 μ g/L）。 カルベンダジムを含まない0.1％DMFが対照群であった。 線虫ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（野生型Ｎ２）は、もともとＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＭＮ，ＵＳＡ）から得られた。 線虫を、記載のように２ ０℃でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＯＰ５ ０で播種した線虫成長培地（ＮＧＭ）プレート上で培養した。 L1-larval c.elegansは、漂白混合物（1M NaOH、10％NaHOCl）で重力線虫を洗浄することによって収集されました。

2.2. 致死性

カルベンダジム元の溶液（1g/L）をS液体培地（1.12g K2HPO4、5.92g KH2PO4、および5.85g NaClを1L水で希釈）で希釈して、最終的なカルベンダジム0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, １％ＤＭＦを含有した１ｍｇ／Ｌを含有した。 0.1%DMFを有するS液体培地は対照群であった。 30線虫（L4）は、各濃度のために96ウェルプレートで試験した。 線虫の生存率は、インキュベーターで24時間培養した後、顕微鏡下でカウントした。 テストのプロセスはXiang et al.の方法に基づいています。 . 三つの並列実験が必要であった。2.3.

歩行行動

少なくとも10c.elegans(L4)は、ヘッドスラッシュ周波数と体の曲げ時間の両方によって記録された機関車の行動を決定するために、各濃度から無 ヘッドスラッシュ周波数の数は、1分でc.elegansのmidbodyで曲げ方向の変化によってカウントされました。 体の曲がりの測定は、大腸菌OP50なしでNGMで培養された線虫の部分の方向変化の時間として30秒で定義された。

2.4。 成長と開発アッセイ

c.elegans24時間carbendazimにさらされた分析しました。 Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍに曝露された線虫の体長は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって評価された。 各Cの子孫。 l4幼虫から1日目までのelegansは、再生が停止するまで毎日新しいプレートに個別に転送した後、L3段階で記録されました。 少なくとも三つの並列試験を行った。2.5.

寿命分析

寿命のためにテストされたc.elegansのすべては、20℃で同じ条件で培養した同期c.elegansは、4日目までcarbendazimの異なる濃度のNGMプレートで培養した。 その後、試験された線虫は2日ごとに新しいNGMプレートに移されます。 生き残って死んだC. elegansは、各濃度のすべての線虫が死亡するまで（成人期の最初の日に始まる）毎日記録された。 少なくとも三つの並列試験を行った。2.6.

2.6. 酸化的損傷の決定

細胞内ROSは、はるかに最も一般的で敏感な活性酸素検出プローブである2’、7′-dichlorodihydrofluoroscein diacetate（H2DCFH-DA）で測定しました。 野生型N2c.elegansをM9緩衝液中で洗浄した後、超音波で破壊した。 上清を、ＲＯＳキットの指示に従ってｒｏｓレベルを分析した。 Ｈ２ＤＣ Ｈ Ｅ−ＤＡの最終作業濃度は１ ０μであった。 励起および発光吸光波長は、それぞれ４ ８ ５ｎｍおよび５ ３ ５ｎｍであった。 少なくとも三つの並列試験を行った。細胞内総スーパーオキシドジスムターゼ（T-SOD）は、南京Jiancheng Bioengineering Instituteから購入したT-SODキットの指示に従って決定した。

細胞内総スーパーオキシドジスムターゼ（T-SOD）は、南京Jiancheng Bioengineering Instituteから購入したt-SOD Ｍ９で３回洗浄した後、検査した線虫を超音波で破壊し、Ｔ−ＳＯＤキットと反応させた。 吸光度波長は５ ５ ０ｎｍであった。 さらに、上清を使用して、吸光度波長が５ ９ ５ｎｍであった各濃度のタンパク質のレベルを検出した。 少なくとも三つの並列試験を行った。2.7.

2.7. データ分析

すべてのデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）として一元ANOVAを用いて与えられた。

すべてのデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）とし グラフはOrigin8.5およびGraphPad Primer7を使用して提示され、統計分析はSPSS19.0ソフトウェアを使用して実行されました。 統計的有意水準は、およびを用いて行った。

3. 結果

3.1. Cの移動挙動の決定。 elegans after Carbendazim Acute Exposures

LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.

Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. 線虫の頭部スラッシュ頻度と体曲げ時間に関するデータを分析することにより、carbendazim急性曝露後のelegans（図1（a）と1（b））。 それらの両方は、0.01μ g/Lから100μ g/L（）の範囲のカルベンダジム濃度で有意な減少を示した。 さらに、100μ g/Lに曝された線虫の頭部スラッシュは68.27％に減少した。 ボディベンドテストでは、カルベンダジム濃度が10μ g/Lおよび100μ g/Lの場合、c.elegansのボディベンドに対してそれぞれ36.77％および35.48％の有意な阻害効果

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Effects of C. elegans on physiological traits exposed to carbendazim. (a) The head thrashes of C. elegans after carbendazim exposure; (b) the body bends of C. ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ曝露後の線虫；（ｃ）ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ曝露後の線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの体長；および（ｄ）ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ曝露後の線虫ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの体表面積。 データ（平均±SEM）は、対照群と比較した百分率値として図に示されている。 アスタリスクは、各曝露群と対照群（および）との間の有意性を示す。

3.2. Cの成長と発展の決定。 Carbendazim急性曝露後のelegans

対照群と比較して（図1（c）および1（d））、体の長さおよび体表面積は、曝露群で0.01μ g/Lから100μ g/Lに有意に減少した（）それらの両方は、対照群と比較して19.16％および22.15％減少した。0.01μ g/Lの治療では、それぞれ0.01μ g/Lの治療で減少した。 10μ g/Lの濃度は、最も負の影響を提示し、c.elegansの体の長さと体表面積は、それぞれ対照群と比較して35.21％と65.22％減少した。

3.3. C.elegansのひなのサイズの決定Carbendazim急性曝露後

図2によると、線虫のひなのサイズは、0.1μ g/Lから100μ g/Lまでの治療群で有意に減少した（）。c.elegansのひなのサイズは、対照群と比較して43.71％に減少した。10μ g/Lの治療では、対照群と比較して減少した。

図2

carbendazimにさらされたひなのサイズに対するc.elegansの影響。 データ（平均±SEM）は、対照群と比較した百分率値として示される。 アスタリスクは、各曝露群と対照群（および）との間の有意性を示す。

3.4. Carbendazim急性曝露後のc.elegansの寿命の決定

c.elegansの寿命は、図3に示す寿命曲線に従って0.01μ g/Lから100μ g/L carbendazimによって有意に阻害された。 結果は、c.elegansの寿命が24から20日に0.01μ g/Lカルベンダジムの治療で減少したことを示した。 0.01μ g/L carbendazimで処理された線虫の寿命は20.00％減少した。 カルベンダジム暴露濃度が100μ g/Lであったとき、c.elegansの寿命は45.83％最も減少した。

図3

carbendazimにさらされた生存に対するc.elegansの影響。 データ（平均±SEM）は、対照群と比較した百分率値として示される。 アスタリスクは、各曝露群と対照群（および）との間の有意性を示す。

3.5。 C.elegans

異なる濃度のc.elegans曝露における対照および治療されたc.elegansのROSレベルを図4(a)に示す。 細胞内ROSのレベルは、0.01μ g/Lから100μ g/Lのカルベンダジムの範囲で有意に増加したことが示された（）。 対照と比較して、ROSレベルは最大で70.60％増加し、10μ g/Lの処理では細胞内SODレベルの結果によれば、0からの処理で増加した。01μ g/Lから100μ g/Lのカルベンダジム(図4(b))。 SODレベルは、対照群と比較して10.70μ g/Lカルベンダジムで0.1％増加した。div>

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)
(a)
(a)
(b)

4. 議論

Carbendazimは、殺菌剤として、真菌の増殖を阻害するために農業で広く使用されています。 Carbendazimは厳しい毒性学および耐久性がある性質のためにオーストラリア、欧州連合のほとんど、および米国で使用するために禁止されました。 この研究では、Cを使用するのは初めてでした。 モデル生物としてのelegansは、機関車の行動、成長と発達、生殖、寿命、および抗酸化システムに対するcarbendazimの効果を評価する。 さらに，ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに負の影響を及ぼすことを示した。

24h-LC50によれば、異なる濃度のカルベンダジムに曝された線虫の急性毒性濃度は0.867mg/Lである。 プロイセンのコイCarassius gibelioの卵は0.036mg/Lの集中で毒性の効果を示しました。 研究では、Navicula spの成長と発達が示された。 カルベンダジムによって阻害され、24h-EC50値は2.18mg/Lであるが、72h暴露後に藻類の成長速度が回復するが、カルベンダジムの処理が0.5mg/Lを超えていたときにクロロフィル-a含有量が有意に減少したままである。 この現在では、c.elegansカルベンダジムの低濃度にさらされた人間の毎日の暴露の実際の濃度に応じてその効果を評価するために選択されました。 Carbendazimの低濃度は、それが安全であることを意味するものではありません。 カルベンダジムは、いくつかの研究ではるかに低い用量で負の生物学的影響を示しています。

機関車の挙動は、c.elegans（L4幼虫）の神経毒性を評価するために評価されたcarbendazimへの24時間暴露後。 その結果，ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの頭部スラッシングと体曲げの検出により，ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍは機関車の挙動に負の影響を及ぼすことが分かった。 カルベンダジムに曝されたゼブラフィッシュの胚の機関車の挙動は敏感である。 これまでの研究では、カルベンダジムの致死下濃度が0.22–0.43mg/Lの場合、魚は異常な行動を示すことが示されています。

発達奇形はまた、異常な歩行の一つの理由である可能性があります。 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの成長と発達をアッセイした。 結果はC.elegansのボディ長さそしてボディ区域が0.01μ g/L carbendazimを超過する処置でかなり狭くなったことを示しました。 脊椎動物の正常な成長は新陳代謝の甲状腺ホルモンの恒常性と関連しています。 Williams et al. carbendazimにより注入、胎児の奇形および遅い成長および開発の後で精液の損失を引き起こすことができることを示しました。

カルベンダジムの生殖毒性は、カルベンダジムが真菌および哺乳動物細胞の微小管重合を阻害し、β-チューブリンと作用することによって微小管集合の破壊を引き起こし、細胞分裂の過程で染色体の分離を損なうことが示されている。 Α-およびβ-チューブリンの非共有結合による微小管の形成は、有糸分裂および減数分裂の過程における染色体分離の原因である。 C.elegansのひなのサイズは、0.1μ g/Lのカルベンダジム濃度で有意に減少する。 カルベンダジムは日本のウズラやハムスターの再生システムに影響を与えることが分かっている。 これは、c.elegansの寿命が有意に我々の研究に基づいて≤0.01μ g/Lのカルベンダジム濃度で減少したと結論された。 調査はcarbendazimが不妊および発生の毒性の原因となり、異なった哺乳類種の胚の毒性、生殖細胞のapoptosisおよび催奇形性を明示することを示しました。

アポトーシスは、一連の細胞プロセスによって特徴付けられる高度に調節された現象である複雑なプログラムされた細胞死である。 多くの研究は、酸化ストレスによって誘導されるROSの産生がアポトーシス細胞死に関連していることを示している。 私たちの研究では、カルベンダジムはROS値のレベルの有意な増加とSOD値のレベルのわずかな増加を誘発する可能性があることがわかりました。 環境汚染によって引き起こされる酸化圧力はROSの高められた表現を引き起こし、続いて酸化防止防衛システムを損ないます。 SODは酸化圧力のレベルおよび細胞酸化防止状態を評価するのに使用されている活動および有毒な遊離基の解毒に責任があります。 メタロ酵素SODは、内因性細胞傷害性スーパーオキシドラジカルのH2O2への変換を加速し、SOD発現レベルの増加は、カルベンダジムによって誘導されるスーパーオキシドラジカルを排除し、カルベンダジムの暴露中に細胞機能不全の発生を防止するために、酵素活性の改善に寄与する可能性がある。 Carbendazimのより高い露出の集中により続いて細胞の恒常性のバランスを破壊し、apoptosisを促進する厳しい酸化圧力を引き起こすことができます。 しかし、低濃度のカルベンダジムは、我々の結果によれば、依然として生殖器系に有意に損傷を与える可能性がある。

5. 結論

私たちが知る限り、本研究では、c.elegansに初めて暴露されたcarbendazimの安全性を評価しました。 それはcarbendazimがc.elegansの機関車の行動、開発および成長、再生、寿命および酸化防止システムに対する有害な効果をもたらすことができることを示しました。 結果に基づいてcarbendazimの適用にもっと注意を払う必要があることを願っています。 さらに、使用のためのcarbendazimの安全性、特に生物蓄積毒性および潜在的な遺伝毒性効果をさらに評価する必要があります。

データの可用性

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この記事に含まれています。

利益相反

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、中国の国家自然科学財団（31501569）によって支援されました。