ヒト細胞表面マーカースクリーニング

HescおよびhPSC-RPE細胞をTrypLEを用いて5〜10分間単細胞に解離させた。 視神経小胞を、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１ ０分間、単細胞に解離させ、続いて２ ０Ｇの針を介して物理的解離させた。 同じ試料中のこれらの異なる集団の同時分析を可能にするために、ＨＥＳＣ、ＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞、および視小胞細胞を、製造業者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従い、３ ７℃で７分間Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（０． 次いで、製造業者のプロトコルに従って、Ｂ Ｄ Ｌｙｏｐｌａｔｅ（商標）Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐａｎｅｌｓ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、３つの細胞型を染色した。 細胞のバーコードは、細胞の三つのグループを容易に区別し、スクリーニング中のサンプル変動を最小限に抑えることができました。 試料は、４ ０ ５、６ ４ ０、４ ８ ８、３ ５ ５、および５ ６ １ｎｍのレーザー（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を装備したＬｓｒｆｏｒｔｅｓｓａまたは４ ０ ５、６ ３ ８、４ ８ ８、および５ ６ １ｎｍのレーザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を装備したＣｙｔｏｆｌｅｘ上の９ ６ウェルプレート上で分析した。 非生存細胞を、７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）核酸色素（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた分析から除外した。 データの分析は、FlowJo v.10ソフトウェア（Tree Star）を使用して行った。 細胞表面マーカースクリーンは、３Ｄ視覚小胞に対して１回、およびＨＰＳＣ−ＲＰＥ６ ０日目に１回実施した。

細胞培養

hESC株HS980およびHS983は、以前に誘導され、xenoフリーおよび定義された条件下で培養された30(Swedish Ethical Review Authority:2011/745:31/3)。 ドナーは、hESCラインの導出とその後の使用のためのインフォームドコンセントを与えました。 ＷＡ０ ９／Ｈ９ｈＥＳＣ系統をＷｉｃｅｌｌから得、ｈｒｌｎ−５ ２ １（１ ０μ ｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）上のフィーダーフリー培養に適合させた。 細胞を、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中のｈｒｌｎ−５ ２ １被覆プレート上のクローン増殖によって、５％ＣＯ２／５％Ｏ２インキュベーター中で維持し、５〜６日ごとに１：１ ０比で酵素的に継代した。

hiPSCラインCTRL-7-II、CTRL-9-II、CTRL-12-I、およびCTRL-14-IIは、Karolinska Institutet iPSC Core facility（スウェーデンの倫理審査機関）によって親切に提供されました: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). ドナーは、hiPSCラインの導出とその後の使用のためのインフォームドコンセントを与えました。 細胞を、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中のｈｒｌｎ−５ ２ １被覆プレート（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）上のクローン増殖によって維持し、５％ＣＯ２／５％Ｏ２インキュベーター中で、５〜６日ごとに１：１ ０比で酵素的に継代した。継代のために、コンフルエント培養物をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３ ７℃で５分間、５％ＣＯ２／５％Ｏ２をＴｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔで 次いで、酵素を慎重に除去し、穏やかなピペッティングによって新鮮な予め温められたＮｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地中で細胞を回収して、単一細胞懸濁液を得た。 細胞を３ ０ ０×ｇで４分間遠心分離し、ペレットを新鮮な予め温めたＮｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地に再懸濁し、そして細胞を新鮮なＨＲＬＮ−５ ２ １被覆皿上に播種した。 通過の２日後、培地を、新鮮な予め温められたＮｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地と交換し、毎日交換した。

hPSC-RPE単層分化

分化プロトコルを記述するステップバイステップのプロトコルは、プロトコルExchange36で見つけることができます。 hESCまたはhiPSCは、NutriStem hPSC XF培地を使用してラミニンコートディッシュ（20μ g/mL）上に2.4×104細胞/cm2の細胞密度でめっきした。 最初の２ ４時間に１ ０μ Ｍの濃度のｒｈｏ−キナーゼ阻害剤（Ｙ−２ ７ ６ ３ ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加し、一方、細胞を３ ７℃、５％ＣＯ２／５％Ｏ２に保った。 ２ ４時間後、ＨＰＳＣ培地を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および形質転換増殖因子−β（Ｔｇｆ Β）（生物学的産業）を含まない分化培地Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆと交換し、細胞を３ ７℃、５％ＣＯ２／２ １％Ｏ２ めっき後６日目から、１ ０ ０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＜ｄｉｖ ｉ ｄ＝”２ｃｄ６ ０ ４ ４ ０ｂ５”＞＜／Ｄｉｖ＞Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を培地に添加した。 細胞は週に三回供給され、30日間保持された。 次いで、単分子層を、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３ ７℃、５％ＣＯ２で１ ０分間トリプシン化した。 酵素を慎重に除去し、bfgfおよびTgf Βを含まない新鮮な予め温めたNutristem hPSC XF培地中で穏やかなピペッティングによって細胞を回収し、単細胞懸濁液を得た。 細胞を３ ０ ０×ｇで４分間遠心分離し、ペレットを再懸濁し、細胞ストレーナー（ø40μ m、BD Biosciences）に通し、細胞をラミニン被覆ディッシュ（20mg/mLのhrLN-111およびhrLN-521）上に、1.4×106から1.4×104細胞/cm2の範囲の異なる細胞密度で播種した。 その後の３ ０日間に、ｂｆｇｆおよびＴｇｆ Βを含まないＮｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＰＳＣ Ｘ Ｆ培地を週に３回給餌した。 3D懸濁液EBsにおけるhpsc-RPE in vitro分化のために、我々は以前に公開されたprotocol10に従った。 手短に言えば、多能性幹細胞をｒＨＬＮ−５ ２ １上で合流するように培養し、１ ０ ０ ０μ ｌのピペットチップを使用して手動で掻き集めてＥｂｓを産生した。 次いで、Ｅｂｓを、５〜７×１ ０ ４細胞／ｃｍ２の密度で低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の懸濁液中で培養した。 分化は、ｂＦＧＦおよびＴｇｆ Βが培地変更により週２回除去されたカスタムメイドのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ ＨＥＳＣ Ｘ Ｆ培地で実施した。 Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632、Millipore）のテンマイクロモールは、最初の24時間の間にのみ懸濁培養物に添加されました。5週間の分化に続いて、色素領域は、機械的にメスを使 次いで、細胞をＴｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔを使用して解離させ、続いて２ ０Ｇの針および注射器を介してフラッシュさせた。 細胞は、細胞ストレーナー（ø40μ m、BD Biosciences）を通して、0の細胞密度でLNコーティングされたディッシュ上に播種した。２×１ ０ ４細胞／ｃｍ２を１週間に２回給餌し、上記と同じ分化培地を与えた。 明視野画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔ Ｅ２ ０ ０ ０−Ｓ顕微鏡で取得し、ｃａｎｏｎ ＳＸ１ ７ ０ｉｓカメラを使用して、ウェルの上部から色素沈着を捕捉した。Rneasy Plus Mini Kitを使用して全RNAを単離し、RNase-free DNase（両方ともQiagen製）で処理した。

定量的リアルタイムPCR

全RNAをRnase-free DNase（両方ともQiagen製）で処理した。

ランダムなヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２ ０μ ｌの反応混合物中の１μ ｇの全ＲＮＡを使用して、製造業者の説明書に従って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。

フローサイトメトリー

細胞選別は、分化の21または30日後にhPSC-RPE培養物に行われました。 細胞を上記の結合抗体と氷上で３ ０分間インキュベートした。 FMOコントロールは、ゲート陰性および陽性細胞を同定および同定するために、各条件について含まれていた。 １を使用してＢ Ｄ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ融合細胞選別機（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色細胞を選別した。選別直後に、１ ０ ０μ ｌの２％ＦＢＳおよび１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）に希釈した７ ０，０ ０ ０個の細胞を、ガラススライド上に４ ０ ０ｒ．ｐ．ｍ．で５分間細胞スピン処理した。＜／ｐ＞＜ｐ＞１ ０ ０％ＦＢＳおよび１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を、４ ０ ０ｒ．ｐ．ｍ． スライドを室温で一晩乾燥させた後、室温で４％のメタノールを含まないホルムアルデヒドで１ ０分間固定し、免疫蛍光染色した。

免疫蛍光

組織学および組織免疫染色

100mg/kgペントバルビタールの静脈内注射による安楽死直後（Allfatal vet. 100mg/mL、Omnidea）、眼を脱核し、bleb注射領域は緑色組織マーキング色素（TMD）（Histolab製品）でマークされた。 100μ lの固定溶液（FS）4％緩衝ホルムアルデヒド（Solvenco AB）からなるの硝子体内注射は、24-48時間のFSで固定し、パラフィンに埋め込む前に行われました。 ＴＭＤ標識領域を通って四マイクロメートルの連続切片を作製し，四つの切片ごとにヘマトキシリン-エオシンで染色した。

免疫染色のために、スライドをキシレン中で脱脂し、グレードアルコール中で脱水し、ddh2oおよびTris緩衝生理食塩水（TBS、pH7.6）ですすいだ。 ０）中で、１：２ ０ ０ ０Ｔｗｅｅｎ−２ ０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を９ ６℃で３ ０分間冷却した後、室温で３ ０分間冷却して、抗原の回収を達成した。 スライドをＴＢＳで洗浄し、５％（ｗ／ｖ）Ｉｇｇおよびプロテアーゼを含まないウシ血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を含むＴＢＳで希釈した１ ０％正常ロバ血清（Ａｂｃａｍ）で３ ０分間遮断した。 ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体を、４℃で一晩インキュベートした：ヒト核有糸分裂装置タンパク質（Ｎｕｍａ）（１：２ ０ ０、Ａｂｃａｍ ａ ｂ８ ４ ６ ８ ０）、ＢＥＳＴ−１（１：２ ０ ０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ５ ４ ６ ６）、Ｃｄ１ ４ ０Ｂ／ＰＤＧＦＲＢ（１：１ ０ ０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ−４ ３ ２）、お 二次抗体（ロバ抗ウサギＩｇｇ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ５ ５Ａ３ １ ５ ７ ２およびロバ抗マウスＩｇｇ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６ ４ ７Ａ３ １ ５ ７ １、両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）（補足データ２）ブロッキング緩衝液中で１：２ ０ ０に希釈 切片を、ＤＡＰＩ（（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール））取付媒体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を有するｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄと共に、２ ４×５ ０ｍｍ２のカバースリップ下に取り付けた。免疫組織化学のために、スライドを脱アフィン化した後、抗原検索（ＥＲ２溶液、ｐＨ９、２ ０分、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣｄ１ ４ ０Ｂ／ＰＤＧＦＲＢ（１：１ ０ ０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ−４ ３ ２）およびＣＤ５ ６／ＮＣＡＭ１（１：１ ０ ０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ−７ ３ ２ ６、クローン）抗体

画像は、Olympus IX81蛍光倒立顕微鏡またはZeiss LSM710-NLO点走査共焦点顕微鏡で撮影した。 画像の取得後の分析は、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを用いて行った。

食作用アッセイ

フルオレセインイソチオシアネート標識されたウシPOSsを単離し、Institut de la Vision、Paris37からDr.E.F.Nandrotによって親切に与えられた。 ＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、播種後１ヶ月間、ｈｒｌｎ−５ ２ １ ２ ０μ ｇ／ｍｌで被覆したトランスウェル膜（０． ４ ２×１ ０ ６解凍したＰＯＳ／ＴｒａｎｓｗｅｌｌをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）またはＣＯ２非依存性培地（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）中にそれぞれ希釈して、細胞を３ ７℃または４℃で１ ６時間インキュベートした。 培養後、細胞をトリパンブルー溶液０でクエンチした。２％（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１ ０分間固定し、４％メタノールを含まないホルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温で１ ０分間固定し、Ｄ−ＰＢＳ中の０． Rhodamine phalloidin染色（1：1000、室温で20分、Biotinum00027）（補足データ2）は、細胞境界を視覚化するために使用された。 核をＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２で染色した（１：１ ０ ０ ０、室温で２ ０分、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

画像はZeiss LSM710-NLO点走査共焦点顕微鏡で取得した。 画像の取得後の分析は、Imaris(Bitplane)を使用して行われ、POS定量化はCellProfiler2.1.1ソフトウェアで行われました。 使用されるモジュール:LoadImages、ColorToGrey、IdentifyPrimaryObjects、MeasureObjectSizeShape、SaveImages、およびExportToSpreadsheet。 オブジェクトは、10-40ピクセル単位の典型的な直径によって識別された二つのクラス、グローバル、大津、0.01と1.0下限と上限と2.1補正係数を持つ重み付け分散しきい値法を使用して、凝集したオブジェクトを強度によって区別しました。

酵素結合免疫吸着アッセイ

hPSC-RPE細胞は、異なる基質でコーティングされたトランスウェル膜（0.33cm2、ミリポア）上で培養した。 ＨＰＳＣ−ＲＰＥ頂端側および基底側（それぞれ、トランスウェルの上部および下部区画を意味する）の両方からの上清を、培地を変更した６ ０時間後に収集した。 ＰＥＤＦ分泌レベルを、市販のヒトＰＥＤＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ ＲＤ１ ９ １ １ １ ４ ２ ０ ０Ｒ）を使用して、６ ０日間の培養後、製造者の説明書に従って、各状態について三重に測定した。 光学密度測定は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ２ ５ ０Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定した。 結果は、平均±ＳＥＭとして提示される。３ ３ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にめっきされた経上皮電気抵抗ｒｐｅセルを、ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｖｏｌｔ−ｏｈｍ ｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ Ｘ Ｔ−２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、製造業者の指示に従って測定した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ＴＥＥＲ測定＜／Ｈ３＞＜ｐ＞経上皮電 六十日間の培養は、実験の前に15-20分間室温でインキュベーターの外で平衡化した。 測定は、各ウェルの三つの異なる位置で、各条件のために三重に未変化の培養培地で行われました。 さらなる分析のために平均値を使用した。 背景抵抗は、対応する基質で被覆されたが細胞を含まない同じ培地中のブランク培養インサートから決定し、それぞれの実験条件から減算した。 測定値は、オーム単位の抵抗に平方センチメートル(Ω×cm2)の面積を掛けたものとして報告されます。 結果は、平均±ＳＥＭとして提示される。Ｈｐｓｃ−ＲＰＥ細胞を、ＬＮ５ ２ １（２ ０μ ｇ／ｍｌ）で被覆されたｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート上で６ ０日間増殖させた。

走査型電子顕微鏡法

ＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、ＬＮ５ ２ １（２ ０μ ｇ／ｍｌ）で被覆されたｔｒａｎｓｗｅｌｌイン それらは2.5%グルタルアルデヒドに0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4に浸漬することによって固定された。 二酸化炭素（Ｌｅｉｃａ Ｅ Ｍ ＣＰＤ０ ３ ０）を使用して段階的エタノール脱水および臨界点乾燥の前に、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を切り出し、Ｍｉｌｌｉｑ水で洗浄した。 インサートは、炭素接着タブと白金（クォーラムQ150T ES）の薄い層でコーティングされたスパッタを使用して試料スタブに取り付けられました。 走査型電子顕微鏡画像を、３ｋＶでの超電界放出走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＥ２検出器を用いて取得した。Ｈｐｓｃ−ＲＰＥ細胞を、ＬＮ５ ２ １（２ ０μ ｇ／ｍｌ）で被覆されたｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート上で６ ０日間増殖させた。＜／ｐ＞＜ｈ３＞透過型電子顕微鏡法＜／ｈ３＞＜ｐ＞ＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、ＬＮ５ ２ １（２ ０μ ｇ／ｍｌ）で被覆されたｔｒａｎｓｗｅｌｌイン それらは2.5%グルタルアルデヒドに0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4に浸漬することによって固定された。 Transwell膜を切り出し、薄いストリップに、0.1Mリン酸緩衝液ですすぎ、続いて2％四酸化オスミウム0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4、4℃で2時間固定した。 膜ストリップは、段階的エタノール脱水に供され、最終的にLX-112に埋め込まれた平らな。 極薄切片（〜50〜60nm）をLeica EM UC7を用いて調製し、酢酸ウラニルと対比し、続いてクエン酸鉛と対比した。 ８ ０ｋＶで動作したＨｉｔａｃｈｉ ｈ Ｔ７ ７ ０ ０透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ Ｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で透過型電子顕微鏡イメージングを行い、Ｖｅｌｅｔａ ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いてデジタル画像を取得した。ＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔを用いて解離させ、細胞ストレーナー（ø４ ０μ ｍ、Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞単細胞ＲＮＡ−配列決定バイオインフォマティック分析＜／Ｈ３＞＜ｐ＞６ ０日目のＨＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔを用いて解離し、細胞ストレーナー（ø４ ０μ ｍ、Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通した。 それらを、PBS中の0.04％BSA中の1000細胞/μ Lの濃度で再懸濁した。 細胞を４℃で真核生物単細胞Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＥＳＣＧ，Ｓｃｉｌｉｆｅｌａｂ，Ｓｔｏｃｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に輸送し、ここで、３’ｃＤＮＡライブラリーを、ｎｏｖａｓｅｑ６ ０ ０ ０ソフトウェアを使用して、１ ０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ（１ ０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて単細胞ＲＮＡ配列決定のため セルレンジャー2.1.1(10x Genomics)pipelineを使用して、Illumina base callファイルをfastq形式に変換し、star aligner38を使用してhg19トランスクリプトームにシーケンシング読み取りを整列させ、特徴バーコード行列を生成した。 Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ−ｃｏｎｔｒｏｌ濾過された細胞（７ １ ８、８ １ ０、９ ３ １、および１ １ ２ ９個の細胞含有液滴を、Ｃｄ１ ４ ０Ｂ＋ＧＤ２−、Ｃｄ１ ４ ０Ｂ＋ＣＤ１ ８ ４−、それぞれ１：２ ０およびｈＥＳＣ試料を複製した）を、Ｒバージョン３． として更に品質管理測定、培養網膜色素上皮細胞に特有の発現遺伝子（≥2000年≤5000),UMIs(≥10,000≦≦30,000）の割合海のマッピングMT遺伝子(≥0.025≦≦0.10)を選択します。 同様に、hESC独自の発現遺伝子（≥2000年≤8000),UMIs(≥10,000≦≦80,000)、比率海のマッピングMT遺伝子(≥0.025≦≦0.10). この濾過ステップは、Ｃｄ１ ４ ０Ｂ＋ＧＤ２−、Ｃｄ１ ４ ０Ｂ＋ＣＤ１ ８ ４−、再生１：２ ０およびＨＥＳＣ試料について、それぞれ６ １ ６、７ ２ ５、７ ７ ９、および９ ０ ５細胞の最終データセットをもたらした。 主成分（PC）分析による次元減少の前に、UMIsによって駆動される遺伝子発現の細胞間変異、ミトコンドリア遺伝子発現、および細胞周期段階は、データスケー RPEサンプル内の可変遺伝子を、それらの正規化された平均発現および分散に基づいて選択した（発現カットオフ＝0.0125-5、および底部分散カットオフ＝0.5）。 PCの選択のために、PCHeatmap、jackStraw、PC標準偏差、およびClustree分析の所見が評価された43。 最初の15個はtSNE projection44とクラスタリング解析に使用されました（resolution=0.1、perplexity=40）。

細胞クラスターは、二つのアプローチによって分析されました。 トップ差動遺伝子は、最初にWilcoxonのランク合計テストを使用して、各クラスターのために同定されました。 二次、署名遺伝子発現（モジュールスコア）は、未分化hESCとヒト網膜に存在するいくつかの細胞型のために計算されました。 中胚葉マーカーを発現する細胞は、手動でSeuratの対話型プロット機能を使用して別のクラスターに細分されました。 データはArrayExpress(EMBL-EBI)にアップロードされます—詳細は以下を参照してください。

動物

北ストックホルム動物実験倫理委員会（DNR N25/14）の承認後、10ニュージーランド白アルビノウサギ（Lidköpings rabbit farm、Lidköping、スウェーデンによって提供された）5ヶ月、3.5-4.0kg すべての実験は、眼科および視力研究における動物の使用に関する声明に従って実施した。

網膜下移植

hPSC-RPE単分子層をPBSで洗浄し、TrypLEでインキュベートし、単細胞懸濁液に解離した。

網膜下移植

hPSC-RPE単分子層をPBSで洗浄し、TrypLEでインキュベートした。 ４％Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）を使用してＮｅｕｂａｕｅｒ血球計チャンバ中で細胞を計数し、３ ０ ０×ｇで４分間遠心分離し、細胞ペレットを新たに濾過滅菌したＰＢＳ中に再懸濁し、最終濃度１ ０ ０ ０ 次いで、細胞懸濁液を６ ０ ０μ Ｌ単位に無菌的に分注し、手術まで氷上に保持した。

動物は、35mg/kgのケタミン（ケタミン、100mg/mL、Intervet）および5mg/kgのキシラジン（Rompun vet. 20mg/mL、バイエル動物の健康）、および瞳孔は、0.75％シクロペントラート/2.5％フェニレフリン（APL）の混合物で拡張した。 前に記載されているように、2ポート25G transvitreal pars plana技術（Alcon Accurus、Alcon Nordic）を使用して両眼に顕微手術を行った45。 細胞懸濁液を、延長管および３ ８Ｇ ｐｏｌｙｔｉｐ ｃａｎｎｕｌａ（Ｍｅｄｏｎｅ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｃ）に接続された１ｍＬの注射器に引き込んだ。 硝子体切除術を行わず，カニューレを上側頭葉を通して挿入した。 焦点網膜フレアによって確認された適切な先端位置決めの後、50μ lの細胞懸濁液（50,000細胞に相当）を、視神経頭部の下縁よりも6mm下にゆっくりと網膜下に注入し、操作顕微鏡下ではっきりと見える均一なblebを形成した。 逆流を最小限に抑えるために、注射中にbleb内の先端を維持するように注意した。 器具を除去した後，自己密封縫合糸レス硬化術に光圧を加えた。 硝子体内トリアムシノロン（Triescence、Alcon Nordic）の二つのマイクログラム（100μ l）は、手術の1週間前に投与され、手術後の抗生物質は与えられなかった。

統計と再現性

統計分析のために、分散の双方向分析とTukeyのテスト補正を用いた事後多重比較は、TEERとPEDF分泌アッセイにおける評価された異

すべての定量化は、盲検で行われました。 定義およびnの正確な値を含む統計的パラメータ（例えば、実験の総数、複製など）。)、偏差、P値、および統計的検定のタイプは、図、対応する図の凡例、およびこのセクションで報告されています。 統計分析は、Ｐｒｉｓｍ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ７． すべての場合において、少なくとも三つの生物学的に独立した実験複製からのデータについて統計的分析を行った。 グループ間の比較は、統計的試験の前に計画され、目標効果サイズは事前に決定されなかった。 グラフに表示される誤差バーは、少なくとも3つの独立した実験の平均±SEMを表します。 示されている全ての顕微鏡写真は、特に断りのない限り、３つの独立した実験の代表的な画像である（例えば、図１ ０Ａ）。 1c）。

報告概要

研究デザインに関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。