動物

ゼブラフィッシュを、Danieau溶液中で14時間オン|10時間オフの光サイクルで28.5℃に維持した。 組合せ結晶変異体（albb4/b4;nacrew2/w2;roya9/a9）は、3つの異なる単一変異体株、すなわちnacrew2/w2を順次交配することによって生成された（参考文献1）。 9）、roya9/a9（ref. およびａｌｂｂ４／ｂ４（ｒｅｆ． 18）変異体。 重要なことに、幼虫と成体の結晶ゼブラフィッシュの両方が実行可能であり、色素沈着表現型以外の目に見える形態学的、機能的または行動的異常を表 Ｃａｓｐｅｒ変異体は、以前に記載されたように、ｎａｃｒｅｗ２／ｗ２およびｒｏｙａ９／ａ９変異体を交雑することによって得られた４。 野生型ゼブラフィッシュを得るためにＡ ｂ系統を用いた。 この研究で使用されるトランスジェニック系統には、Ｔｇ（ｅｌａｖｌ３：Ｇｃａｍｐ５Ｇ）２ １およびＴｇ（ｅｌａｖｌ３：ＧＣＡＭＰ６Ｆ）２ ８が含まれる。 真珠層変異体において共焦点機能イメージング実験を行った。 真珠層，ｃａｓｐｅｒおよび結晶変異体においてライトシートイメージング実験を行った。 結晶幼生において二光子機能イメージング実験を行った。 ゼブラフィッシュの幼虫をPTUで処理するために、我々は標準的な手順8に従った、具体的には幼虫を受精後24時間（hpf）からDanieau溶液中で200μ M PTU（Sigma）で飼育した。 視覚テクタムにおける視覚的に誘発された神経活動の共焦点機能イメージングに使用されるtg（elavl3：Gcamp5G）幼虫は、200μ m PTU24hpfから3dpfで処理し、4dpfでイメー この作業は、地元の動物福祉および倫理審査機関（King’s College London）によって承認され、英国内務省（PPL70/8057）からのライセンスの下で、1986年の動物（科学的手順）法に従

イメージング

全動物in vivo顕微鏡

成体ゼブラフィッシュの全動物画像は、Sigma150mmマクロレンズを搭載したNikon D7000デジタル一眼レフカメラ 成体ゼブラフィッシュは0で麻酔した。２％トリカイン（ＭＳ２ ２ ２、Ｓｉｇｍａ）を魚施設水中に入れ、魚施設水を含む９ ０ｍｍのペトリ皿中に入れた。 幼虫の撮像は、Ｅｘｉ Ｂｌｕｅ ＣＣＤカメラ（Ｒｅｔｉｇａ）およびＶｏｌｏｃｉｔｙ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に接続されたＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を使用して行った。 幼虫のゼブラフィッシュはDanieauの解決の0.02%のトリカインと麻酔し、ガラススライドの1%の低い融点のアガロース（シグマ）で固定化しました。

共焦点カルシウムイメージング

イメージングは、スペクトル検出走査ヘッドと20X/1を備えたZEISS LSM710共焦点顕微鏡を用いて行った。0NA水浸の目的（Carl Zeiss）。 網膜神経節細胞（RGCs）における視覚的に誘発されたカルシウム応答の機能的な時系列は、4.1Hzと0.415×0.415μ mの解像度（256×256ピクセル）、および1AUのピンホールア 励起光は、488nmのマルチラインレーザーによって提供された。 非麻酔Tg（elavl3：Gcamp5G）幼虫は、Danieau溶液中で調製した2％低融点アガロース（Sigma）に固定化し、カスタムメイドのDanieauで満たされたチャンバーに配置された隆起したガラ アガロースは幼虫を抑制するのに十分であったので，麻酔は必要なかった。 イメージングは午後（1-8pm）に行われた。

ライトシートイメージング

全脳ライトシートイメージングは、二つの10X/0.2NA照明目的と一つの20X/1.0NA水浸検出目的（Carl Zeiss）を備えたZEISS Lightsheet Z.1顕微鏡 488nmのレーザー励起光をGcamp6F蛍光を引き出すために使用し、505-545BPフィルターを放出された光検出のために使用しました。 ピボットスキャナ（Carl Zeiss）は、均質な照明を提供し、したがって、照明軸に沿った影を避けるために使用されました。 ライトシートの厚さは、中心部で5.39μ m、視野の端部で10.8μ mであった。 体積画像のサイズは623×798×283μ m3（1500×1920×490ピクセル）で、解像度は0.415×0.415×0.631μ mであった。 ４ｄｐｆ真珠層、ｃａｓｐｅｒおよび結晶Ｔ Ｇ（ｅｌａｖｌ３：Ｇｃａｍｐ６Ｆ）幼虫を、Ｄａｎｉｅａｕ溶液中で調製したα−ブンガロトキシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｔｉｕｍ）中で、最初に１ ０〜１ ５分間麻痺させた。 続いて、幼虫を２％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ）中に固定化し、ガラス毛細管（２ ０μ ｌ体積、７ ０ １ ９ ０ ４；Ｂｒａｎｄ）の中に入れた。 その後，幼虫の頭部を含むアガロースシリンダーの部分を毛細管から押し出し，頭部の背側が検出目的に面し，眼が二つの照明目的に面しているように幼虫を配向させた。 Casper変異幼虫の全脳ライトシートイメージングは、Dr Martin Meyer（King’s College London）によって構築され、20X/1.0NA水浸XLUMPlanFLN検出対物レンズ（Olympus）を装備したカスタムメイドのライトシート

二光子カルシウムイメージング

網膜における二光子機能イメージングは、4チャネルGaAsP NDDとアポクロマート25X/1.1NA水浸対物レンズ（Nikon）を備えたNikon A1R MP 励起は、930nmに調整されたChameleon Ultra IIモードロックチタンサファイアレーザー（コヒーレント）によって提供された。 視覚的に誘発されたカルシウム応答の時系列は、4Hzおよび0.248×0.248μ mの解像度（512×256ピクセル）の速度で取得された。 レーザースキャンの活性化に続いて、我々は、多光子レーザーによって引き起こされる背景光レベルに適応網膜を確保するために、視覚刺激を開始する前に60秒 4dpf結晶Tg(elavl3:Gcamp6F)幼虫最初10-15分間α-ブンガロトキシン(1mg/ml;Biotium)ダニエー溶液で調製した麻痺しました。 その後、幼虫は2％の低融点アガロース（シグマ）に固定化され、背側を上（45°の角度の傾き）に上げたカスタムメイドのガラスプラットフォームに取り付けられ、一方の目はカスタムメイドのDanieauで満たされたチャンバーの下に置かれたLCDスクリーン（視覚刺激を参照）に面していた。 イメージングは午後（1-8pm）に行われた。

視覚刺激

共焦点調製における移動バー

移動バー刺激は、以前に記載されたように生成された22,33。 拡散フィルタ（３ ０ ２ ６、Ｒｏｓｃｏ）をチャンバの一方の側に接着して投影スクリーンとして機能させた。 投影スクリーンに面した目の前のアガロースは取り除かれ、チャンバーの側面に投影された画像の遮るものがないビューを可能にしました。 幼虫はスクリーンから3cm離れた位置に配置され、投影された画像は-97°×63°の視野を満たした。 視覚刺激は、平均灰色の背景（32cd/m2）上の光（56cd/m2）または暗いバー（8cd/m2）（それぞれ平均輝度の175％および25％）で構成されていた。 明バーと暗バーの間に定性的な違いは認められなかったので、二つの刺激を用いて得られたデータを組み合わせた。 各バーは幅10°で20°/sの速度で移動し、前のバーから30°分離され、一度に画面上に複数のバーが可能になりました。 棒の長軸は運動方向に直交していた。 運動の12方向のそれぞれは、画像化されたすべての動物の各スライスに固有の擬似ランダムな順序で一度（3秒）提示されました。 各エポック間の間隔は、gcamp5G信号がベースラインに戻ることを可能にするために10秒でした。 2秒の空白画面のnull条件もインターリーブされました。 視覚実験は、カスタム記述されたLabviewおよびMATLABコード（MathWorks）を使用して生成および制御され、ViSaGe stimulus presenter（Cambridge Research Systems）に実装され、DLP Pico Projector（Optoma）を介して配信されました。

二光子調製における移動格子

二光子調製における移動格子刺激は、Psychopy39を用いて生成され、制御され、カスタムメイドのPerspexチャンバの下に配置されたLCDスクリーン（SKD5VA-3、GoodWell Technology）を介して配信された。 ロングパス赤ガラスフィルター（FGL610、Thorlabs）は、同時イメージングと視覚刺激を可能にするために、LCD画面とチャンバの間に配置されました。 幼虫は画面から2cm離れた位置に配置され、LCD画面上の画像は〜140°×100°（平均背景輝度30.4cd/m2）の視野を満たした。 視覚刺激は方形波格子（100％コントラスト、空間周波数1.66サイクル/cm、時間周波数1サイクル/s）で構成されていた。 各格子棒は幅が8.5°であり、棒の長軸は動きの方向に直交していた。 Gcamp6F信号がベースラインに戻ることを可能にするために、12方向の動きのそれぞれが1回（6秒）およびエポック間間隔10秒で提示された。 6秒の空白画面のnull条件もインターリーブされました。 TTLトリガ(0-5-0ボルト)は、labjack USB DAQデバイス(U3-LV、LabJack Corporation)を介して生成されたエポックタイムイベントを記録します。 レーザースキャンの活性化に続いて、我々は、多光子レーザーによって引き起こされる背景光レベルに適応網膜を確保するために、視覚刺激を開始する前に60秒

Optomotor response assay

個々の5dpf幼虫は、Danieau溶液を含む35mmのペトリ皿に配置した。 デュエットディスプレイ（Kairos Technologies）を介してMacBook Pro（Apple）によって制御されるiPhone5（Apple）のLCD画面は、ペトリ皿の底部に4方向（90°角距離）に移動する白黒の方形波格子（85％ 視覚刺激はKeynote（Apple）で生成されました。 各幼虫は合計で5回試験され（各試験は6秒続いた後、10秒の静的格子が続いた）、それが応答した試験（すなわち、魚が移動格子の方向に回転して泳ぐ）に従っ 幼虫の行動は、M165FC立体顕微鏡（Leica）を使用して視覚的に監視した。

分析

機能分析

in vivoカルシウムイメージングデータを前述のように分析した22,33。 要約すると、機能時系列は、分析の前に次のように処理されました: 各実験からの時系列画像は、剛体アルゴリズム（SPM12;http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/）で動きを補正し、中央値を1ボクセルのカーネルサイズでフィルタリングして暗いノイズとショットノイズを除去し、2Dガウスカーネル=2ボクセルで空間的に平滑化して信号対ノイズを改善した。 低周波ドリフトを補正するベースライン（B）は、エポック間間隔データの5秒から平均ノット間の外挿立方スプラインアルゴリズムを使用して決定され 両方の相対的な信号強度の変化（Δ F=F-B）; ここで、Ｆ＝未加工蛍光）および正規化された信号強度の変化を各ボクセルで計算した。 集団機能データ（ボクセルワイズ分析）にはΔ Ｆを使用したが、手動で定義された関心領域（Ｒｏｉ）には％Δ Ｆ／Ｆ０を使用した。 各ボクセルまたはＲＯＩについて、エポック間隔にわたる積分応答を計算して、提示された刺激運動の各方向の単一の応答メトリックを提供した。 各エポックウィンドウ内の積分は、最大信号変化よりもカルシウムプローブの飽和効果に対してより耐性のある要約メトリックである。 取得画像シーケンス内の各ボクセルのしきい値は、エポック間間隔およびヌル条件、しきい値=5×SDs中のΔ F変化の分散から決定された。 少なくとも二つの視覚的提示エポック内の超しきい値であったすべてのボクセルは、視覚的に応答性とみなされ、さらなる特性化に供されました。

視覚的に応答性のボクセルの方向および配向選択性を分析するために、方向および配向選択指標（DSIおよびOSI）40は、適合したvon-Misesまたはガウスプロフ ＤＳＩは、（Ｒｐｒｅｆ−Ｒｎｕｌｌ）／（Ｒｐｒｅｆ＋Ｒｎｕｌｌ）として定義され、ここで、ｒｐｒｅｆは、好ましい方向への応答であり、好ましい方向エポック間隔にわたる積分応答であった。 Ｒｎｕｌｌは、好ましい方向と反対の方向によって誘発される積分応答として同様に計算された。 ＯＳＩは、（Ｒｐｒｅｆ−Ｒｏｒｔｈ）／（Ｒｐｒｅｆ＋Ｒｏｒｔｈ）として定義され、ここで、ｒｐｒｅｆは、好ましい配向に対する応答であり、好ましい配向エポック間隔にわたる積分応答であった。 Rｔｈは直交配向によって誘発される積分応答として同様に計算した。 DsiとOSIの指標に関連するクロストークとオーバーフィッティングを最小限に抑えるために、厳格なアプローチが行われました。 ボクセルを方向選択的（DS）または方向選択的（OS）とみなすためには、相互に排他的な基準が使用されました：DS if DSI>0.5およびOSI<0。5;およびOS IF OSI>0.5およびDSI<0.5。 どちらの場合も、DSIとOSIの適合度(r2)は、それぞれ>0.8でなければならなかったため、適合曲線は積分応答の少なくとも80%を説明しました。 単一のｖｏｎ-Ｍｉｓｅｓ分布を用いてＤ ｓボクセルの応答を適合させ，適合曲線の中心からの運動角の好ましい方向を推定した。 二つのvon-Mises（180°角度距離離れて）の合計は、OSボクセルの応答をフィットし、フィット曲線の中心から運動角のそれらの好ましい向きを推定するために使 円形分散も、配向選択性の代替メトリックとして比較のために計算した（円形分散<0.4）41。

形態学的解析

4dpf真珠層、キャスパーおよび結晶Tg（elavl3）で画像化された脳の体積を決定するために:Gcamp6f)幼虫、我々は調整>>>リストコマンドImagej42を適用することによ 続いて、得られた値に単一ボクセルの体積（0.415×0.415×0.631μ m3=1.086×10-1μ m3）を乗算した。

統計分析

統計的なテスト結果は、図と図の凡例で報告されています。 統計解析および試験は、Ｐｒｉｓｍ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ）またはＭＡＴＬＡＢ Ｒ２ ０ １ ４Ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して実施した。 統計的検定を実行する前に、適切な統計的検定を選択するために、記述統計量（例えば、値がガウス分布から来ているかどうかを確認する正規性検定、ま 統計的有意性の基準は、p<0.05に設定されました。