概要
背景。 癌細胞におけるヒトCD133（ヒトプロミニン-1）の発現は、幹性のマーカーであると仮定されており、癌幹細胞（CSCs）の推定マーカーとして考えられている。 我々は、正常な皮膚および上皮皮膚新生物におけるCD133の発現パターンを記述するための研究を設計した。 メソッド。 四十から三エクリンおよびアポクリン腫瘍のCD133免疫組織化学的発現は、皮膚の他の上皮腫瘍で観察されたものと比較した。 さらに、フローサイトメトリーは、一つのporocarcinomaを含む四つの上皮皮膚新生物のCD133発現を検出するために使用されました。 結果。 腺構造を形成する細胞の頂端または頂端外側表面におけるCD133免疫反応性が観察された。 良性または悪性腫瘍の固形領域からの細胞は染色されなかった。 扁平上皮癌培養は0.1％未満が含まれていながら、ポル癌由来の培養細胞は、フローサイトメトリーを使用してCD133陽性細胞の22％を示した。 結論。 これらの観察は、CD133は、可能なエクリンまたはアポクリン分化と皮膚腫瘍の診断パネルに含めることができる腺分化の特定のマーカーであることを示 しかし、CSCsのマーカーとしてCD133発現の使用は、皮膚の実験では注意して解釈されるべきである。
1. はじめに
ここ数年、腫瘍の形成と成長を維持する能力は、癌幹細胞（CSCs）と呼ばれる小さな細胞集団にのみ存在するという考えを支持する証拠が これらの腫瘍開始細胞の幹細胞様表現型を示すマーカーの探索は、研究の活発な分野であり、いくつかの幹細胞マーカーは、最近、皮膚腫瘍に記載されています。
CD133は、マウスプロミニン-1、様々な体細胞幹細胞亜集団に制限され、その発現のために注目を集めている五つの膜貫通ドメイン細胞表面糖蛋白質のヒト同族体である。 この表面抗原は、ヒト胎児肝臓および骨髄由来のCD34陽性造血幹細胞の亜集団によって発現されるマーカーであるMab AC133として定義されたモノクローナル抗体の標的として発見された。 その後、CD133は、腎臓、前立腺、脳、および膵臓を含む異なるヒト正常組織で検出され、微絨毛および他の原形質膜突起と特異的に関連することが判明した。 さらに、この抗原は、血液学的悪性腫瘍およびグリア腫瘍、前立腺癌、腎臓癌、肝癌、結腸直腸癌および悪性黒色腫を含むいくつかの固形ヒト新生物においても同定されている。 これらの研究の多くの目的は、自己再生、腫瘍開始、および腫瘍増殖維持の能力を有する癌細胞の小さなグループとして定義されるCscの存在を決定す Ac133陽性細胞の精製に日常的に使用される抗体は、不確実な特異性の不十分な特徴グリコシル化エピトープを標的とする。 CD133の機能活性はまだ議論の余地があり、その生理学的機能はまだ決定されていませんが、この細胞表面タンパク質は、原形質膜突起と膜マイクロドメ この細胞の位置では、CD133は膜脂質組成の調節因子として作用し得るか、または細胞極性および遊走のメカニズムに関与し得ることが示唆されている。
唾液腺、涙腺、膵管、子宮頸部腺、汗腺などのヒト腺上皮のCD133免疫組織化学染色を報告する以前の研究では、CD133発現の特異的なパターンが記載されてい これらの上皮において、ＣＤ１ ３ ３は、偏光された細胞の頂端領域における原形質膜突起に局在することが示されている。 管腔を取り囲む細胞の同様のCD133頂端細胞質染色パターンも、卵巣、結腸、または膵臓からの癌において観察されている。
CD133抗体染色汗腺細胞の発見は、皮膚エクリンおよびアポクリン腫瘍におけるCD133の発現を評価するために、我々は今報告する研究を設計するため
2. 材料および方法
2.1. 症例
レトロスペクティブ検索は、アルバセテ大学病院病理部のファイルから43以前に診断された皮膚エクリンおよびアポクリン付属器腫瘍を 全例からガラススライド，パラフィンブロック，病理組織学的報告が得られた。 Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). 基底細胞癌（）およびへん平上皮癌（）の症例も含めて，これらの新生物で得られた結果と汗腺腫ようで得られた結果を比較した。 正常な皮膚におけるCD133発現を評価するために、我々は皮膚の六つの外科的に切除された腫瘍のマージンから得られた異なる領域から皮膚を分析し、三
皮膚癌細胞の培養のために、一つのエクリン腺癌および六つの扁平上皮癌に対応するヒト皮膚腫瘍から七つのサンプルが得られた。 これらの症例からの新鮮な組織は、外科的切除直後にペニシリン/ストレプトマイシンとfungizoneを添加したDulbecco’s Modified Eagle’s medium（DMEM）に含まれていた。
2.2. 免疫組織化学
ホルマリン固定、パラフィン埋め込まれた組織切片4μ m幅を切断し、キシレンで脱脂し、エタノールの段階的なシリーズで再水和した。 内因性ペルオキシダーゼ活性は3％H2O2で5分間ブロックされた。 スライドは、熱誘導エピトープ検索で処理し、三つの異なる抗CD133モノクローナル抗体で免疫染色した: Ａ Ｃ１ ３ ３モノクローナル抗体、２ ９ ３Ｃ３モノクローナル抗体、およびＡ Ｃ１ ４ １モノクローナル抗体（全て、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手）。 抗体は、異なる希釈およびインキュベーションの時間で試験した。 ＣＤ１ ３ ３検出は、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒプラットフォームでＥｎｖｉｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、製造業者の指示に従って行った。 ジアミノベンジジン（ＤＡＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を色原体として使用した。 テストされた三つの異なる抗CD133抗体から、一つだけ、AC133モノクローナル抗体は、パラフィンで働いていました。 これらの抗体とインキュベートされた切片は染色を示さなかったか、または抗体の高濃度が使用されたときに観察された免疫染色が非特異的であ AC133モノクローナル抗体は、テストされたパラフィン埋め込まれたセクションに信頼性の高い結果を与えた。 私達はこの抗体のために好まれた労働条件として室温で孵化の1:10の希薄そして40分の確立します。 その後、すべての実験は、これらの条件で行われました。
正常な汗腺を有する皮膚の切片を陽性対照として使用した。 さらに、切片に存在する場合、新生物に隣接する皮膚からの正常な汗腺を内部陽性対照として使用した。 陰性対照は、一次抗体インキュベーション中に抗CD133抗体を省略することによって行われた。
腫瘍からの固形領域および腺房または乳管構造の免疫組織化学的染色を別々に評価した。
腫瘍からの固形領域および腺房または乳管構造の免疫組織化学的染色を別途評価した。 CD133染色は、半定量的スケールを使用して傾斜させた。 腺房または乳管構造を以下のように評価した：（−）染色なし; （＋）単離された管腔内の分泌物質の染色および／または少数の管腔内の頂端または管腔境界の弱い染色；（＋＋）腫瘍内に存在するほとんどの管腔内の頂端ま CD133の発現は、臨床的および病理学的情報の知識なしに盲目の方法で二人の上級病理学者（EPとSYNC）によって評価されました。 不一致の評価の場合には、スライドは、マルチヘッド顕微鏡下で両方の病理学者によって再評価され、合意が得られた。 2.3.
皮膚腫瘍からの癌細胞の培養
腫瘍断片を、コラゲナーゼIA型（2mg/mL）（Gibco、Invitrogen）を用いて、Hankの平衡塩溶液（HBSS）中で37℃で2時間消化することにより、機 細胞を40μ mのナイロンメッシュを通して濾過し、血清学的ピペットを通る連続通過によってさらに解離させた。 消化された組織を１ ０ ０ ０×ｇで１ ０分間遠心分離し、ペレットを数回洗浄して、単一細胞懸濁液を得た。 単離された細胞を培養フラスコに播種し、37℃で10％ウシ胎児血清を含むDMEM/F12培地で増殖させ、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびfungizoneを補充した。2.4.
フローサイトメトリー分析
すべての実験は、腫瘍からの初代培養の最初の通過時に調製された細胞懸濁液に対して行われた。 細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.02％EDTAを用いて37℃で15分間分離し、染色前にPBSで洗浄した。 細胞懸濁液を細胞／ｍＬに調整し、推奨抗体希釈液（１／１ ０）と共に暗所で２ ０分間インキュベートした（４℃）。 一次抗体を含まない試料を陰性対照として使用した。 使用した抗体は、抗ＣＤ１ ３ ３／１（ＡＣ１ ３ ３）−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）であった。 結合していない抗体をＰＢＳで洗浄することによって除去し、細胞を適切な容量の緩衝液中に再懸濁した。 分析は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。 データはSummit V5.0.1を使用して分析した。 5170ソフトウェア（ダコ）。
3. 結果
3.1. 臨床所見
患者コホートは29人の男性と23人の女性で構成され、年齢は24歳から90歳（中央値、49歳）であった。 提示部位は可変であり，そのほとんどは頭頸部領域に局在していた。 臨床データを表１に要約する。 全例切除皮膚生検を施行した。
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| CD133 staining was graded using a semiquantitative scale. Acinar or ductal structures were evaluated as follows: （−）染色なし；（＋）単離された管腔または腺房の内腔における分泌物質の染色および／または少数の管腔または腺房の頂端または管腔境界の弱い染色；（＋＋）腫瘍に存在する大部分の管腔または腺房の頂端または管腔境界の明確な染色；（＋＋＋）腫瘍に存在するすべての管腔または腺房の頂端または管腔境界の染色。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. 免疫組織化学的所見
ホルマリン固定、パラフィン包埋組織切片上でテストされた三つの異なるモノクローナル抗体から、以前の報告に従って、AC133 この抗体で観察された全体的な免疫組織化学的染色パターンは組織アーキテクチャと密接に関連していた。 染色は主に管または腺構造を形成する細胞の頂端表面に局在していた。 抗CD133抗体を用いてこれらの構造で観察された免疫組織化学的所見を表1にまとめ、以下に記載する。 調べた付属器腫瘍のいずれかから、またはテストされた基底細胞および扁平上皮癌からの固体領域は、CD133陽性を実証することができませんでした。 3.2.1. 正常組織
CD133発現は、正常なエクリン腺の腺房および末端管の細胞の管腔内または頂端表面で観察された（図1（a））。 正常汗腺の分泌部に位置するエクリン細胞の側膜に形成された細胞間管腔は、明らかに染色された（図1（b））だけでなく、エクリン管の内腔に見られる分泌 末端管における正常アポクリン腺の染色は細胞の頂端境界で観察されたが，斑状の分布を有していた。 アポクリン断頭分泌が明らかであったこれらの腺の腺房領域では、CD133は弱いまたは陰性の染色のみを示した。div>
(a)
(b)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(b)
正常なエクリン腺におけるcd133は、細胞の内腔表面および汗腺分泌（a）を染色する。 エクリン細胞の側膜における細胞間管腔も観察される（b）。
3.2.2. 腫瘍
CD133は、テストされた扁平上皮または基底細胞癌のいずれにも発現しなかった。 AC133抗体を使用して、この作業で分析された付属器腫瘍は、以下の染色パターンを示した（表1に要約）。
エクリンまたはアポクリン分化を伴う良性腫瘍。 すべてのエクリンスパイラデノーマ症例は、腫瘍結節内に存在するダクト様構造の頂端膜でCD133免疫反応性を提示した。 解析した全ｅｃｃｒｉｎｅｉｄｒｏｃｙｓｔｏｍａ症例の単房嚢胞を形成する上皮細胞の管腔表面も陽性であった。 Ｅｃｃｒｉｎｅｐｒｏｏｍａ症例のうち三つに存在する管と小嚢胞は増殖した細管からの内部細胞層の強い染色を示し，この染色は細胞の管内境界に位置していた。 分析された他の三つのポロマ例は、ほとんどの尿細管で同じ染色パターンを示したが、CD133陽性の（++）または（+）染色パターンを示した。 管様構造は上皮細胞の頂端膜でも免疫反応性を示した。 四つの軟骨性シリンジ腫の染色が顕著であり、時折分岐構造を形成する存在するすべての管は、頂端膜で強い陽性を示した（図2）。 乳頭状腺腫症例の嚢胞腔に至る拡張および曲がりくねった管は、上皮細胞の頂端部または嚢胞の管腔表面で免疫反応性を示し、（++）から（+++）の範囲の強度を示した（図3）。 結節性hidradenomaと診断された五つのケースは、（++）から（+++）の強度の範囲であった尿細管（図4）を形成した細胞の頂端染色でCD133陽性であった単離された管様構造を示した。 二つのhidradenoma papilliferumケースはまた、腺構造の頂端部にCD133の発現を示した。 腫ようを形成する小管の管腔表面には一貫した染色が認められ，通常は二層の立方体上皮細胞によって裏打ちされていた。 アポクリン-ヒドロシストーマ症例は陽性の免疫反応性を示さなかった。
軟骨シリンジ腫分岐尿細管の内面におけるCD133陽性。 間質細胞または外側上皮細胞の染色は認められない。
偽層状柱状上皮によって裏打ちされた乳頭状嚢胞腺腫の乳頭突起はCD133陽性である。 陽性は管腔内表面で非常に強い。
ヒドラデノーマ症例の細管を覆う柱状細胞の線形CD133染色。 尿細管の内面に位置する細胞のみが染色される。
エクリンまたはアポクリン分化を伴う悪性腫瘍。 アポクリン癌と診断された症例の嚢胞の管腔表面には免疫反応性は認められなかった。 本研究で分析された二つの微小嚢胞性付属器癌は、管状構造の小さなおよび大きな管腔を形成した細胞の頂端表面に強いCD133陽性を示した。 Cd133免疫染色は、porocarcinomaケースの管状構造を取り囲んでいる非常に非定型細胞で実証することができました（図5）。
(a)
(b)
(a)
(b)
Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).
3.3. ヒト皮膚腫瘍由来の初代培養物の特性評価およびフローサイトメトリー分析
ヒト皮膚腫瘍由来の七つのサンプルは、単一細胞懸濁液を得ることを 腫瘍から得られた細胞の数が不十分であるか、または真菌または細菌汚染のために、四つのサンプルのみが正常に培養され、細胞表面CD133/1エピトープ これらの正常に培養された生検には、一つのエクリン腺癌および三つの扁平上皮癌が含まれる。 培養細胞の顕微鏡検査では，組織学的腫よう型に一貫して変化する異なる形態を明らかにした。 へん平上皮癌由来の細胞は類上皮または紡錘細胞の外観を示したが、エクリン腺癌由来の細胞はより丸みを帯びた形状を有し、小細胞および非定型細胞の島に一緒にグループ化されていた。 これらの培養物中の上皮細胞の存在は、上皮マーカーとしてのE-カドヘリンおよびEpCam陽性発現によって確認された。
皮膚腫瘍細胞培養物がCD133陽性細胞の集団を含んでいるかどうかを決定するために、我々はAC133抗体とCD133/1表面マーカーの発現を調べるためにフロー 扁平上皮癌からのすべてのサンプルは陽性細胞の0.1％未満を含んでいたが、陽性細胞のほぼ22％がエクリン腺癌で検出された。 図6は、評価された二つの皮膚腫瘍タイプからの代表的なヒストグラムを示しています。
(a)
(b)
(a)
(b)
CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. 扁平上皮癌は、フローサイトメトリー上のCD133と0％陽性CD133細胞の陰性染色を示しています。
4. ディスカッション
皮膚幹細胞生物学における進歩、および発癌の理解では、独特の幹細胞集団に特異的なマーカーの可用性に大きく依存します。 皮膚幹細胞または他の臓器または腫瘍で同定された幹細胞の既知のマーカーを、皮膚Cscの検出に使用することができる。 皮膚で試験することができるこれらのマーカーの1つは、CD133タンパク質（プロミニン-1）である。 新規幹細胞糖タンパク質抗原に対して産生されたモノクローナル抗体AC133を用いたCD133発現を報告する最初のデータは、CD133が選択的にCD34造血幹細胞 それ以来、いくつかの報告は、プロミニン-1は、造血系、前立腺、膵臓、または腎臓を含む様々な供給源からヒト幹細胞を同定し、単離するために使用すること さらに、CD133に対するモノクローナル抗体は、ヒト癌腫の数と悪性黒色腫における腫瘍開始細胞またはCSCsの推定集団の同定および単離のために使用さ 神経膠腫では、CD133陽性癌細胞の増加数だけでなく、これらの細胞のクラスターの存在は、腫瘍グレードのような他の要因とは無関係に、重要な予後因子とし しかし、異なる新規な抗CD133クローンを用いた他の研究では、CD133の発現は幹細胞および前駆細胞に限定されず、マウスおよびヒト組織の成体上皮細胞 例えば、マウスプロミニン−１に由来する１ ３Ａ４と呼ばれるＣＤ１ ３ ３クローンを使用して、Ｗｅｉｇｍａｎｎ ｅ ｔ ａ ｌ． 神経上皮細胞および成体腎臓近位尿細管の頂端表面におけるプロミニン-1の発現を実証し、Karbanová et al. ヒトプロミニン-1ポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体（80B258）を用いて、成人ヒト組織、特に腺上皮において免疫反応性を観察した。 これらの結果は、以前にCD34陽性前駆細胞に制限されるフローサイトメトリーで発見されたAC133抗原が成人上皮細胞で発現されるかどうかを明らかにするためのさらなる研究の必要性を示している。 観察される可変CD133発現は、CD133の様々なグリコシル化形態に対する多様な抗体の差動親和性に関連していることが示唆されている。 モノクローナル抗体AC133はプロミニン-1のグリコシル化エピトープを認識し、興味深いことに、このタンパク質のグリコシル化は、細胞分化の状態に応じて変 ヒト皮膚腫瘍に関する我々の研究では、CD133発現が汗腺管および汗腺分泌の形成に大きく依存していることが観察されている。 CD133免疫反応性は、主にほとんどの良性および悪性エクリン腫瘍の管様構造または嚢胞の頂端/管腔内表面で見られた。 研究された腫瘍のどれも、良性でも悪性でもなく、固体領域におけるCD133陽性腫瘍細胞の単離されたまたは小さなクラスターを提示した。 分泌細胞の頂端細胞膜の同様のCD133染色パターンは、腎臓近位尿細管または大腸癌の腫瘍腺のような正常な管状構造において以前に報告されている。 CD133染色はまた、卵巣癌の内腔を形成する細胞の頂端/管腔内表面で発見された。 これらの場合、CD133の頂端位置は、この分子の可能性のある分泌機能に関与している。 CD133染色の形態学的分布は、分泌とCD133の機能的関係を示唆し、正常組織および腺のよく認識された分泌構造との相関を示しています。 実際、我々の研究では、syringomasのような汗腺の管領域に由来すると疑われる腫瘍は、腺房部分に由来するものよりも染色の強いパターンを示した。
分化した腫瘍細胞の細胞表面上のCD133発現は、皮膚における特定の癌幹細胞マーカーとしてのCD133に対する議論である。 しかし、小さなCD133+CSC集団の存在は、CD133がCscおよび分化した腫瘍細胞の両方の細胞表面に発現される他の器官で実証されているように、完全に排除す
一緒に取られて、我々の調査結果は、エクリン腺の分化した正常および腫瘍性細胞の分泌表面におけるAC133抗体の特異的免疫組織化学的発現を示 この抗体を皮膚のCSCsのマーカーとして使用する実験は注意して解釈されるべきである。 AC133抗体は可能なeccrineまたはapocrineの微分の腫瘍の診断のために有用な皮膚の腺状の微分の敏感で、特定のマーカーです。
謝辞
著者は、Pedro Javier Benito Castellanosとlaura Abendañoに技術サポートに感謝しています。
