要約

既存の走化性アッセイは、安定した走化性勾配を生成せず、したがって、時間の経過とともに機能的に非特異的なランダム運動（ケモキネシス）のみを測定する。 対照的に、マイクロ流体技術は、長期間安定に維持することができ、したがって、走化性をアッセイするための適応に従順である、緊密に制御された微環境を生成する能力を有している。 ここでは、細胞の移動の高感度なアッセイのための新しいマイクロ流体デバイスを記述し、ケモカイン勾配で平滑筋細胞の走化性を評価するための

1. はじめに

指向性細胞遊走は、炎症性疾患、血管疾患、創傷治癒、および腫瘍転移において重要な役割を果たす。 単層創傷の閉鎖（「スクラッチアッセイ」）およびＢｏｙｄｅｎチャンバーを含む、細胞遊走を定量化するための多数のｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチが開発されている。 しかし、これらの現在の方法は比較的鈍感です。 さらに、そのようなアプローチは、実際には、走化性指向の細胞遊走ではなく、化学運動、すなわち増加したランダム運動のみを測定することができる。

確かに、スクラッチアッセイとBoydenチャンバtranswellsの有用性は、その方法論的設計によって制限されています。

スクラッチアッセイのために、定義された”創傷”（スクラッチ）は、合流細胞単層で行われ、欠陥の端にある細胞は、その後、徐々に空隙を埋める、と復元されたコンフルエンスまでの時間が定量化されます。 スクラッチのより速い修復は、細胞操作または培地に添加される可溶性薬剤の性質に起因する増強された「走化性」を反映すると解釈されている。 実験は概念的に簡単で技術的に簡単ですが、細胞は均一な濃度の薬剤に浸され、実験全体の間に化学誘引物質の濃度勾配はありません。”したがって、スクラッチアッセイにおける”遊走”は、主に増加した化学運動のみの関数である。 さらに、典型的に実施されるように、（特に長期間のアッセイの数時間にわたって）、傷の「創傷」の閉鎖もまた、細胞増殖の実質的な成分を含む可能性が高い。

“走化性”を測定するための他の最も一般的な方法は、Boyden chamber transwellsの使用を含む。 特定のケモカインの異なった集中は装置のより低いコンパートメントに評価されるべき細胞は上部の挿入物で孵化するが、置かれます;微多孔性の膜は2つの部屋を分け、細胞の成長のためのサポートおよび移動のための部分的な障壁を形作ります。 膜の下面で計数されるか、または下部チャンバ内に蓄積する細胞は、典型的には、単一の固定された終点で評価される。 このアッセイは、明らかな指向性移動、すなわち上部から下部チャンバへの利点を有するが、依然として問題である。 第一に、ケモカインの上から下への「勾配」はなく、むしろ低濃度から高濃度への単一のステップ機能のみが存在する。 第二に、上から下のチャンバへのケモカイン差を維持する方法はありません。 最初は、下部区画内のケモカイン濃度はより大きいが、数分から数時間以内に、拡散のために濃度が均一になり、その時点で特定の走化性が停止する。 代わりに、長期的な測定は、化学運動の重要な要素を反映している可能性が高くなります。 さらに、細胞が膜を通って下部チャンバに落ちると、逆移動の機会はありません。 最後に、Boydenの部屋はまた細胞のカウントが実験の終了を要求するので限られている;従って時間のコースは多数装置を要求する。

マイクロ流体技術は、時間の経過とともに継続的に監視することができる可溶性因子の長期的な安定した制御可能な勾配を生成することによ 増殖をブロックするように処理された細胞を用いて、このような装置は、走化性対化学運動の真の進行中の評価を可能にする。 図1は、接続されたヒドロゲルチャネルを通る拡散フラックスに対して体積が大きい対応する井戸を作成することによって、ソースとシンクの濃度が維持されるようなデバイスを示しています。 定常状態では，これら二つのウェルの間に線形濃度勾配が形成される。 ハイドロゲル領域を通る間質流は、二つの井戸の静水圧が等しくない場合に勾配を破壊する可能性があるが、流体の流れと圧力平衡のための低抵抗経路として機能する追加のチャネルとリザーバとソースとシンク井戸を接続することによって圧力勾配が排除される。 したがって、勾配は数日間維持され、様々な細胞型を用いて感受性で特異的な方法で細胞遊走を研究するために使用され得る。 ここで提示された作業は、平滑筋細胞の一次培養の走化性を評価し、感度のためのスクラッチとボイデンチャンバー技術と比較するために、このようなデ

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Device design and stability of concentration gradients as a function of time. （ａ）下の３つの井戸はケモカインのための細胞および／または供給源の井戸であり、上の３つの井戸は下の井戸で同等の圧力を維持するための貯蔵所 実験設計に応じて、サイドウェルまたは中央ウェルはソースウェルとして機能することができ、中央ウェル内の細胞は、いずれかの側で異なるケモカイン刺激に向かって移動することができ、またはサイドウェル内の異なる細胞集団は、中央ケモカイン刺激に向かって移動することができる。 （ｂ、ｃ）濃度勾配は、低分子量蛍光色素指示薬を供給源ウェルおよび供給源リザーバに添加した後、２時間（ｂ）または７ ２時間（ｃ）のいずれかで概略的に示される。 (d)源の井戸および貯蔵所への蛍光染料の付加の後の0時間からの72hまでの集中の勾配のグラフ表示。

2. 材料および方法

2.1. 一次平滑筋細胞（ＳＭＣ）培養＜／ｈ５＞＜ｐ＞Ａｏｒｔａを、８週齢のＣ５ ７／Ｂ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍ Ａ）から滅菌解剖はさみで採取した。 付着脂肪を除去し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２％ウシ胎児血清、および５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で３ ７℃で２ ０ １ ２ ５ｍｇ／ｍｌのｅｌａｓｔａｓｅ ＴＹＰＥ ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ中で３ ７℃で３ ０分間インキュベートした。 を含むＤＭＥＭ；２％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのすべての試薬）に懸濁し、１ｍｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆されたプレート上の５％ＣＯ２インキュベーター中で３ ７℃で３ ０分間増殖させた。 細胞培養が確立されると（典型的には、最初の継代の後）、ＳＭＣは、コーティングされていないプラスチックフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上で増殖される。

SMCは、通路2から7まで使用され、99であった。平滑筋α-アクチンの染色後のフローサイトメトリーによって評価した5％純粋。 染色のために、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定する。 ＦＩＴＣ結合抗平滑筋α−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１ ０Ｘ Ｂ Ｄ ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で１：１ ０ ０希釈し、室温で１ ０分間適用した。 細胞を、ＰＢＳ中の１％ウシ胎児血清で２回、および１％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中の１％ウシ胎児血清で１回洗浄し、直ちにフローサイトメトリー（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ，Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃ Ａ）に ＦＩＴＣ結合マウスＩｇｇ１アイソタイプ（Ｂ Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をアイソタイプ対照として使用する。 走化性アッセイのための細胞は、合流を達成したときに回収された。

2.2. マイトマイシン-C処理

細胞をトリプシン化(0.25%トリプシン-EDTA;Invitrogen)2分間37℃で、SMC培地で洗浄し、40μ g/mLマイトマイシン-C(MMC)中の単一細胞懸濁液とし; ＰＢＳ中での２回のさらなる洗浄の後、細胞を、生存率、増殖、または遊走能力について評価した。 創傷治癒（スクラッチ）アッセイのために、MMC処理は、SMCメッキ後に行われ、細胞が100％コンフルエントであったとき;細胞は40μ g/mL MMC中でSMC培地中で30分間37℃でインキュベートした後、アッセイの前にPBSで二回洗浄した。2.3.

SMC増殖阻害アッセイ

MMC処理またはSMC培地中のコントロールインキュベーションの後、SMCは6ウェルプレート（Corning Incorporated）で培養した。 細胞は、トリプシン化によって1時間、24時間、または48時間後に回収され、細胞数および生存率は、血球計およびトリパンブルー排除を使用してカウント2.4.

創傷治癒／スクラッチアッセイ＜／ｈ５＞＜ｐ＞ＳＭＣを、合流するまで１ ２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）中で培養し、次いでＭＭＣで処理した。 洗浄後、新鮮なＳＭＣ培地を添加し、滅菌した２ ０ ０μ ｌのピペットチップを使用して、細胞単層を再現可能な方法で傷付けた。 血小板由来成長因子（PDGF）の異なる濃度; ＳＭＣ媒体中のｒＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を各ウェルに追加した。 傷欠陥の縁部間の距離を測定し、３、６、および９時間の５つの別個の点から、または傷欠陥が閉鎖するまで平均した。2.5.

Ｂｏｙｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ａｓｓａｙ＜／ｈ５＞＜ｐ＞１.０〜１.５×１ ０ ５細胞／ｍＬ（１.０〜１.５×１ ０ ４総細胞）のＳＭＣ懸濁液１ ０ ０μ ｌを上部のｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に装填し、異なる濃度のＰＤＧＦを含有するＳＭＣ培地６ ０ ０μ ｌを下部 ６時間、１ ２時間、または２ ４時間のインキュベーションの後、ｍｅｔａｍｏｒｐｈ Ｎ Ｘ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ Ａ）を使用して、ｈｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスウェル膜を染色し、下面上の移行細胞を蛍光顕微鏡で 下部チャンバ内の培地では細胞は同定されなかった。 細胞遊走が走化性またはランダムな化学運動を表すかどうかを評価するための実験では、血小板由来成長因子-BB（PDGF）は、下部チャンバー、トップインサートウェルオンリー、または上部インサートと下部チャンバーの両方に追加されました。2.6.

2.6. マイクロ流体デバイスアッセイ

マイクロ流体デバイス(図1(a)-1(c))は、他の場所に記載されているように調製される。 図1(d)に示すように、添加された試薬の勾配は少なくとも72時間安定である。 実験プロトコルに応じて、評価される細胞は中央ウェルに配置され、二つの側ウェルから異なる走化性勾配が発達する。 あるいは、２つの異なる細胞集団の遊走は、中央ウェルに配置された試薬によって生成される同一の濃度勾配を経験して、側ウェルから評価するこ 細胞濃度は常に4〜5×105/mLであり、40μ lの細胞懸濁液（1.6〜2.0×103細胞）を試験ウェルに装填した。細胞を種々の時点でデバイス中でインキュベートし、次いでＨ Ｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。＜／ｐ＞＜ｐ＞細胞を種々の時点でデバイス中でインキュベートした。 各細胞の位置は、蛍光顕微鏡を用いて決定した（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓ Ｔ Ｅ２ ０ ０ ０−Ｕ；Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ． Ｍａｔｌａｂプログラム（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍ Ａ）を使用して、移行された距離を評価した。 「総移動」は、最初の開始位置を超えてすべてのセルによって移動された距離の合計として定義され、この移動指数は統計分析に使用されます（図2）。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)iv (f)

(f)(g)(h)
(h)

div>図2

マイクロ流体デバイスにおける細胞遊走の評価。 細胞を、ｓｍｃ培地中の５ ０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦを、左下ウェル中に配置し、ＳＭＣ培地単独を右下ウェル中に配置し、続いて、３ ７℃で４ ８時間インキュベーションした。 (a,b)左チャネルの50ng/mL PDGFの方向の中央チャネルからの細胞走化性の位相コントラスト画像;チャネルの全長が細胞分解能を可能にするのに十分な （ｃ、ｄ）ＳＭＣ培地のみの方向の中央チャネルからの細胞化学運動の位相コントラスト画像。 （ｅ、ｆ）左（ｅ）または右の低出力蛍光画像；（ｆ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２で染色した後４ ８時間でのチャネル。 （ｇ）パネル内の左チャンネルの高出力蛍光画像（ｅ）；画像の右側付近の細胞のない黒い四角（アスタリスク）は、遊走の開始点を示す構造ポストである。 (h)マイグレーション分析の例。 開始点から各細胞核の中心までの距離が測定され、これらすべての個々の測定値の合計がMatlabを使用して総移動距離になります。

コラーゲンタイプI（Invitrogen）は、中央ウェルとサイドウェル間のチャネルを埋めるために使用され、細胞が移行する基質です。 1mg/mLおよび2mg/mLのコラーゲンは両方使用することができます。 1mg/mLのコラーゲンはやや高い非特異的背景細胞の化学運動をもたらし、ゲルローディングは2mg/mLのコラーゲンよりも技術的に困難であるが、より低いコ 特に明記しない限り、遊走チャネル中のコラーゲンの濃度は、すべての実験で1mg/mLであった。2.7.

2.7. 統計的分析

統計的比較は、Studentの検定または一方向分散分析を使用して行われました。 有意性はレベルで定義された。

3. 結果と考察

図3(a)に示すように、細胞増殖はMMC処理によってブロックされる。 ＭＭＣ処理ＳＭＣ（％）と未処理ＳＭＣ（％）との間に、処理後４ ８時間までの細胞生存率に有意差はない。 したがって、様々な遊走アッセイにおける細胞の蓄積は、細胞増殖の任意のコンポーネントなしで真の細胞の動きを表します。 MMC処理なしでは、長期インキュベーションからの移行指標は、一致する細胞増殖によって混同される可能性があるため、これは重要です。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)

(c)
(d)

一次SMC培養を用いたスクラッチアッセイ（図3（b））では、細胞は無作為に遊走（ケモキネシス）し、走化性薬剤の非存在下を含め、PDGF濃度に関係なく同等の速度で欠損を埋める。 MMCの処置なしで、傷の欠陥は細胞増殖の要素を提案するわずかに先に閉まりがちです。

図3(c)は、Boyden chamber transwellアッセイを使用したSMCのマイグレーション結果を示しています。 初期（１ ２時間）の時点では、１ ０〜５ ０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦに応答して小さいが有意に増加した遊走を示し、ケモカインは底井戸中に存在しない。 しかし、アッセイは、少なくとも一次SMC培養のために、比較的鈍感であることを示唆し、PDGFの10倍の濃度範囲にわたって移行に区別可能な差はなかった。 さらに、24時間までに、サイトカイン濃度が上部と下部ウェルの間で平衡化し始めた後、この時点での移行が非特異的であることを示唆するケモカインの濃度（培地コントロールを含む）のいずれかの間に差はない。

上部ウェル内の膜を横切る移動が必ずしも指示された走化性によるものではないことを正式に実証するために、PDGFを下部コンパートメント内のPDGFの有無にかかわらず、上部ウェルに添加した。 ケモカイン勾配が存在しない場合でも、上部チャンバ内のPDGFは著しく増加した移動をもたらした（図3（d））;これは増加した化学運動に起因することがで

transwell実験は、したがって、最初のPDGF濃度の違いは、低ウェルでより高い濃度に向かって増加した細胞移動のある程度を誘導することができるが、その後のPDGF拡散は、ランダムなケモキネシスにつながることを示唆している。

比較すると、マイクロ流体デバイスを用いた用量応答実験（図4）は、2という低い濃度で有意な走化性を示しています。５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ（図４（ｂ））を示し、約２ ５〜５ ０ｎｇ／ｍｌのピークを伴う走化性の用量依存的な増加を示す（図４（ａ））。 興味深いことに、高濃度のＰＤＧＦ（例えば、１ ０ ０ｎｇ／ｍｌ）は、高用量の走化性停止（１ ８）と一致して、より少ない遊走をもたらす。 注目すべきことに、事前のＭＭＣ処理なしでは、遊走指数はより大きく（図４（ａ））、より長いアッセイ時間で生じる「見かけの」走化性に対する増殖の非否定的寄与 The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or “gold standard” Boyden chamber approaches.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 4

Microfluidic device assay. （ａ）事前ＭＭＣ処置の有無にかかわらず用量−応答曲線。 ＭＭＣ処理および非処理ＳＭＣを、中央供給源ウェル中に存在する異なる濃度のＰＤＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ、１ ０ｎｇ／ｍｌ、２ ５ｎｇ／ｍｌ、５ ０ｎｇ／ｍｌ、および１ ０ ０ｎｇ／ｍｌ）と共に、側細胞ウェル中に配置した。 全遊走を計算するためにＭａｔｌａｂプログラムを使用して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２染色後および４ ８時間後の蛍光顕微鏡観察後に遊走を測定した。 対照（ＳＭＣ培地のみ）およびＰＤＧＦのすべての濃度を、３つのデバイスで評価した。 対照（）と比較して、５ｎｇ／ｍｌから１ ０ ０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦに有意差が見られる。 (b)マイクロ流体デバイスにおける化学運動対走化性。 2.5ng/mL PDGFの有無にかかわらずMMC処理されたSMCを中央細胞ウェルにめっきし、2.5ng/mLまたは50ng/mL PDGFを側源ウェルに添加した。 中心細胞ウェルにＰＤＧＦが存在しない場合、アッセイは、供給源ウェル（「０〜５ ０」）中で５ ０ｎｇ／ｍｌで４ ８時間後に、供給源ウェル（「０〜２.５」）中で２.５ｎｇ／ｍｌに対して有意に大きな総 2.5ng/mLのPDGFの存在は、濃度勾配がある場合に有意に大きな総遊走をもたらす（「2.5–50」）。; ）局所ケモキネシス効果に起因する。 勾配が存在しない場合（「2.5〜2.5」）、化学運動関連の移動が存在し、これは勾配が存在する場合に見られる移動（「0〜2.5」；）よりも有意に小さい。 （ｃ）パネル（ｂ）として実施した時間経過実験。

マイクロ流体デバイスは、走化性を測定するために使用することができるだけでなく、それは特に移動への化学運動と走化性の寄与を区別することができます(図4(b))。 したがって、ケモカイン勾配の非存在下で（例えば、2.５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ）、遊走指数は化学運動を反映する。 対照的に、中央ウェルにPDGFがなく、側方ウェルに2.5ng/mLでは、遊走指数は指示された走化性を反映する。 マイクロ流体デバイスはまた、中央ウェルが2.5ng/mL PDGFを含み、側部ウェルが50ng/mLを含む場合のように、既存の化学運動の存在下で走化性を評価する 刺激が単純な化学運動ではなく走化性勾配である場合、小さいが統計的に大きな移動がある。

ケモカイン勾配は2時間以内に確立され（17）、数日間安定であるため、細胞は時間の経過とともに濃度勾配を連続的に移動することができる（図4（c））。 対照的に、他の古典的な方法は、濃度勾配（スクラッチアッセイ）を有さないか、または一過性のケモカイン勾配のみを有するので、化学運動は、指示された走化性ではなく、ますます寄与している。

この研究で報告されたマイクロ流体デバイスは、以前に走化性を研究するために使用された他のin vitroアプローチと比較して、多くの点で優れています。

特に、多孔質膜を横切るケモカイン勾配を含むボイドンチャンバーは、1950年代から標準的な走化性アッセイであったが、この装置は勾配が安定でも線形でもなく、初期の急激な濃度ステップアップが時間の経過とともに徐々に悪化するという大きな制限を有する。 最近では、マイクロ流体バイオチップを利用してin vivo条件を模倣するマイクロ電気機械システム（MEMS）技術が開発されました。 しかし、これらのデバイスの連続的な流れは、安定したケモカイン勾配の維持に課題を提示します。 ソースとシンクチャネル間のハイドロゲルは線形濃度勾配を作成することができますが、ウェルとチャネルの微妙な変化は、間質流を介して勾配を乱す圧力勾配を発生させることができます。さらに、デバイスの連続的な流れは、細胞源によって分泌される化学誘引剤を希釈する傾向があります。 前に記載されており、本稿では平滑筋細胞の移動のために検証された新しいマイクロ流体デバイスでは、大容量のソースとシンク井戸は、接続ハイドロゲル 濃度勾配は、したがって、数日間安定し、線形である。 今回の研究では、マイトマイシン-C処理を導入して増殖の交絡寄与を低減し、走化性と化学運動を同じ実験設定でどのように評価できるかを実証して、アプリケーションをさらに洗練しました。

利益相反

著者は利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

この研究は、BWH-BRI Fund to Sustain Research Excellence-Bridge Research Grantからの助成金によって支援されました。 陳張は18ヶ月間、中国奨学金評議会によって支援されました。 Ovid C.AmatiとRichard T. リーはNSF科学技術センター CBET-0939511によって部分的にサポートされました。