結果
胚および成体膵臓におけるALDH1発現。
神経、造血、および乳腺上皮前駆細胞（17-19）におけるALDH1酵素活性の高レベルを文書化する以前の研究に基づいて、我々は胚および成体マウス膵臓におけるALDH1 1). 膵臓上皮細胞のマーカーとしてE-カドヘリンを用いて、我々はALDH1タンパク質がE12.5上の発達中の膵臓上皮内で最初に検出可能であることを見出した（Fig. 1A）。 この時点で、発現は分岐細管の先端に制限され、最近、多能性前駆ドメイン（20）を表すことが提案されている。 発現の同様のパターンは、以前にAldh1A1転写物（のために報告されている21）。 管状の先端（および中央の幹ではない）における発現は、E14.5を介して持続する（図5）。 ＢおよびＢ’）であり、続いて腺房細胞の分化において下方制御されている。 成体の膵臓では、上皮ALDH1発現が中心房上皮および末端乳管上皮細胞において最も頻繁に観察される（図10B）。 1C-E）。 間葉系（Ｅ−カドヘリン陰性）のＡＬＤＨ１発現細胞もまた、周囲の内分泌小島および外分泌腺房を検出した（図１）。 S1）。
胚および成体マウス膵臓におけるALDH1発現。 (A–C)E12.5(A)、E14.5(BおよびB’)、および成体マウス膵臓(C)の上皮構造をマークするためのE-カドヘリン(赤)と組み合わせたALDH1タンパク質(緑)の免疫蛍光標識。 (B’)内の画像は、(B)内のボックスで示される領域の高倍率ビューを表します。 上皮枝の先端（B’のアスタリスクによって示される）およびより多くの中心枝幹（星によって示される）ではないALDH1発現の制限に注意してください。 成人膵臓（C）では、ALDH1の発現は、E-カドヘリン陽性中枢房細胞のサブセットに制限されています。 (DおよびE)centroacinar(矢)および末端管細胞(矢頭)のサブセットにおけるALDH1タンパク質(茶色)の免疫組織化学的検出。 （スケールバー：50μ m。）
さらにALDH1発現と大人の末端管/中枢房細胞におけるALDH1酵素活性を特徴付けるために、我々は新たにコラゲナーゼ消化マウス外分泌膵臓（22）から単離された 重要なことに、これらの単離された末梢腺房-管ユニットは著しく大きなダクトと内分泌要素の枯渇しています。 全膵臓と比較して、末梢腺房-管ユニットは、RT-PCRによって評価した場合、インスリン転写物における>400倍の枯渇を示 S2A）。 FACS分析は、トランスジェニックIns1から収穫された末梢腺房-管単位で行われたとき：DsRedマウスβ細胞で赤色蛍光タンパク質を発現し、この調製物から3 10,000細胞（0.03％）のみがDsRedに陽性であった。
ALDH1タンパク質発現の追加の三次元特性評価は、単離された末梢腺房管ユニットの全マウント蛍光標識を用いて達成された。 ALDH1タンパク質は、上皮細胞のマーカーとしてE-カドヘリンと組み合わせてローカライズされ、FITC共役Dolichos biflorus凝集素（DBA）またはFITC共役ピーナッツ凝集素（PNA）、それぞれ管 マルチチャネルイメージングは、成体膵臓におけるALDH1発現上皮細胞の主に中心房/末端管の位置を確認した（図。 S3）。 ALDH1発現細胞は、ほとんどの場合、末端管上皮とより末梢腺房細胞の間に介在していた。 さらに、単一の上皮ALDH1発現細胞もまた、末端乳管上皮にすぐ隣接して観察された（図10B）。 Ｓ３ａおよびＢ）。 ALDH1陽性PNA陽性細胞はめったに同定されなかったのに対し、DBA陽性およびDBA陰性ALDH1陽性細胞の両方が同定された。
ALDH1を発現する中心房細胞および末端乳管細胞の単離。
成体マウス膵臓からALDH1発現細胞を単離することを期待して、我々は以前に造血、神経、および乳腺上皮幹細胞（17-19）のFACSベースの単離に使用されている”Aldefluor”（StemCell Technologies） ALDH1発現膵臓上皮細胞のFACSベースの単離を試みる前に、本発明者らは、まずこの試薬を適用して、末梢腺房-乳管単位で生きているALDH1発現細胞を可視化 2). 図に示すように。 図2EおよびFに示すように、これらの研究は、成体マウス膵臓における低存在量のアルデフルオール陽性細胞の中心房/末端管の位置を確認した。 アルデフルオール陽性の中枢腺房／末端管細胞は，その小さなサイズとジモゲンか粒の欠如のために隣接する腺房細胞と容易に区別された。 Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬を用いた生細胞画像化のさらなる例を図１ ０に提供する。 S4… これらの知見は、抗ALDH1免疫蛍光とアルデフルオロベースの細胞蛍光は、同様の中心房/末端管集団を標識していたことを示唆し、さらにこれらの細胞が成
ALDFLUOR試薬を用いたALDH1を発現する中心房/末端乳管上皮細胞のFACS単離。 内分泌および大管要素を枯渇させた末梢腺房-管単位から単離された単一細胞に対してＦＡＣＳソーティングを行った。 （ＡおよびＢ）ＤＥＡＢ感受性ＡＬＤＨ１酵素活性に基づくＡｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性細胞のゲーティング。 ｙ軸は側方散乱を示し、ｘ軸は、ＤＥＡＢを有さないアルデフルオール信号（Ａ）および（Ｂ）の強度を示す。 （ＢおよびＣ）Ｅ−カドヘリンタンパク質の表面検出と併せて、ＤＥＡＢを用いた（Ｃ）および（Ｄ）なしのＡＬＤＨ１酵素活性の検出。 ｙ軸は、ＡＰＣ結合抗Ｅ−カドヘリン抗体による標識の強度を示し、ｘ軸は、アルデフルオロシグナルの強度を示す。 ＤにおけるＰ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５によって示されるＦＡＣＳ分類集団は、それぞれ、アルデフルオール陽性、Ｅ−カドヘリン陰性（Ａ＋Ｅ−）、アルデフルオール陽性、Ｅ−カドヘリン陽性（Ａ＋Ｅ＋）、アルデフルオール陰性、Ｅ−カドヘリン陽性（Ａ−Ｅ＋）、およびアルデフルオール陰性、Ｅ−カドヘリン陰性（Ａ−Ｅ−）に対応する。 （ＥおよびＦ）ａｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬を用いたコラゲナーゼ消化マウス膵臓の画像化は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性細胞の中心房／末端管局在を確認し、これは、ＡＬＤＨ１免疫蛍光について観察されたも 1および2）。 注心房/末端管の位置とアルデフルオール陽性細胞の小さなサイズは、頂端zymogen顆粒に対応する顆粒細胞質によって容易に識別される大きな腺房細胞に比 （スケールバー：50μ m。（Ｇ）Ａ＋ｅ＋細胞（赤）、ａ＋Ｅ−細胞（白）、Ａ＋Ｅ−細胞（青）、およびＡ−Ｅ−細胞（黒）における遺伝子発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。 A−E+アルデフルオール陰性上皮細胞と比較して、A+E+アルデフルオール陽性の中心房/末端管上皮細胞は、Aldh1A1、Aldh1A7、Sca1、Sdf1、c-Met、ネスチン、Ptf1A、およびSox9をエンコードするトランスクリプトのために濃縮されている。 （スケールバー：50μ m。
アルデフルオール陽性の中心房/末端乳管細胞由来のすい圏の形成、分化および機能。 （ＡおよびＢ）ａ＋Ｅ＋中心房／末端乳管上皮細胞であるが、ａ−Ｅ＋上皮細胞ではないが、懸濁培養において効率的に膵管を形成する。 （C–G）E-カドヘリン（C）、インスリンc-ペプチド（D）、アミラーゼ（E）、Sox9（F）、およびALDH1（G）a+E+中心房/末端乳管上皮細胞から形成された7日目の膵管における発現。 （Ｈ）培養期間の６日目に添加したＥｄｕの一晩の取り込みによって評価した７日目の膵臓細胞中の細胞増殖。 (I)グルコースの様々な濃度でパンクレアトスフェアまたはIns-1細胞のいずれかの一晩インキュベーション後の保存され、分泌インスリンCペプチドのELISAベース 膵臓細胞は、Ins-1細胞で観察されたものと同様のグルコース感受性を示すことに注意してください（すなわち、膵臓細胞は、Ins-1細胞で観察されたものと、分泌されたC-ペプチドの0対11mMグルコースに応答した≥2倍の増加）。 （スケールバー：100μ m。)
我々は、次のFACSベースの特性評価と末梢腺房管ユニットから解離した単一細胞のソートを追求しました。 ALDH1発現細胞の特異的なゲーティングを確立するための最初の手段として、我々はALDH1酵素活性（DEAB）の薬理学的阻害剤を採用しました。 図に示すように。 この戦略は、0.9％±0を含む、高レベルのDEAB感受性ALDH1酵素活性を特徴とする低存在量細胞集団の単離を可能にした。成体マウス膵臓のすべてのソートされた細胞の2％。 上皮細胞を同時に同定するためにＥ−カドヘリン抗体を使用して、アルデフルオール（＋）Ｅ−カドヘリン（＋）細胞は、成体マウス膵臓中の全ての選別された細胞の 2D）。
定量的RT-PCRを使用して、アルデフルオール陽性、E-カドヘリン陽性（A+E+）、アルデフルオール陰性、E-カドヘリン陽性（A-E+）、アルデフルオール陽性、E-カドヘリン陰性（A+E-）集団を比較するために、成体マウス膵臓から単離されたA+E+集団が有意にエンコードする転写物に富むことがわかった。ＡＬＤＨ１Ａ１およびＡＬＤＨ１Ａ７、および２つの他のＡＬＤＨ１アイソフォーム、ＡＬＤＨ１Ａ２およびＡｌｄｈ１Ａ３についての転写物の枯渇（図１）。 3G）。 Aldh8a1はいずれのサンプルでも検出されなかった。 Ａ−Ｅ＋集団と比較して、Ａ＋ｅ＋細胞は、Ｐｄｘ１（Ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝「ａ５ｂ４ ５ ２ ０ｂｂｅ」＞＜／ｄｉｖ＞０.０ ９）、アミラーゼ（Ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝「ａ５ｂ４ ５ ２ ０ｂｂｅ」＞＜／ｄｉｖ＞０.０ ０ １）、およびサイトケラチン−１ ９（ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝「ａ５ｂ４ ５ ２ ０ｂｂｅ」＞＜／ｄｉｖ＞０.０ １）（分化したβで発現されるマーカー）についての転写物を適度に枯渇させた。−細胞、腺房細胞、および管細胞、それぞれ）。 対照的に、Ａ＋Ｅ＋細胞は、アミラーゼ転写物およびアミラーゼタンパク質の両方が枯渇したにもかかわらず、Ｐｔｆ１Ａの高レベル発現によって特徴付けられた（ 図３ｇおよび図３ｇを参照。 S5）。 さらに、これらの細胞は、Sca-1、SDF1、c-Met、ネスチン、Sox9、Hey1、およびHey2、以前に膵臓および他の組織における前駆集団に関連付けられているマーカーをコードす FACSソートされた細胞のcytospinプレップ上の免疫蛍光標識を用いて、我々はALDH1とSox9タンパク質のマーク濃縮、およびA+E+細胞におけるアミラーゼの枯渇を確認した（図。 S5）。 さらに、我々はまた、アルデフルオール（+）細胞はまた、CD133とSca-1タンパク質などの幹細胞マーカーに対して陽性であった頻度を決定するためにFACS分析を行い、アルデフルオール（+）細胞の90％以上がさらにこれらの幹細胞マーカーの両方を共発現することを観察した。 対照的に、アルデフルオール（+）細胞のわずか0.11％は、0.08％が造血マーカー CD45に陽性であったのに対し、血管内皮マーカー PECAMにも陽性であった。 FACS分析は、β細胞中の赤色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックIns1-DsRedマウスから収穫した末梢腺房-管単位で行われたとき、すべてのアルデフ
内分泌および外分泌前駆機能の膵臓球アッセイ。前駆体様活性の初期スクリーンとして、アルデフルオール（＋）およびアルデフルオール（-）細胞を膵管細胞を形成する能力についてアッセイした（図10）。
神経前駆細胞を同定するために一般的に使用されるｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅアッセイと同様の（２ ３）。 これらのアッセイでは、A+E+中心房/末端管細胞は、懸濁培養中に球を形成することができた。 A+E+セルは、球形成効率を示しました>それらのA-E+対応の100倍（図10）。 図3AおよびBおよびテーブルS1)。 より低い効率では、単一のA+E+細胞は、96ウェルプレート中のクローン密度（ウェルあたり1細胞）でめっきされたときに球を形成することさえできた（表S1）。 Ｅ-カドヘリン陰性個体群のいずれも有意な球形成能力を示さなかった。 ５〜７日間にわたって培養した場合、Ａ＋Ｅ＋細胞由来のパンクレアトスフェアは、ｅ−カドヘリンの強力な発現を示した（図１ ０Ａ）。 細胞は、それらの上皮の同一性を確認し、球内の個々の細胞は、アミラーゼまたはインスリンおよびインスリンC-ペプチドのいずれかのかなりの量を蓄積し始めた（図3C）。 3DおよびE）。 5日で、pancreatospheresの≥50%はアミラーゼの表現を表示しました、30%はインシュリンのcペプチッドに免疫反応性を表示しました。 個々の球は一般にインスリンまたはアミラーゼのいずれかに陽性であったが、両方には陽性ではなかった。 球内の細胞の小さなサブセットは、培養期間中にALDH1発現を維持し、また、Sox9タンパク質の核発現を示した（図10B）。 3FおよびG)、自己再生前駆プールの維持の可能性を示唆している。 自己再生のためのこの見かけの容量は、さらにアルデフルオール（+）中心房/末端管細胞によって生成されたパンクレアトスフェアは、7日間隔で三つの連続 さらに、培養期間の開始または終了のいずれかで添加されたＥｄｕの一晩の取り込みによって評価されるように、球内の細胞は高度に増殖性であった（図 3時間）。
a+E+細胞によって表示される異なる前駆細胞容量に基づいて、内分泌前駆細胞のマーカーであるNgn3の発現のためのソートされた細胞集団をさらに調 S2B）。 以前の研究（7）と一致して、我々は、総成人膵臓または新たにソートされた細胞集団のいずれかでNgn3の有意な発現を検出することができませんでした。 しかし、a+E+細胞を培養した後、彼らはさらにALDH1を発現する中心房および末端乳管上皮細胞の内分泌前駆能力を確認し、すぐにインスリン発現の発症前にNgn3の検出可能な発現を生成し始めた。
アルデフルオール（+）末端管/中心房細胞から派生した膵管は、グルコース応答性インスリン分泌を表示します。
培養された膵臓のインスリンおよびインスリンcペプチドを発現する細胞の検出は、これらの細胞が機能的β細胞の特徴であるグルコース応答性インスリン分泌が可能であるかどうかの評価を促した。 陽性対照として、我々はIns-1細胞（クローン832/13）一般的にグルコースの生理学的濃度に応答してインスリン分泌の研究に使用される不死化β細胞株を使用し ０、５、および１ １ｍ Ｍグルコース中のパンクレアトスフェアまたはＩｎｓ−１細胞のいずれかの一晩インキュベーション後、培養培地上清および細胞溶解物の両方を採取し、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて分泌および細胞インスリンｃ−ペプチドについてアッセイした。 アルデフルオール（＋）中心房／末端乳管細胞由来のすい管球は、グルコース依存的にC-ペプチドを分泌し、Ins-1細胞によって表示されるものと同様のグルコース感 3I）。
アルデフルオール（+）成人末端管/中枢房細胞は、胚性内分泌系および外分泌系に寄与することができます。
膵前駆活性のためのさらに厳しいテストとして、我々は、E12.5マウス胚から単離されたマイクロdissected背側膵芽に単離されたアルデフルオール（+）とアルデフルオール（–）細胞をマイクロインジェクションし、生産的に内分泌および外分泌系統の開発に貢献する能力をアッセイした（図。 4). このアプローチは最近、膵管結紮後に生じるNgn3発現細胞の前駆体活性を文書化するために使用された（7）。 成体由来ドナー細胞の系統をトレースし、それらの胚由来の対応からそれらを区別するために、我々はaldefluor（+）とAldefluor（-）細胞をユビキタス発現pCAGを運ぶマウスの膵臓か ＭＣＨＥＲＲＹマウスは、Ｊｏｈｎｓ Ｈ Ｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｉｃｈａｅｌ Ｗｏｌｆｇａｎｇにより親切に提供された）。 Aldefluor(-)細胞と比較すると、Aldefluor(+)細胞は、いずれかのC–ペプチドとmCherryの共発現によって実証されるように、成熟する背側芽内の出現する内分泌系統に寄与する劇的に増強された可能性を有した(図10)。 （図４Ｂ−Ｅ）またはグルカゴン（図４Ｂ−Ｅ）。 4F-I）。 個々のmCherry陽性細胞のカウントを可能にするために重ね合わされたE-カドヘリンラベリングを使用して、我々は定量的に成体アルデフルオール（+）とアルデフルオール（-） E12へのアルデフルオール（+）細胞のマイクロインジェクションの後の七日。5背側芽では、グルカゴンの発現が残存mCherry陽性細胞の11.7％で観察され、インスリンC-ペプチド発現がさらに11.6％で観察された（図。 5N）。 対照的に、残留mCherry陽性アルデフルオール（-）細胞の2.4％はグルカゴンを発現し、わずか0.2％はインスリンC−ペプチドを発現した。 興味深いことに、アルデフルオール（+）とアルデフルオール（–）集団は、おそらくアルデフルオール（–）集団のほとんどは、すでに分化腺房細胞で構成されていたという事実を反映して、非内分泌上皮系統に入るために同等の能力を表示した。 Ｅ−カドヘリン、アミラーゼ、およびＰＮＡ陽性の同様の頻度が、アルデフルオール（＋）またはアルデフルオール（−）集団のいずれかに由来する残留ＭＣｈｅｒｒｙ陽性細胞で観察された（図 4J-N）。
アルデフルオール陽性の成人膵臓細胞は、培養胚性膵臓において内分泌系および外分泌系の両方に入る。 (A)実験の概略図。 成体細胞の系統を追跡するために、アルデフルオール（+）とアルデフルオール（–）細胞は、成体CAGから単離された：mCherryトランスジェニックマウス膵臓、e12から単離された5非トランスジェニックマウス胚、および生産的に開発内分泌および外分泌系統に貢献する能力をアッセイしました。 （B–J）MCHERRYとインスリンCペプチド（B-E）とmCherryとグルカゴン（F–I）の共発現は、FITC共役PNA（J–M）と個々のmCherry陽性細胞の標識は、胚腺房系統に貢献する能力を確認するのに対し、胚 （N）残留mCherry陽性成人Aldeflouor（+）とAldefluor（-）細胞は、インスリンC−ペプチド、グルカゴン、E-カドヘリン、およびpnaの7日マイクロdissected E12.5背側膵臓芽にマイクロインジェクショ すべての細胞数は、個々の細胞の境界を概説するためにe-カドヘリン標識を使用して決定した。 内分泌分化のための能力は、アルデフルオール（+）集団に主に制限されていることに注意してください、アルデフルオール（+）とアルデフルオール（−）細胞は、生産的に外分泌の系統の開発に貢献することができます。 （スケールバー：50μ m。
慢性炎症および再生上皮化生の設定におけるALDH1発現中心房および末端乳管上皮細胞の拡張。 抗原検索に続いて、ALDH1タンパク質は、正常な成人膵臓（AおよびB）とカエルレイン（C–H）の三週間注射によって誘導された慢性pancreatitis炎を有するマウスから収 （ＡおよびＢ）正常な成体膵臓からの末端管（Ｔ Ｄ）上皮細胞におけるＡＬＤＨ１の低頻度標識化。 (C and D) Expansion of ALDH1-expressing terminal ductal epithelium following sequential caerulein administration. (E and F) Similar expansion of ALDH1-expressing centroacinar cells (CAC) following sequential caerulein administration. (G and H) Expression of ALDH1 in caerulein-induced metaplastic type 2 (TC2; H), but not type 1 (TC1; G) tubular complexes.
Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.
ALDH1発現中枢および末端管細胞のin vivoでの挙動を評価するために、我々は慢性炎症と低用量カエルレインの逐次投与によって誘導される再生化 以前に報告されたように（15）、カエルレイン（50μ g/kg）を週に3回注射した成体マウスの治療は、慢性膵炎の状態を誘発し、その後ほぼ完全な再生および修復 このプロセスは、炎症性浸潤、間質拡張、および以前に腺房細胞由来であることが示されているタイプ1管状複合体と、以前に非腺房由来であり、おそらく増殖末端管細胞から生じることが示されているタイプ2管状複合体（TC2）を含む再生化生管状複合体の形成によって特徴付けられる（15）。 正常な成体膵臓において観察されたＡＬＤＨ１発現末端管および中枢房細胞の比較的低い存在量とは対照的に（図１ ０Ａ）、ＡＬＤＨ１発現末端管および中枢房細胞は、 図5aおよびB)、ALDH1発現末端ダクト(図5aおよびB)、ALDH1発現末端ダクト(図5aおよびB 図５ｃおよびＤ）および中心軸（図５ＣおよびＤ）および中心軸（図５ＣおよびＤ）。 5EおよびF）細胞は、カエルレイン誘発性慢性膵炎の設定で著しく拡大した。 注目すべきことに、２型管状複合体は、主にＡＬＤＨ１発現細胞から構成されていた（図１ ０Ａ）。 一方、タイプ−１管状複合体は、ＡＬＤＨ１発現の証拠を示さなかった（図５Ｈ）。 5G）。
