要約

現代の社会生活の圧力の高まりは、深部静脈血栓症（DVT）を含む心血管疾患の発症 薬剤耐性高血圧症の治療のための臨床的アプローチの一つとして腎交感神経脱神経が適用されている。 さらに、酸化ストレスと心血管疾患との密接な関係は十分に文書化されている。 Ｄｖｔの発生における腎交感神経系と酸化ストレスが血液凝固系に影響を及ぼすメカニズムを検討した。 ラットの慢性足ショックモデルをヒトと同様の生理学的ストレスの状態を模倣するために適用した。 その結果，慢性足ショック法は血小板凝集の活性化を介してＤＶＴを促進することが分かった。 ＤＶＴの悪化と血小板の活性化は腎交感神経脱神経または抗酸化剤（Ｔｅｍｐｏｌ）治療によって軽減された。 同時に、脱神経処理はまた、ラットの循環酸化因子のレベルを低下させることができた。 これらの結果は，腎交感神経系と酸化ストレスの両方が慢性ストレスに応答してＤＶＴの発症に寄与し，臨床ＤＶＴ患者の治療のための新しい戦略を提供することを示している。

1. はじめに

深部静脈血栓症（DVT）は、心臓発作や脳卒中後の心血管疾患による死亡の第三の最も一般的な原因である一般的な心血管疾患関連の後遺症、肺 ＤＶＴ発症の三つの主要な危険因子は，遅い血流，静脈壁損傷，および凝固亢進状態である。 その結果、抗凝固剤および血栓溶解剤は、臨床DVT患者のための2つの主要な治療法である。 Virchowによって仮定される血栓形成の素因となる危険因子のトライアドには、血液成分間の比、血管壁の完全性、および血流量の変化が含まれる。 血液凝固システムは、致命的な出血から哺乳類を保護する上で重要な役割を果たしています。 すべての形態の血栓症において、凝固および炎症は、傷害に対する身体の反応を調整するために一緒に作用する2つの主要な経路である。

過去数十年にわたって、ストレスやうつ病などの心理的要因は、人間の健康に影響を与える重要な要因として認識されてきました。 不安の長い期間は、心血管疾患の発症を誘導します。 さらに、同時に起こることによって、うつ病および不安は、心血管疾患の発症をさらに悪化させるであろう。 さらに、ストレスおよび他の心理的要因は、脳卒中および心筋梗塞の発生と密接に関連していることが実証されている。 多くの研究はまた、ストレスが組織や器官に長期的な構造的損傷を引き起こす可能性があることを示しています。 慢性電気足ショック手順は、収縮期血圧の上昇を誘導することができることが実証されている制御不能で予測不可能な心理的ストレスのモデルと しかし、DVTの発症に対する慢性ショックの影響に関連する報告はまだない。

高血圧の発症における交感神経腎神経の役割は、実験的および臨床的観察の両方において実証されている。 交感神経性腎神経には、求心性腎神経と遠心性腎神経の二つのタイプがあります。 求心性交感神経線維は腎臓に由来し，中枢性交感神経流出を調節することにより，神経原性高血圧を直接修飾する。 同時に、遠心神経はナトリウムおよび水保持を高め、レニン解放を刺激し、そして腎臓の血の流れを変えます。 このようにして、短期および長期の血圧は腎交感神経によって影響される可能性がある。 臨床研究では、難治性高血圧患者における腎交感神経脱神経の有益な効果が報告されている。 血圧に対する脱神経の低下効果に加えて、心血管疾患、糖尿病、腎機能障害、心臓肥大、心不全、および不整脈においても追加の利点が報告されている。 高血圧、多くの病気のための主要な危険率は、endothelial機能障害を高め、血栓症を促進でき、またcardiocerebral管の病気の発生と密接に関連しています。 したがって，腎交感神経脱神経は高ストレス条件下での心血管疾患の予防と治療における新しい戦略を提供する可能性がある。最近、実験では、酸化ストレスが内皮機能の変化の原因である可能性があることが示されている。

最近、実験では、酸化ストレスが内皮機能の変化の 血管内皮および循環血液細胞によって産生される活性酸素種の増加は、血管運動および内皮バリア機能を損ない、血栓形成を増強する。 酸化ストレスはまた，アテローム血栓症の危険因子である血小板活性化の決定因子であることが分かった。 しかし，慢性ストレスが酸化ストレスの増加によって凝固系に影響を与えるかどうかはまだ不明である。

現在、心理的ストレスを凝固系および心脳血管疾患と直接結びつける報告はない。 凝固系の活性化が生理学的止血と病理学的血栓症の両方に重要な影響を及ぼすことを考慮して，慢性がＤＶＴの発症と関与する可能性のあるメカニズムに影響を与えるかどうかを検討するためにラットの足ショックストレスモデルを適用した。

2. 材料および方法

2.1. 動物製剤

上海実験動物センターから得られた十週齢の雄Sprague-Dawleyラットを本研究で使用した。 動物を、１ ２：１ ２時間の明暗サイクルで２ ５℃の温度制御環境で維持した。 ストレスプロトコルにさらされたラットは、個別に彼らは5秒の長い0.15mAショックごとに30秒を提供する電化グリッド床を介して電気足ショックの4時間のセッションを受けた足ショックストレスボックスに配置されました。 ラット腎交感神経は外科的に切断されたが、動物は10％クロラール水和物誘発麻酔下にあった。 一週間の回復期間の後、足のショックプロトコルが開始されました。 テンポール（10mg/kg/日）は、ストレスプロトコルの開始後に腹腔内注射によって投与された。 静脈血栓症は、Leungによって以前に記載されているように、10％クロラール水和物を用いた麻酔条件下で誘導された。 簡単に言えば、腹部を開き、下大静脈（IVC）は、周囲の組織から慎重に分離された後、綿糸を用いて左腎静脈のすぐ下にしっかりと結さつされた。 その後、腹部を二重層の縫合糸で閉じ、最初に筋肉で腹膜を閉じ、次に皮膚を別々に閉じた。 １ ２時間後、動物を再び麻酔し、腹部を再開し、さらなる分析のために血漿および血栓を採取した。 本研究は、実験的および他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約（Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏ ｆ Ｅｕｒｏｐｅ ｎｕｍｂｅｒ１ ２ ３、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、１ ９ ８ ５）に準拠して実施された。 すべての外科的処置は、蘇州大学によって承認され、蘇州大学によって確立された動物のケアおよび使用のためのガイドラインに従って行われた。

2.2. 血漿コルチコステロンレベル測定＜／ｈ５＞＜ｐ＞血漿コルチコステロンレベルは、市販のｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＴＳＺ Ｅｌｉｓａ、ＵＳＡ）を使用して測定した。2.3.

血栓重量測定

再開された腹腔から、大静脈の結紮された部分を除去し、縦方向に開いて形成された血栓を除去し、これをすすぎ、濾紙で秤量した。2.4.

血液凝固パラメータ＜／ｈ５＞＜ｐ＞プロトロンビン時間（Ｐ ｔ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＰＴ）、トロンビン時間（Ｔ Ｔ）の分析は、自動血液凝固分析装置（シスメックス社Ｃ Ａ-５ ０、日本）を用いて測定した。 再開された腹腔から、血液（4.5mL）は、0.5mLの3.8％クエン酸ナトリウム溶液を含む使い捨てシリンジを用いて下大静脈から採取し、オートクレーブ遠心管 血液の半分を３ ０ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間遠心分離し、血清を回収した。 0.1mLの血清アリコートを0に合わせた。1mLのPT試薬。 ２ ０分間予熱した後、上記のように、自動血液凝固分析装置を用いてＰＴを測定した。 ＡＰＰＴおよびＴＴは、ＰＴと同様の方法を用いて測定した。血小板凝集分析装置（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ５ ６ ０Ｃ Ａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて血小板凝集を測定した。＜／ｐ＞＜ｐ＞血小板凝集を測定した。 空洞が再開された後、4.5mLの血液は、0.5mLのクエン酸ナトリウム（3.8％）を含有する使い捨てシリンジを用いて下大静脈から採取し、遠心管に移した。 血液の後半を１ ０ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間遠心分離して、血小板に富む血漿を得た。 チューブ内に残っている血液を３ ０ ０ ０ｒｐｍで１ ０分間遠心分離して、血小板不良血漿を調製した。 次に、血小板アゴニストとしてコラーゲンタンパク質およびアデノシン二リン酸二ナトリウム（ADP）（1mM、10mL）を用いて血漿試料の凝固を刺激した。2.5.

血漿ノルアドレナリン（Ｎ Ａ）濃度の決定＜／ｈ５＞＜ｐ＞血漿ノルアドレナリン（Ｎ Ａ）レベルは、市販のｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＴＳＺ Ｅｌｉｓａ、ＵＳＡ）を使用して測定した。2.6.

2.6. 脂質過酸化レベルおよび血漿スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ-Ｐ Ｘ）活性＜／ｈ５＞＜ｐ＞血漿ＳＯＤおよびＧＳＨ-Ｐ Ｘ活性および脂質過酸化レベル（チオバルビツール酸反応性物質、ＴＢＡＲＳ）の測定は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＴＳＺ Ｅｌｉｓａ、ＵＳＡ）を用いて測定した。2.7.

2.7. 統計分析

すべてのデータを平均±SEMとして提示した。 2つ以上のグループ間の比較の統計的有意性は、2元ANOVAに続いてNewman-Keuls検定を使用するか、または対になっていない両側Student’s検定を使用して検定しました。 値<0.05は統計的に有意であると考えられました。

3. 結果

3.1. 血漿コルチコステロン濃度

血漿コルチコステロン濃度（ストレスのマーカー）に対するショック、脱神経、およびTempol治療の効果は、対照群（図1）と比較して足のショック群で著しく増加し、足のショック単独群（図1）と比較して脱神経プラスショックおよびTempolプラスショック群で著しく抑制された。 この結果から，慢性足ショックは身体がストレス下にあるときに血しょうコルチコステロンを有意に増加させ，脱神経とテンポール治療の両方がストレス状態を緩和することができることが示唆された。

図1

コルチコステロンの血漿濃度。 二週間ストレス後の各群における血漿中のコルチコステロン濃度は、材料および方法のセクションに記載されているように測定した。 各群（）のデータを平均±ＳＥＭとして示した。 *対照群と比較される。 ♦ストレス群と比較した。

3.2. Ivc結紮誘発血栓の重量に対するショック、脱神経、およびTempol治療の効果

血栓は、IVC結紮後12時間を収集し、重み付けした。 足ショック群では、対照群と比較して血栓重量が有意に増加した（図2）。 しかし、脱神経プラスショック群とTempolプラスショック群の血栓重量は対照群の血栓に比べて変化しなかったが、足ショック群の血栓に比べて有意に減少した（図2）。 これらの結果は，慢性ショックがＤＶＴの形成を促進し，脱神経とテンポール治療の両方がｄｖｔ形成のストレス誘発性増加を阻害することを示唆した。div>

(a)

(b)

(a)

(a)
(a)
(a)
(b)

図2

血栓の重量。 （ａ）各群における血栓の代表像。 （ｂ）血栓の重量は、材料および方法のセクションに記載されているように、二週間のストレス後に各群で測定した。 各群（）のデータを平均±ＳＥＭとして示した。 *対照群と比較される。 ♦ストレス群と比較した。3.3.3. ショック、脱神経、およびTempol治療が血液凝固パラメータに及ぼす影響

IVCからの血液採取後、血液パラメータ（PT、APPT、TT、および血小板凝集）を測定した。 ＰＴ，Ｔ ｔ，血小板凝集パラメータには対照群と足ショック群との間に有意差があった。 足ショック群のＰＴは対照群より低かったが，ＴＴおよび血小板凝集パラメータは対照群に比べて足ショック群で高かった。 並行して、足ショック群と比較して、脱神経＋ショック群およびTempol＋ショック群のTTおよび血小板凝集パラメータにおいて有意な減少が観察された（表1および図3）。 これらの結果から，慢性ショックは血小板凝集の活性化により凝固系を増強できることが明らかになった。

Control Shock Denervation + shock Tempol + shock PT (s) APPT (s) TT (s)

PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT、トロンビン時間;対対照群;対ショック群。

表1

PT、APPT、TTに対するショック、脱神経、およびTempol治療の影響。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 3

Platelet aggregation rate. ＡＤＰによって刺激された血小板凝集速度（ａ，ｂ）およびコラーゲンによって刺激された血小板凝集速度（ｃ，ｄ）は、血小板凝集アナライザを介した材料および方法の項に記載されているように、二週間のストレス後の各群において測定された。 （ａ）及び（ｃ）は、血小板凝集分析装置によって提供される血小板凝集トレースを表す。 各群（）のデータを平均±ＳＥＭとして示した。 *対照群と比較される。 ♦ストレス群と比較した。

3.4。 血漿ノルアドレナリン（NA）濃度に対するショック、脱神経、およびTempol処理の影響

足ショックは、対照群と比較して血漿ノルアドレナリン（NA）レベルを有意に増加させた（図4）。 脱神経プラスショック群およびTempolプラスショック群の血漿NAレベルは、足ショック群と比較して有意に抑制された（図4）。 これらの結果は腎脱神経手術の成功を確認した。

図4

ノルアドレナリンの血漿濃度。 ２週間ストレス後の各群の血漿中のノルアドレナリン濃度を、材料および方法の節に記載されたように測定した。 各群（）のデータを平均±ＳＥＭとして示した。 *対照群と比較される。 ♦ストレス群と比較した。

3.5。 血漿SODおよびGSH-Px活性およびTBARSレベルに対するショック、脱神経、およびTempol処理の影響

ストレス群の血漿SOD活性は対照群と比較して著しく減少した（図5(a)）。 脱神経プラスショック群およびTempolプラスショック群における血漿SOD活性は、足ショック群と比較して著しく上昇した（、図5（a））。

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 5

Plasma SOD, GSH-Px activities, and TBARS levels. Plasma SOD activity (a), GSH-Px activity (b), and TBARS levels (c) in each group after two-week stress were measured as described in Materials and Methods section. 各群（）のデータを平均±ＳＥＭとして示した。 *対照群と比較される。 ♦ストレス群と比較した。足ショック群の血漿GSH-Px活性も対照群のそれよりも著しく高かった（図5（b））。 脱神経プラスショック群およびTempolプラスショック群における血漿GSH-Px活性は、足ショック群と比較して著しく上昇した（、図5（b））。

足のショックは、対照群と比較して血漿チオバルビツール酸反応性物質（TBARS）のレベルの顕著な増加をもたらした（、図5（c））。 脱神経プラスショック群およびTempolプラスショック群における血漿TBARSレベルは、足ショック群と比較して著しく抑制された（、図5（c））。

4. 考察

本研究では、ストレス条件下でDVT形成が促進され、血液凝固系の変化がストレスによって誘発されることを同定した。 データを蓄積すると、慢性的な心理的ストレスが二つのシステムを活性化するこ: 一つはカテコールアミン，コルチゾール，バソプレシン，エンドルフィン，アルドステロンの放出によって主に媒介される視床下部-下垂体-副腎皮質（ＨＰＡ）系であり，もう一つは交感神経-副腎髄質系の活性化によるものである。 データに示すように、慢性ショック群のコルチコステロンレベルは有意に増加し、HPAが活性化されたことを示している。 ストレスに応答した交感神経系の役割は何ですか？ 腎交感神経系の活性化は高血圧の発症に強く関連しており，腎脱神経は難治性高血圧患者の臨床における新しい治療法であることが示されているため，腎交感神経系は心血管疾患において重要な役割を果たさなければならない。 また、最近の観察では、高ストレス状態は心血管疾患、特に心臓や脳梗塞と非常に関連していることが示されているため、慢性ストレスが腎交感神経系の活性化を介して凝固系を活性化するかどうかを推測している。 本研究では、まず、慢性ストレスがDVT形成を集約することができ、ストレスが心血管疾患のリスクを増加させることを示唆していることを見出した。 さらに、我々は、PT、APPT、TT、および血小板凝集を含む血液凝固系の活性を定義するパラメータを測定した。 ＡＤＰとコラーゲンの両方によって誘発される血小板凝集に有意な変化があり，ＤＶＴ形成に対するストレスの悪化効果は血小板の活性化によって媒介されることを示唆した。 我々の結果は、まず、高ストレス状態と心血管疾患をリンクするメカニズムを明らかにした。 Ｄｖｔの慢性ショック誘発発症における腎交感神経系の役割は明らかであったが，求心性神経または遠心性神経が外科的処置の制限のために主要な役割を果たすかどうかを同定することは困難であった。 その理由は、求心性神経がDVTの発達に寄与する可能性のある血圧の神経原性制御に影響を与える可能性があるからである; また，遠心神経はノルアドレナリンの腎分泌を調節し，ＤＶＴの発症にも寄与する可能性がある。

損傷した内皮および活性化凝固因子または血小板の存在は、DVTの発達および進行を促進する。 血管損傷の部位で起こる血小板凝集（すなわち、血小板が互いに付着するとき）は、血栓症の発症にとって重要であると長い間認識されてきた。 本研究では，主にＤＶＴにおける血小板機能に焦点を当てた。 血小板の付着、放出、または凝集の現象は、血小板活性化としても知られている。 活性化された血小板は、血栓症プロセスにおいて重要な役割を果たす。 我々のデータは、血小板凝集がDVT形成の増強とともに、ストレス処理後に増加したことを示している。 血小板数は、血小板活性の測定を正常化するために使用されたが、各群の血小板数に関する統計は行われなかった。

血漿GSH-PxおよびSOD活性および血漿TBARSレベルの分析により、身体は慢性足ショック治療によって誘発される酸化ストレスの状態にあり、腎脱神経 いくつかの報告では、nad(P)hオキシダーゼ活性は、腎交感神経によって放出されるカテコールアミン(CA)を介してα1-およびβ2-受容体によって直接増加することが示されている。 また、β1受容体拮抗薬は、NAD（P）hオキシダーゼ活性化によって引き起こされる血管酸化ストレスを減少させることが示された。 したがって、腎交感神経神経支配は酸化ストレスレベルを直接増加させると言うことができます。 血栓のさらなる危険因子である血小板凝集が酸化ストレスと関連していることが報告されている。 酸化ストレスは血小板表面に位置する酸素フリーラジカルを介して血小板凝集を直接増加させる可能性がある。 確かな証拠は、酸化ストレスがさまざまな方法で血小板を直接活性化できることを示しています。 酸化ストレスO2-の生成物は血小板または内皮と反応する可能性があるため、血管血栓症にとって特に重要なONOO-由来のNOもそのような効果を有す いくつかの研究では、O2−がトロンビン、コラーゲン、またはADPへの血小板活性化の閾値を低下させる可能性があり、O2−が自発的な凝集を誘導すること この内因性rosの役割は、血小板の活性化における外因性ROSに類似している。 一般的に、ストレス誘発性血小板凝集につながるいくつかのシナリオが存在する。 最初のものでは、腎交感神経はストレスによって活性化され、体全体の酸化ストレスが増加し、続いて血小板凝集が増加する。 他のシナリオでは、圧力は直接血小板の集合を直接高めるボディ酸化圧力の生産を誘発します。 腎交感神経の脱神経は血小板の活性化に直接影響する可能性があるが，そのメカニズムはまだ解明されていない。

我々のデータは、慢性ストレス治療がAPPTまたはPTのいずれにも有意な影響を及ぼさないことを示し、ストレス促進DVTは外因性または内因性凝固系と関連していない可能性があることを示唆している。 それにもかかわらず，慢性ストレス治療はＴＴを著しく増加させる可能性があり，これはフィブリノーゲンのフィブリンへの変換時間が高フィブリノリシスのために延長されたことを示している。 以上より，線溶性高線維素溶解は慢性ストレス条件下での血液凝固の増強によるものと推測した。 同時に，腎脱神経および抗酸化処理は血小板凝集を減少させ，血液凝固を抑制することができた。 これらのデータに基づいて，ショック群と比較して，ＴＴはこれら二つの条件で正常な速度に向かう傾向があることが観察できた。

これは、我々の現在の観察では、我々はTempol治療は、hpa活性化誘導ホルモン放出における酸化ストレスの関与を示唆し、コルチコステロンレベルの慢性ス しかし，交感神経と酸化ストレスが慢性ショックによって誘発されるＤＶＴの発症に独立して寄与していることを示した。

結論として、慢性ストレスは、腎交感神経の活性化および酸化ストレスの増加を介して直接血小板凝集を増加させる可能性がある。 そして、血小板凝集の増加によってＤＶＴが促進されるようになる。 いくつかの調査はアテローム性動脈硬化および他の心血管疾患が酸化圧力と密接に関連付けられ、患者が酸化圧力のマーカーの低い血の酸化防止レベ したがって、心脳血管疾患およびDVTの観点から、ホルモンおよび抗酸化レベルで治療を標的とすることにより、これらの疾患を予防および治療するこ これに加えて、腎交感神経を介した新しい治療法です。

利益相反

著者は、競合する財政的利益を宣言していません。

著者の貢献

Guo-Xing Zhangは実験を考案し、設計しました。 Tao Dong、Yu-Wen Cheng、Pei-Wen Sun、Chen-Jie Zhuが実験を行った。 フェイ-ヤンは血小板凝集を支援した。 郭興張は、試薬/材料と分析されたデータを貢献しました。 郭興張、陶東、ユ-ウェンチェンが論文を書いた。

謝辞

著者は、Li Zhu教授とZhu研究室の他のメンバーに実験的なアドバイスと支援に感謝しています。 この研究は、中国の国家自然科学財団（81270316、814170563）と蘇州大学の研究プログラム（Q413400111）によってサポートされていました。