等電点集光および2-Dゲル電気泳動の前にタンパク質を可溶化および変性させる場合、ほとんどの研究者は尿素を選択する。 この穏やかなchaotropic代理店が完全に蛋白質分子間の相互作用を破壊し、効果的に蛋白質が集まることおよび/または沈殿することを防いでいる間蛋白質の消化力のプロテアーゼの活動の効率を高めることができるのでこれは驚くべきことではないです。 さらに、尿素は、以前に変性した試料からのタンパク質の再生にも使用される。
効果的なタンパク質変性剤としての人気にもかかわらず、タンパク質を消化する際に尿素溶液を使用することは特に課題があります–それはカルバミル化のリスクを増加させます。 なぜこれはあなたに関係する必要がありますか？ ここでは、カルバミル化はあなたの実験に有害であり、なぜそれはすべてのコストで避けるべきである理由をいくつかの理由があります。
- タンパク質分子のN末端を遮断することは別として、カルバミル化はタンパク質の特性評価を妨げ、さらなる使用のためにそれらを利用できな
- それは積極的にアルギニンおよびリジンの残余の側鎖を攻撃し、蛋白質を酵素の消化のために不適当にする。
- これは、タンパク質の酵素消化を妨げ、MS分析におけるタンパク質の同定および定量に悪影響を及ぼす。
- 予期しない保持時間を持つペプチドから得られた結果を混乱させ、サンプルの複雑さを増加させます。
- イオン化効率を低下させ、検出されたピークの信号強度に負の影響を与えます。
- これは、タンパク質の等電点の変化を誘導し、人工的な結果をもたらす。
- これは、in vivoでのカルバミル化研究の結果に影響を与える可能性があります。
カルバミル化の原因は何ですか？
定義により、カルバミル化は、タンパク質の構造的および機能的特性を変化させる翻訳後修飾を指す。
定義により、カルバミル化は、タンパク質の構造および機能的特性を変化させる翻訳後修飾を指す。 これはイソシアニック酸と自由なアミノのグループ間の非酵素の反作用によってもたらされます。
水溶液中では、尿素はシアン酸アンモニウムと平衡して存在する。 (1)溶液中の尿素は自発的に解離してシアン酸イオンとアンモニウムイオンを生成すること、(2)タンパク質アミノ基と積極的に反応してカルバミル化を誘導するイソシアン酸(CNOH)に分解すること、(3)尿素が解離する速度とカルバミル化の程度は温度、pH、インキュベーション時間に依存することに注意することが重要である。
カルバミル化の防止：考慮すべきいくつかの有用なヒント
熱とタンパク質の存在下で尿素が常にカルバミル化につながるという事実を変 利用できる最も高い等級の尿素を使用し、まだcarbamylationの危険を動かすことができます。ありがたいことに、カルバミル化からペプチドを保護するにはいくつかの方法があります。
ここにこの目的を達成するのに使用することができるある有効な作戦はある。
- プロテオミクス手順を行うときは、常に新鮮に調製した尿素ベースの試薬を使用してください。 信頼できる源からの良質の乾燥した尿素ベースの前混合され、使用可能な緩衝を使用し、あなたのサンプルの準備の細心の注意を観察しなさい。 注:室温で固体材料を貯え、最低に扱い続けて下さい。
- 透析および/または高速逆相クロマトグラフィーを使用するか、スピンカラムを使用して、消化前にタンパク質サンプルから尿素を除去する。
- 尿素が分解する速度を低下させるために、比較的低い温度で試料を維持する。 Carbamylationの危険を減らすために37ocの上の尿素含んでいる緩衝を熱することを避けて下さい。
- イオン交換樹脂を用いて尿素溶液を脱イオンし、シアン酸濃度を低下させる。
- イソシアン酸の形成を妨げるために尿素溶液（100mM HCl）を酸性化する。
- エタノールアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、トリス-HClなどの試薬を使用して、タンパク質/ペプチドカルバミル化を最小限に抑えます。 これらの試薬はそれによりペプチッドのためにそれらを利用できなくさせるシアン酸塩の分子のための掃除によって助けます。
確かに、これらの戦略には独自の欠点があります（すなわち しかし、酵素消化は長期間にわたって高温で行われるため、消化混合物から尿素を除去するしかありません。 それ以外の場合は、常にcarbamylationのリスクを実行します。 それはあなたが取りたいと思わない危険である。
