イントロダクション

哺乳類を含む様々な生物の完全なゲノム配列は、DNAシークエンシング技術の急速な進歩の結果として、最近利用可能になっている。 しかし、特に哺乳類では、転写物の分析は、まだゲノムとプロテオームの間のギャップを埋める上で重要な役割を果たしています。 これは、現在、ゲノム情報だけでは特定の遺伝子に由来する転写物の構造を正確に予測することができないためです。 したがって、転写物の分析のための方法として、cDNAライブラリーの構築は、ポストゲノム配列決定の時代であっても重要である。 PCRによる関心のある遺伝子のcDNAクローニングは、cDNAライブラリ構築なしで転写構造を分析するための単純化された代替ルートを提供しているが、cDNAラ 今日まで、高品質のcDNAライブラリーを調製するための方法の開発に多大な努力が払われてきた（1-4）。 対照的に、Rnaの小さなプールから高品質のcDNAライブラリを調製する方法の問題は、それほど積極的に対処されていません。 しかし、研究者は、病理学的サンプルで見られるような特定の条件下で特定の種類の細胞または組織でのみ発現すると予測される仮説的な遺伝子に

増幅されたcDNAまたはcRNAを生成するための少量のソースRNAの使用を記述する多くの報告があり、そこからマイクロアレイ分析のための標的を調製 それらの最終的な目標は、元のｍＲＮＡの高度に代表的な完全長の非集団バイアスＲＮＡを得ることである。 これを行うために、これらの方法は、通常、ＰＣＲまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を採用して、元のｍＲＮＡをｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの形態でそれぞれ増幅する。 発現プロファイルの比較は、細胞や組織の生理学的状態の違いを調査するための最も効率的なアプローチの一つですが、転写物の構造特性（例えば、代替スプライシングパターン、転写開始部位、および転写終了部位の同定）は、このようなマイクロアレイ解析によって行うことはできません。 これらの場合、各転写物の配列解析は避けられません。

遺伝子クローニングや包括的なシーケンシング解析に適したcDNAライブラリーを構築するために、少量の出発RNAを使用できる方法を開発しました。 この方法は、増幅中のサイズバイアス効果を最小限に抑えるために、それぞれ、T7およびSP6ファージプロモーター配列と第一ラウンドcdnaの3’および5’端 二ラウンドcRNA増幅後、増幅したcrnaをcdnaに変換し、これらの生成物をプラスミドにクローニングし、得られたcDNAライブラリーを従来の方法（4,16,17）で構築したものと比較して評価した。

材料および方法

cRNA増幅

この研究で使用されたオリゴヌクレオチドの配列を表1に示す。 プロトコルを確立するために、我々はテンプレートとしてICRマウス脳（8週齢の雄マウス）から調製した1μ gの総RNAを使用しました。 １μ ｇの全ＲＮＡと１ ０ ０ｐｍｏｌのＴ７−Ｎｏｔ−（ｄ Ｔ）１ ８プライマーの混合物（１ ０μ ｌ）を７ ０℃で１ ０分間インキュベートした後、氷上で急冷した。 二本鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプター連結を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）（４，１ ６，１ ７）のプロトコルに従って、軽微な改変を加えて行った。 １Ｍジチオトレイトール（ＤＴ Ｔ）１μ ｌ、１ ０ｍ Ｍ ｄＮＴＰｓ１μ ｌ、（４ ０Ｕ）Ｒｎａｓｅｏｕｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μ ｌ、および水１μ ｌを変性ＲＮＡ／Ｔ７−Ｎｏｔ−（Ｄ Ｔ）１ ８プライマー混合物に添加し、３ ７℃で３分間インキュベートして 次いで、反応混合物に２μ ｌ（４ ０ ０Ｕ）ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩＩ Ｒｎａｓｅ Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、温度を５ ０℃に調整して第１鎖ｃ ＤＮＡ合成を開始した。 １時間後、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１ ８）により以前に記載されたように第２鎖ｃ ＤＮＡ合成を行った；第１鎖ｃ ＤＮＡ混合物に、水９ １μ ｌ、５×第２鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３ ０μ ｌ、１ ０ｍ Ｍ ｄＮＴＰｓ３μ ｌ、１μ ｌ（１ ０Ｕ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、４μ ｌ（４ ０Ｕ）ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および１μ ｌ（２Ｕ）ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ Ｈを添加し、混合物を１ ６℃で２時間インキュベートした。その後、ｃＤＮＡ末端を、１ ０ｕ ｔ４ｄｎａポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１ ６℃で５分間末端研磨し、１ ０μ ｌの０． 得られたｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２ ５：２ ４：１）による抽出により精製し、続いて前述の（１ ７）のようにエタノール沈殿させたが、ポリアデニル酸 沈殿したｃＤＮＡを、５ ０μ ｌのＴＥ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８． インキュベーション後、ｃＤＮＡ混合物を１ ８，０ ０ ０×ｇで４℃で１ ５分間遠心分離した。 得られたｃＤＮＡペレットを７ ０％エタノールで２回すすぎ、乾燥させ、次いで３ ０μ ｌの水に再懸濁した。 精製したｃＤＮＡを５ ０ ０ｐｍｏｌ ｓｐ６アダプター（表１）で５Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、５ ０μ ｌの反応体積中で１ ６℃で一晩連結した。 アダプター連結された混合物を水で２倍に希釈し、次いで、Ｄｎａｃｌｅａｒ（商標）カラム（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔ Ｘ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを精製した。 溶出液（水中１ ６μ Ｌ）をｃＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。 Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ｃＲＮＡを３ ７℃で４ ０μ Ｌの反応容積で一晩合成した。 鋳型ｃ ＤＮＡを４ＵのＤｎａｓｅ ｉによって分解した後、合成したｃＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を用いて精製し、１ ０ ０μ ｌの水で溶出した。 ＣＲＮＡの濃度は、紫外線（ＵＶ）吸収によって決定した。 ２回目のｃｒｎａ増幅のために、２μ ｇの合成ｃＲＮＡおよび１ ０ ０ｐｍｏｌのＳＰ６ｕｐプライマー（表１に示されるｓｐ６アダプターの上部鎖オリゴヌクレオチドに等しい）を鋳型およ 第二ラウンドのcDNA合成は、SP6upプライマーアニーリングを50℃で3分間行ったことを除いて、ソースRNAからの元の逆転写のように行った。 得られた二本鎖ｃＤＮＡをＤｎａｃｌｅａｒカラムで精製した後、０.５μ ｇのｃＤＮＡを、次のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ支援ｃＲＮＡ増幅のための鋳型として使用した。 Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ｃＲＮＡ合成を３ ７℃、６時間行った。ｄｎａｓｅ ｉを用いて鋳型ｃ ＤＮＡを分解した後、合成したｃＲＮＡを上記のようにして精製した。

表1. ライブラリー構築に用いたプライマーおよびアダプターのヌクレオチド配列

cDNAライブラリー構築

得られたcrnaの二つのマイクログラムを、100pmol attb2-Not-(dT)18プライマーを用いた二本鎖cDNA合成に供した（表1）。 ＣＤＮＡ合成、末端鈍化、精製、およびアダプター連結工程は、ＡＴＴＢ１アダプター（表１、５ ０ ０ｐｍｏｌ）が二本鎖ｃＤＮＡに連結されたことを除いて、以前のｃＤＮＡ合成と同様に実施した。 ＡＴＴＢ１アダプター連結ｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿、およびＰＥＧ／Ｎａｃｌ沈殿の連続処理によりこの順序で精製した後、５ ０μ ｌのＴＥに溶解し、Ｒｎａｓｅ Ａ（最終濃度１ ０μ ｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して、３ ７℃で３ ０分間、汚染ＲＮＡを分解した。 反応混合物を再びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる抽出により精製し、続いてエタノール沈殿およびＰＥＧ／Ｎａｃｌ沈殿を行った。 得られたcdnaを15μ l TEに溶解し、その量をアガロースゲル上で電気泳動した後の蛍光染色強度から推定した（4）。 ＡＴＴＢ１連結ｃＤＮＡ（３ ６ｎｇ）を、２ ５ ０ｎｇのＡＴＴＰ−ｐｓｐ７ ３ドナーベクターを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え反応（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に先に記載したように供した（４、１ ６、１ ７）。 要するに、ＡＴＴＢ１連結ｃ ＤＮＡおよびＡＴＴＰ−ｐｓｐ７ ３ドナーベクターを混合し、２μ ｌの５×ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅｔｍ反応緩衝液および２μ ｌのｂｐ Ｃｌｏｎａｓｅ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含む１ ０μ ｌの反応容積中で、２ ５℃で一晩 CDNA混合物を2μ gのプロテイナーゼK(Invitrogen)で37℃で10分間処理し、反応をクエンチし、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、2μ gの酵母tRNAを担体としたエタノール沈殿を行った。 沈殿したｃＤＮＡを１ ０μ ｌの水に溶解し、１μ ｌの混合物をＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ（商標）Ｄ Ｈ１ ０Ｂ（商標）ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換のために使用した。 得られたｃＤＮＡライブラリーを滴定した後、ｃＤＮＡプラスミドを、前述のようにアルカリドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）法により約１ ０ ０万コロニーから回収した（４，１ ９）。 得られたｃｄｎａクローンはａｔｔｌ部位を担持するプラスミドの形態であった。 いくつかの用途では、ＡＴＴＢ部位を有するプラスミドが必要とされるので、これらのプラスミドを、前述の（１ ６）のようにＡＴＴＢ部位を有するプラスミドに変換した。 このｃＤＮＡライブラリーをＭＢ−ＡＬ（ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）と命名した。MB-ALについて説明したのと同様に、非増幅RNA（100μ gのマウス脳トータルRNA）からcDNAライブラリーを構築し、MB-CL（マウス脳従来構築ライブラリー）と命名しました。

増幅されたcrnaに対するサイズバイアス効果の検査

crnaに対するサイズバイアス効果を調べるために、T7RNAポリメラーゼによって転写された第一ラウンドcrnaとSP6RNAポリメラーゼによって転写された第二ラウンドcrnaを1.0％アガロースゲル（各1μ g）上で実行し、ナイロン膜（Biodyne（登録商標）Bナイロン膜;PALL、East Hills、NY、USA）上でブロットした。 それらを、それぞれ、３ ２Ｐ標識ＳＰ６ｕｐプライマー（表１）およびＮｏｔ−（ｄ Ｔ）１ ８（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。 各プローブの１ ０ピコモルをＡＴＰ（約３ ０ ０ ０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。; Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｋｙｏｔｏ Ｊａｐａｎ）を用いた。 ４ ５℃のＧＭＣ緩衝液（２ ０）中で一晩ハイブリダイゼーションした後、これらの膜を、１×標準クエン酸塩（ＳＳＣ）／１％ＳＤＳ溶液中で室温で３回広範囲に洗浄した。 ハイブリダイズされたシグナルの分析は、bas2000Image Analyzer(Fuji Photo Film,Tokyo,Japan)

cDNAライブラリーの評価

ゲル電気泳動上で行った。

ゲル電気泳動。

ゲル電気泳動。

ゲル電気泳動。 CDNA挿入サイズの分布は、テンプレートとしてNotI消化MB-ALとMB-CLプラスミドcdnaを使用してT7RNAポリメラーゼによって合成されたcrnaの電気泳動によって調 Ｒｎｅａｓｙミニキットを使用して精製した後、ｃＲＮＡを、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＲＮＡマーカー（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を有するホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で電気泳動した。 ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でゲルを染色した後、蛍光染色強度を、Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ５ ９ ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＩｍａｇｅｑｕａｎｔ（登録商標）（バージョン５.０）ソフトウェアを使用して分析した。

ランダムシングルパスシーケンシング解析。 CDNAクローンの3’末端配列は、DNA配列決定によって調べた。 無作為に選択した７ ６ ８クローンからのプラスミドＤＮＡを、ＭＦＸ−９ ６ ０ ０Ｍａｇｎｉａ（登録商標）（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて精製し、ＲＩＳＡ３ ８ ４−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）によって分析した（１ ６）。 １（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてベクター配列をトリミングした後、得られた２ ０ ０ヌクレオチド残基を超えるｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）データベースおよび自社マウスデータベースに CDNAクローンの3’末端の整合性の検査は、正準ポリアデニル化シグナル六量体（5′-AATAAA-3’）またはその単一塩基変異体（11シグナル六量体）がcdnaのポリ（a）尾から上流50ヌクレオチド残基内に発見されたかどうかの分析によって行われた（21）。

cDNAマイクロアレイ。 マイクロアレイ分析は、MB-ALとMB-CLライブラリ内のcDNA集団を比較するために行われました。 3534プローブを備えた自家製cDNAナイロンマイクロアレイを調製し、放射性同位体検出を行った（22）。 簡単に説明すると、我々の研究所で単離され、完全配列または末端配列が既に知られていたｃＤＮＡプラスミドを、Ｇｅｎｅｔａｃ（商標）ＲＡ１（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を使用してＢｉｏｄｙｎｅ ｂ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ上で発見し、次いで、製造者の指示に従って固定した。 このマイクロアレイ上に固定化されたcdnaのリストは、著者らからの要求に応じて入手可能である。 ＭＢ−Ａ ｌおよびＭＢ−ＣＬ標的ｃ ＤＮＡを、上記のような挿入サイズ分析に使用した１μ ｇのｃＲＮＡ試料のそれぞれからの逆転写を用いて調製した。 これらの標的を合成し、１μ ｇの各ｃＲＮＡ、１ ０ ０ｎｇのランダム六量体、１×第１鎖緩衝液、１ ０ｍ ＭのＤＴＴ、各８ ０ ０μ ＭのＤＡＴＰ、ＤＴＴＰ、およびＤＧＴＰ、８ ０ ０ｎＭのｄＣＴＰ、５μ ＬのｄＣＴＰ（＜ｄｉｖ ｉｄ＝”１ｆ０ ６ ７ ６ ８ ８ｆｂ”＞＜／ｄｉｖ＞２ ５ ０ ０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および１ ０ ０Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｉ Ｉ Ｒｎａｓｅ Ｈ−アルカリ溶解および中和の後、標識したｃｄｎａをｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、計数した。 ５μ ｇのマウスＣｏｔ−１ＤＮＡ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、２ ５ ０μ ｌのＰｅｒｆｅｃｔｈｙｂ（商標）緩衝液（Ｔｏｙｏｂｏ）中で、６ ８℃で一晩、ｃＤＮＡナイロンマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを行った。 ６ ８℃で２×ｓｓｃ／１％ＳＤＳ（それぞれ１ ５分間の２回の洗浄）、次いで、０.１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ（それぞれ３ ０分間の２回の洗浄）で厳格に洗浄した後、ハイブリダイゼーション信号を検出し、ＦＬＡ−８ ０ ０ ０（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ）で分析した。 背景対照のものよりも強いシグナルを示すｃｄｎａスポットを選択し，さらなる分析を行った。 大域的正規化を行った後，ＭＢ-Ａ ｌおよびＭＢ-ＣＬ標的に由来するｃｄｎａスポットのシグナル強度の散布図を得た。

RNAブロットハイブリダイゼーション。 サイズバイアス効果を調べるためにＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを行った。 ＭＢ−Ａ ｌおよびＭＢ−ＣＬのｃＲＮＡ（それぞれ１.５μ ｇ、上記のように合成）をホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で電気泳動し、Ｂｉｏｄｙｎｅ ｂナイロン膜に移した。 ＰＣＲ増幅を用いてプローブｃＤＮＡを調製した。 プライマーはGenBankのデータベースか私達の社内データベースで登録されている順序に基づいて設計されていた; 鋳型は、我々が単離したｃＤＮＡプラスミドであった。 リボソームS6タンパク質のプローブは長さ724bpであり、5′-CGCTCGGCTGTGTCAAGATG-3’および5′-GAGGACAGCCTACGTCTCTTGG-3’プライマーで増幅され、熱ショックタンパク質（hsp）のプローブは長さ70、940bpで、5′-GATGGACAAGGCGCAGATCC-3’および5′-CTCGATGGTGGGTCCTGAGC-3’プライマーで増幅された。 これらのプローブを、Ｒａｄｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｄＣＴＰ（約３ ０ ０ ０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。 １×ＳＳＣ／１％ＳＤＳで、室温で５分間および１ ５分間、次いで６ ５℃で３ ０分間連続的に洗浄した。 ハイブリダイゼーション信号は、BAS2000画像アナライザで検出されました。

結果と考察

本研究で開発したcDNAライブラリー構築法を図1に示します（新たに導入されたステップは星で強調表示されています）。 この方法は，ｃｒｎａ増幅ステップ，ｃＤＮＡへのｃＲＮＡの変換，およびプラスミドへの組換えクローニングの２ラウンドからなる。 この方法の重要なステップは、sp6プロモーター配列でcDNA末端をタグ付けするためのアダプター連結である。 この形式でcdnaを合成することができれば、SP6プロモーター配列を3’末端に含む最初のラウンドのcrnaを特異的に逆転写することが可能になる。 得られた二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて第２ラウンドｃＲＮＡを合成する。 ２ラウンドのＲＮＡポリメラーゼ支援増幅の後、得られたｃＲＮＡは、ＡＴＴＢ２−Ｎｏｔ−（ｄ Ｔ）１ ８プライマーを用いた逆転写によって二本鎖ｃＤＮＡに変換される。 逆転写におけるattb2-Not-(dT)18プライマーの使用は、配列5′-(A)18GCGGCCGC-3’をそれらの3’末端に運ぶcrnaのみを変換することを可能にする。 これらの修飾は、増幅と正しくタグ付けされた末端を持っているcdnaのクローニングを許可する必要がありますので、我々は、この方法は、RNAポリメラーゼ支援

本方法の有効性を試験するために、マウス脳からの非増幅総RNA（100μ g）を用いた従来の方法（16）およびマウス脳からの総RNAの1μ gを用い 表２は、各工程で得られたｃＤＮＡおよびｃＲＮＡの量を要約し、ＭＢ−ＡＬ構築の３つの独立した実験実行の平均として計算した。 我々は、最終的な出力として6.4×107独立したcDNAクローンの平均を得た。 CDNAクローンのこの数は、増幅プロトコルを使用して生成された36ngのcDNAの合計に由来するので、我々は、この方法は、約1.2×1011のcDNAクローンを1μ gの総RNAか

表2. 各ステップで合成されたcRNAおよびcDNAの量

増幅ステップ中のサイズバイアス効果を実験的に調べるために、我々は次のRNAブロットハイブリダイゼーション分析によって第一ラウンドと第二ラウンドcRNAのサイズ分布を比較した。 これらのオリゴヌクレオチドプローブは正しく最後に転写された唯一のcrnaを検出するため、これらの実験では、第一ラウンドと第二ラウンドcrnaは、そ 図2に示すように、第二ラウンドのcrnaのハイブリダイゼーションシグナルのピーク時のRNAサイズは、第一ラウンドのcRNAのそれとほぼ同じであるが、より小さ 我々は、crnaの切り捨ては、おそらくSP6アッププライマーと第二ラウンドcDNA合成中に行われたと思われる。