要約
化粧品中のクロラムフェニコール（CAP）を監視するための直接かつ高度に特異的な化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ（CL-ELISA）法が開発されている。 直接免疫測定のためにこの研究で採用された抗クロラムフェニコール抗体（mAb）は、構造的に関連するチアムフェニコール（TAP）とフロルフェニコール（FF）を含むほと IC10によって測定された検出限界（LOD）は、0.0021ng mL−1であった。 検出範囲（IC20−IC80）は0.00979から0.12026ng mL-1の範囲であった。 スパイクされた化粧品サンプルでは、平均回収率は82.7％から99.6％の範囲であり、日中および日間の変動はそれぞれ9.8および8.2％未満であった。 さらに，ＨＲＰ標識抗ＣＡＰＭＡＢの助けを借りて，この方法を高速直接免疫反応モードで処理することができた。 このCL ELISA方法は帽子の汚染の精密な品質管理を促進する化粧品の帽子の特定、急速な、semiquantitative、および量的な検出に適用できます。
1. はじめに
クロラムフェニコール（CAP）は、抗菌剤のアンフェニコールファミリーのメンバーであり、ベネズエラの連鎖球菌によって産生された（図1に示す構造）。 クロラムフェニコールは通常有効な抗菌活動の広スペクトルの抗生物質として行われます。 それは嫌気性の有機体を含むグラム陽性およびグラム陰性の細菌の広がりの変化に対して通常、ある場合もあります。 高い活動、chloramphenicolが原因で細菌感染の防止そして処置のための家畜、水産養殖および化粧品工業で広く加えられます。 最近の出版物では、chloramphenicolはepifolliculitis、アクネおよび他の皮膚の状態の処置に使用するために報告されました。 クロラムフェニコールはまた防腐剤として化粧品で微生物の成長を禁じるために広く採用されました。
CAP、TAP、FFの化学構造。しかし、最近の調査では、アンフェニコール抗生物質がヒトの健康に潜在的な悪影響を示すことが示された。 従って、クロラムフェニコールの適用はEUのメンバー、米国および中国を含む多くの国で、禁止されます。 これらの抗生物質のための公式の規則があるが、chloramphenicolは安価および優秀な抗菌性の効果による化粧品にまだ不法に加えられます。 化粧品の安全を保障し、人間の健康を保つためには、化粧品のサンプルのたどるレベルでchloramphenicolの検出のための敏感で、信頼できる、利用できる方法を開発す
CAPおよび関連する抗生物質の検出には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）など、多数の分析法が報告されていた。 しかし，これらの方法は主に高価な機器，複雑な前処理手順，およびよく訓練されたスタッフを必要とし，多数の試料を迅速にスクリーニングするのには適していなかった。 主に抗体抗原特異的認識に基づくイムノアッセイは、高スループットと標的分析物の迅速なスクリーニングのために採用された。 高感度特性を有する化学ルミネセンス基質は、直接化学ルミネセンス酵素結合免疫吸着アッセイ（CL-ELISA）プラットフォームに採用することができます。 慣習的な比色の議定書と比較されて、免疫学的検定の感受性は基質として化学発光との少なくとも2~3回によって改善できます。
CAPのイムノアッセイ検出に関する以前の文献は、チアムフェニコール（TAP）およびフロルフェニコール（FF）を含むアンフェニコールファミリーの類似体（図1）とCAPを区別することはできない。 これらの研究では、汚染キャップ、その類似体、またはそれらの合計が肯定的な結果であるかどうかを判断することは困難である。 本研究では、我々は、テストされたほとんどの類似体のためのキャップ特異性と無視できるCR値に結合することができ、高特異的な抗CAPモノクローナル抗体（mAb） この非常にmAbに基づいて、非常に特定および直接CL ELISA方法は化粧品の帽子の微量の決定のために開発されました。 この開発されたプロトコルは、HRP標識二次抗体との複雑な間接抱合反応を必要としない。 化学発光基板では、感度を大幅に向上させることができました（図2に示す模式図）。 ＨＲＰ標識抗ＣＡＰＭＡＢを使用して，複雑な免疫反応手順なしに高速直接免疫反応モードでアッセイを行った。 このＣＬ-ＥＬＩＳＡ法は，化粧品中のＣＡＰの特異的，迅速，半定量的，定量的検出に適用することができ，ＣＡＰの品質管理と規制に寄与する。
CL-ELISA法の回路図。
2. 材料および方法
2.1. Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ＜／ｈ５＞＜ｐ＞クロラムフェニコール（ＣＡＰ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、フロルフェニコール、（ＦＦ）、ペニシリン（ＰＥＮ）、ラクトパミン（ＲＡＣ）、サルブタモール（ＳＡＬ）、スルファジアジン（ＳＵＬ）、及びチアムフェニコール（ＴＡＰ）標準を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（９ ９％ｐｕｒｉｔｙ，Ｓｔ． ＣＡＰ結合抗原およびＨＲＰ標識ＣＡＰ抗体は、Ｚｅｙａｎｇ Ｃ Ｏから得た。 （北京、中国）。 Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（ＵＳＡ）から購入した。 Ｍｉｌｌｉ−Ｑ合成系は、水精製のためにＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍ Ａ，ＵＳＡ）から得た。 他の試薬（分析グレード）は、Beijing Reagent Corp.（Beijing,China）から購入した。
2.2. 装置および器械使用
Costarの白い不透明な96井戸のポリスチレンのmicrotiterの版（Costar Inc. Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用した。 Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃ Ａ、ＵＳＡ）から入手した。 ＭＩＫＲＯ２ ２Ｒ遠心分離機は、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｌａｂｏｒａｐｐａｒａｔｅ（Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。2.3.
緩衝および解決
この開発されたCL-ELISAの試金のために、異なった緩衝および解決は免疫学的検定のために準備されました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.01M、pH7.4）：8.0gのNaCl、2.9gのNa2Hpo4、0.2gのKH2PO4、および0.2gのKClを1Lの脱イオン水に溶解した。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.01M、pH7.4）：8.0gのNaCl、2.9gのNa2Hpo4、0.2gブロッキング緩衝液（pH7.4）：0.01M PBS中の0.5％カゼイン。
コーティング緩衝液（pH9.6）：1.59gのNa2Co3および2.93gのNahco3を1Lの脱イオン水に溶解した。
酵素希釈緩衝液（pH7.4）: 5%0.01M PBSの胎児の牛のような血清。洗浄緩衝液（PBST）：0.01M PBS中の0.01％Tween-20。2.4.
競争化学発光ELISA（CL-ELISA）手順
Costar白色不透明な96ウェルポリスチレンmicrotiterプレートは、免疫測定反応のために採用されました。 100μ lのキャップ結合抗原を、0.00042ng mL−1の最終濃度でコーティング緩衝液に溶解し、これを加え、コーティングのために4℃で20時間インキュベートした。 洗浄緩衝液で三回洗浄した後、ブロッキング緩衝液（ウェルあたり150μ l）を各ウェルに加え、37℃で1.5時間余分な活性部位を占有するようにインキュベー
キャップ分析のために、コーティングされたマイクロタイタープレートを室温で30分間事前調整した。 次いで、処理された試料またはＣＡＰ標準試料３ ０μ ｌおよび酵素希釈緩衝液で希釈されたＨＲＰ標識抗ＣＡＰ抗体（２.４ ６ｎｇｍｌ-１）７ ０μ ｌを各ウェルに順番に添加した。 プレートは、直接競合反応のために37℃で30分間インキュベートした。 プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した後、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ化学発光基質溶液（１ ０ ０μ ｌ／ウェル）を添加し、各ウェルの化学発光強度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒで測定した。2.5.
標準曲線
十の異なる濃度レベルは、検量線の評価のために試験しました。 最高濃度は1000ng mL−1であり、以下の濃度は前の濃度の三分の一によって連続的に希釈された。 各濃度を、ＣＬ−ＥＬＩＳＡプロトコルに従って３回実施した。
B/B0は、結果の化学ルミネセンス比に対して定義されます。
B0は、結果の化学ルミネセンス比に対して定義されます。 ここで、Ｂは、異なるＣＡＰ標準濃度の化学発光強度を表し、Ｂ０は、各試験において、ＣＡＰ標準なしの化学発光強度を表す。標準曲線は、異なるCAP標準濃度でB/B0をプロットし、Origin（バージョン7.5、OriginLab、Northampton、MA、USA）を使用して、以下の4パラメータのロジスティック方程式にデータをフィッ Bは変曲点での曲線の傾きです。 最大吸光度の５ ０％を表すｃは、変曲点におけるＸ値である。 そしてDは下側の漸近線（背景信号）です。2.6.
2.6. CL-ELISA分析のためのサンプル調製
化粧品サンプル（2.00g±0.02g）を正確に秤量し、50mLのポリプロピレン遠心分離機管に移した。 次いで、20mLのPBSを加え、30秒間ボルテックスし、次いで、CAPの抽出のために3分間超音波処理した。 各試料を12000gで4℃で10分間遠心分離し、上清を回収し、0.22μ m膜を通して濾過した。 各サンプルの上清の三十マイクロリットルアリコートは、開発されたCL-ELISA手順に従って分析のためにコーティングされた96ウェルプレートに添加されました。2.7.
2.7. 精度と精度
ネガプライマーローション化粧品サンプルは、以前にUPLC-MS/MS分析によって確認されました。 次いで、各試料を、５、２ ０、および１ ０ ０ｎｇのＬ−１の３つの異なる濃度でＣＡＰ標準液でスパイクした。 分析は、開発されたCL-ELISAプロトコルに従って処理され、それぞれ五つの複製（n=5）があった。 試料の濃度を検量線に従って計算し，すべての試料の回収率に基づいて精度と精度を評価した。
3. 結果と議論
3.1. アッセイ特異性
方法の特異性は、CIP、FF、PEN、RAC、SAL、SUL、およびTAPの構造的に関連する化合物との交差反応性（CR）の程度を評価することによって評価した。 ＣＲ値は以下の式で評価した。:この式において、ＩＣ５ ０は、物質の半分の最大阻害濃度である。 抗ＣＡＰ ｍａｂの特異性結果を表１に示した。 結果から、無視できるCR値（0.01％未満）は、ほとんどの構造に関連するTAPとFFを含む本研究で調査したすべての類似体について得られた。 この開発したＣＬ-ＥＬＩＳＡアッセイは特異的ＣＡＰ検出に適用できると結論した。
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3.2. CL-ELISA手順の最適化
競合反応系における抗原対抗体比は、免疫反応に有意に影響する。 このＣＬ−ＥＬＩＳＡプロトコルでは、抗原対抗体比を評価し、最適化した。 の抗原対抗体比70:30, 60:40, 50:50, 40:60, そして30:70は調査されました。 結果を、ＩＣ５ ０およびＲｌｕｍａｘ（最大相対光単位）に従って最適化し、表２に示した。 IC50値は、抗体比の増加とともに有意に増加した。 抗原対抗体比が70:30であった場合、最も低いIC50値を有する最も感受性の高い結果が得られた。 さらに、高い割合の抗体は、高いＲｌｕｍａｘ値をもたらした。 しかし、試験した抗原対抗体比については、すべてのＲＬＵ値がＣＡＰの検出に適していた。 化学発光基質の高感度のために，Ｒｌｕｍａｘ値の明らかな差はなかった。 In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.
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2抗原抗体比の最適化。3.3.3. 感度
IC50、LOD（IC10によって測定）、および検出範囲（IC20−IC80）は、提案されたCL-ELISAプロトコルの感度を評価するためにシグモイド検量線から得られた（図3）。 この研究では、LODは0.0021ng mL−1であり、IC50値はCAPの0.016ng mL−1であった。 この方法の検出範囲は0.00979−0.12026ng mL−1であった。 確立されたイムノアッセイと比較して，この方法はＣＡＰに対して高い感度と低いＬＯＤを示した。
最適化された条件下でCL-ELISAから生成されたキャップの標準曲線。3.4.3.3.3.3.4. 正確さおよび精密
正確さおよび精密調査のために、強化されたサンプルの帽子の回復は最初に計算されました。 そして、精度と精度は、三つの検証日にそれぞれ五つの反復で評価されました。 5、20、および100ng L−1の三つの強化されたレベルでは、スパイクされたプライマーローション化粧品サンプルにおけるキャップの平均回収率は82.7％から99.6％の範囲であった。 日中および日間変動は、それぞれ9.8％および8.2％未満であった（結果は表3に示された）。
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4. 結論
本研究では、化粧品中のキャップ検出のための新規で高感度なCL-ELISA法を開発しました。 アッセイで利用されたｍａｂは、特にほとんどの構造関連ＴＡＰおよびＦＦについて、その類似体に対して無視できるＣＲ値を有するＣＡＰに対する高い特異性を示した。 この非常にｍａｂに基づいて、提案されたＣＬ-ＥＬＩＳＡ法は、ＣＡＰおよび他の類似体の混合物の代わりに、特異的にＣＡＰの検出に適用することができる。 これは化粧品の帽子の決定のためのCL-ELISAの最初のレポートである。 方法LODは0.0021ng mL−1であり、IC50は0.016ng mL−1であり、検出範囲は0.00979−0.12026ng mL−1であった。 スパイクされた化粧品サンプルでは、平均回収率は82.7％から99.6％の範囲であり、日中および日間の変動はそれぞれ9.8％および8.2％未満であった。 試金は高い特定性、簡易性、速い分析の時間および費用効果の利点がある。 その感度および特異性に関して、開発されたCL-ELISA法は、CAP検出のためのほとんどの報告された免疫測定法よりも優れている。 この開発したＣＬ-ＥＬＩＳＡ法は，化粧品中のＣＡＰの特異的，迅速，半定量的，定量的検出に適用できると結論した。
データの可用性
この研究の調査結果をサポートするために使用されるデータは、要求に応じて対応する著者から入手可能です。
利益相反
著者らは、この論文の出版に関する利益相反はないと宣言しています。
謝辞
私たちはLetPubに感謝したいと思います(www.letpub.com）この原稿の準備中に言語的支援を提供するため。 この作業は、中国の国家R&Dキープログラム（no.2017YFE0110800）、中国の国家自然科学財団（no.31871718）、およびEU Horizon2020Research and Innovation action（no.727864-EU-China-Safe）による支援でした。
