全身アゴニスト癌免疫療法は、リンパ系および末梢器官におけるCD4およびCD8tリンパ球の差動拡大を誘導する
抗CD40とIL-2との組み合わせは、いくつかのマウス腫瘍モデルにわたって遅延増殖および退行を誘導することが示されている。 細胞株腫瘍モデルを使用して公開されたデータと同様に、抗CD40およびIL-2免疫療法（IT）による乳房上皮内腫瘍成長（MIN-O）モデル、組織移植ラインの治療は、有意な抗腫瘍応答（P=0.0057）につながった>治療されたマウスの50％（追加ファイル1：図S1A）の回帰を含む（追加ファイル1：図S1A）。 これまでの研究では、これらの抗腫瘍応答がCD8T細胞に起因することが示されているため、脾臓および腫瘍および肺（多くの異なる腫瘍モデルの共通の転移部位）内のT細胞表現型を評価した。 我々は、治療が一般的にすべての臓器にわたってCD8拡張を誘導したことを指摘したが、我々は、臓器部位にわたってCD8T細胞記憶表現型のいくつかの
我々と他の人は、以前に癌のための強力な免疫刺激療法は、脾臓およびリンパ節における記憶（Cd44High）CD4およびCD8T細胞の強力な増殖を誘導するこ また、cd4ではなく、CD8、T細胞もインターフェロン（IFN）-γ依存的な方法で活性化誘導細胞死を受けることが観察されたベースラインと比較して、これらの同 これらのデータは、リンパ器官の読み出しを用いて生成された。 しかし、MIN-Oベアリングで観察された表現型に照らして、免疫療法処理マウス、拡張、活性化、および活性化されたT細胞のアポトーシスは、末梢組織に差 したがって、我々はさらに特徴づけ、末梢器官（原発腫瘍および/または転移病変が存在する可能性があります）と二次リンパ器官（多くの場合、作用機序を評価 我々は、cd8とCD4T細胞（Foxp3Neg）の頻度、拡張、およびリンパ系および末梢器官の両方で全身アポトーシスを評価した。 我々のグループによる以前の報告と一致しているが、全体的な頻度は大きく変化していない（図。 図１Ａ）、抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法は、脾臓およびリンパ節におけるＣＤ８Ｔ細胞の総数の有意な拡大をもたらした（図１Ａ）。 1b）。 総CD8数の増加に沿って、in vivoでブロモデオキシウリジン（BrdU）を組み込んだCD8T細胞の頻度が有意に拡大され、細胞外アネキシンV発現によって評価されたアポトーシス細胞の割合は、対照と有意に異ならなかった（図C-D）。 対照的に、総ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は減少し、数は、同じ器官内の対照と比較して有意に変化しなかった（図１ ０Ａ）。 1a-b）。 ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｂｒｄｕ取り込みによって評価されたように拡大していたが、それらのかなりの割合は、同様にアポトーシスを通過していた（図１ ０Ａ）。 1c-d)合計数の純些細な変更に終って。 これらのデータは、以前に観察されたものと一致していた。 肺および肝臓を含む非リンパ系器官を評価したところ、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方において同様の傾向、すなわち、ＣＤ８Ｔ細胞がそれに続くすべての ＣＤ４Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３Ｎｅｇ）は、同様の程度まで拡大し、同時にアポトーシスを通過していたが、その頻度および数の両方にわずかな変化をもたらした（図２Ａ〜ｂ）。 2c-d)周辺にある。
CD4およびCD8T細胞は、リンパ器官における免疫刺激療法に対する分化増殖性およびアポトーシス応答を有する。 マウスを抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法で処置し、リンパ系（脾臓またはＬＮ）器官における処置の１ ２日目に様々な免疫パラメータについて評価した。 リンパ器官におけるＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）およびＣＤ８Ｔ細胞の割合（ａ）および総数（ｂ）。 リンパ器官におけるＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）およびＣＤ８ｔ細胞の増殖（ｃ）（Ｂｒｄｕによって評価される場合）およびアポトーシス（ｄ）（表面アネキシンＶ発現によって評価される これらのデータは、グループごとに2-5のマウスを用いた3つの独立した実験の代表である。 データは平均±ＳＥＭとして提示する。 Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
CD4 and CD8 T cells have differential proliferative and apoptotic responses to immunostimulatory therapies in peripheral organs. マウスを抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法で処置し、末梢（肺または肝臓）器官における処置の１ ２日目に様々な免疫パラメータについて評価した。 末梢器官におけるＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）およびＣＤ８Ｔ細胞の割合（ａ）および総数（ｂ）。 末梢器官におけるＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）およびＣＤ８ｔ細胞の増殖（ｃ）（Ｂｒｄｕによって評価される場合）およびアポトーシス（ｄ）（表面アネキシンＶ発現によって評価される場 これらのデータは、グループごとに2-3マウスを用いた3つの独立した実験の代表である。 データは平均±ＳＥＭとして提示する。 Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
t細胞記憶表現型は、cd8T細胞における二次リンパ器官と末梢非リンパ組織の間で変化するが、それに続くCD4t細胞ではない
マウスでは、CD4およびCD8t細胞は、CD62L（L-セレクチン）およびcd44発現に基づいて記憶表現型およびナイーブ表現型にさらに分類することができる。ｃｄ４ ４ＬＯＷＣＤ６ ２Ｌ＋集団はナイーブ（ｔ Ｎ）と考えられ、ｃｄ４ ４ｈｉｇｈｃｄ６ ２Ｌ＋集団は中央記憶（ＴＣＭ）と考えられ、ＣＤ４ ４ｈｉｇｈｃｄ６ ２ｌｎｅｇ集団はエフェクターおよび／またはエフェクター記憶（ｔ ｅ／ｅ Ｍ）と CD4およびCD8T細胞は、リンパ系および末梢器官におけるこれらのサブセットの分布が異なることが知られている。 Cd4とCD8集団内のナイーブ周波数は比較的類似したままであるが、Cd44High集団は、安静時の生物におけるCD8T細胞とcd4T細胞で歪んエフェクターメモリで歪んだより中心的なメモリです。 しかし、末梢器官では、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブセットの両方内の組織常駐Ｔ細胞は、主にエフェクター記憶表現型である。
以前の研究では、記憶表現型細胞（Cd44High）が刺激免疫療法後に拡大する主な細胞型であることが示されている。 様々な器官にわたるCD4およびCD8T細胞の組成をよりよく理解するために、我々はそれに続く各器官におけるそれらの記憶表現型状態を評価した。 安静時、リンパ器官におけるＣＤ８Ｔ細胞のＣｄ４ ４高集団は、主にＴＣＭであった（＜ｄｉｖ ｉｄ＝「ｅ８ｅ６ ４ １ ０ ３ ３ ３」＞＜／ｄｉｖ＞９ ０％）のに対し、末梢器官では、約６ ０％のＴＣＭとの組み合わせであった（ 3a、c、e、-f）。 一般に、それはすべての器官を渡るCd44Highの頻度の全面的な拡張で起因します。 ＴＣＭ頻度は変化しなかったか、またはわずかに増加したが、ＴＥ／ＥＭ集団は有意に拡大した（図１ ０Ａ）。 3e-f）リンパ系器官では-10％から30％、末梢器官では-30-85％である。
t細胞記憶表現型は、免疫療法後のリンパ系および末梢器官において異なる。 マウスを抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法で処置し、リンパ系（脾臓またはＬＮ）または末梢（肺または肝臓）器官における処置の１ ２日目に様々な免疫パラメータを評価した。 対照およびＩＴ処理マウスにおけるＣＤ８（ａ）およびＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖ ｅ）（Ｂ）Ｔ細胞におけるＣＤ４ ４対ＣＤ６ ２Ｌ発現のａ−ｂ代表的ドットプロット。 ｃ−ｄ円グラフは、ＣＤ８（ｃ）Ｔ細胞およびＣＤ４（ｄ）Ｔ細胞におけるＣｄ４ ４Ｈｉｇｈサブ集団における中心記憶（白）対エフェクター／エフェクター記憶（黒）の頻度を示す；Ｃｄ４ ４Ｈｉｇｈの頻度 （ｅ−ｆ）対照または抗ＣＤ４ ０／ＩＬ２処置マウス由来の種々の器官におけるエフェクター／エフェクター記憶（Ｅ）および中枢記憶（Ｆ）ＣＤ８（左パネル）およびＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）（右パネル） これらのデータは、グループごとに4-5のマウスを用いた3つの独立した実験の代表である。 データは、平均±SEMとして提示される
cd44高CD4T細胞集団内では、休止マウスは、リンパ系で約60〜70％、末梢組織で75〜95％のTE/EM表現型に向かってより大きく歪んでいた(図1)。 3b、d）。 CD8T細胞で発生したように、それに続いてCd44の高い割合が拡大したが、休止マウスのすべての器官にわたってTE/EM表現型に非常に大きく歪んでいたという事実のために、CD4TE/EMの頻度は、IT処理マウスのすべての器官にわたってほぼ一致していた（図10B）。 3e）。 ＴＣＭ ＣＤ４頻度は、それ以前およびそれ以降の両方において、全ての器官にわたって比較的低く、一貫したままであった（図１ ０Ａ）。 3階）。
CD4およびCD8T細胞における活性化マーカーの発現は、位置とメモリ表現型に依存しています
増殖とアポトーシスの違いに加えて、我々はまた、日常的にCD4およびCD8t細胞が差別的に活性化とそれに続く阻害分子をアップレギュレートすることに気づいています。 これの最も注目すべき例は、二次リンパ器官（脾臓およびLN）に焦点を当てた研究に基づいて、CD4ではなくCD8T細胞で優先的にアップレギュレートされ、cd4ではなくCD8t細胞で発生した優先的AICDプロセスに関与している可能性が高いと考えられているPD-1である。 別の例は、ＣＤ８ｔ細胞上のＮＫ Ｇ２Ｄの優先的な上方制御であるが、記憶ＣＤ８サブセットへの強力なサイトカイン曝露後の傍観者誘導溶解能力を付与するＣＤ４ではないであろう。 私たちの研究室による以前の研究だけでなく、図に示すデータ。 図３は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方の中で、積極的に増殖し、それに応答する初代細胞が、Ｃｄ４ ４高記憶表現型細胞であることを示している。 したがって、私たちは次にこの人口に焦点を当てました。
Cd44High集団では、増殖するCD8T細胞は、CD25やPD-1などの抗原特異的刺激による活性化と一致するマーカーをアップレギュレートすることが示されているが、バイスタンダー表現型、すなわちNKG2Dを獲得することを可能にするマーカーをアップレギュレートすることが示されている。 逆に、Ｃｄ４ ４Ｈｉｇｈ増殖（Ｆｏｘｐ３Ｎｅｇ）ＣＤ４Ｔ細胞は、ＰＤ−１を不釣り合いに上方調節する（ＣＤ８Ｔ細胞およびｆｏｘｐ３＋、調節性ＣＤ４Ｔ細胞とは対照的に）ことが示唆されている。 これらの以前の報告と一致して、本発明者らは、脾臓およびリンパ節居住者、それ処理されたＣｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ８＋Ｔ細胞の間で同様の表現型を観察し、これはＮＫ Ｇ２Ｄを有意にアップレギュレートしたが、ＰＤ−１はアップレギュレートしなかった（図１ ０Ａ）。 ＣＤ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ４＋ｔ細胞は、ＰＤ−１を頑健に上方制御したが、ＮＫ Ｇ２Ｄは制御しなかった（図４Ａ、ｃ）。 4b、d）。 我々は、末梢、非リンパ器官に常駐しているT細胞集団における同じ表現型マーカーを評価したとき、Cd44Highcd8+T細胞表現型は、二次リンパ器官に常駐している 肺および肝臓に存在するＣｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ８＋Ｔ細胞は依然としてＮＫ Ｇ２Ｄ＋Ｃｄ２ ５Ｎｅｇであったが（図２Ｂ）、肺および肝臓に存在するＣｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ８＋Ｔ細胞はまだＮＫ Ｇ２Ｄ＋ この集団におけるＮＫ Ｇ２Ｄ＋細胞の頻度は、リンパ系器官の２ ０〜３ ０％から末梢器官の４ ０〜５ ０％に増加するように見えた（図４Ａ、ｃ）。 4a）。 さらに、ＰＤ−１発現が変化しなかったリンパ器官とは対照的に、Ｐｄ−１発現は、Ｃｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ８＋集団においてそれに続いて肺および肝臓の両方で有意に増加した（図 4c）。 逆に、Ｃｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ４Ｔ細胞表現型は、全ての器官にわたって脾臓およびリンパ節ＣＤ４ｔ細胞に顕著に類似していた（図１ ０Ａ）。 ＣＤ２ ５は、いずれの部位においてもＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞においてもアップレギュレートされなかった（データは示さない）。 我々は以前にPD-1の差動発現は、おそらく強い、免疫刺激ITレジメン以下のCD4とCD8T細胞間のアポトーシスの差動誘導の基礎となるメカニズムであ しかし、末梢器官では、ＣＤ４Ｔ細胞は、ＰＤ−１発現がＣＤ４ｔ細胞とＣＤ８ｔ細胞との間で同等であるという事実にもかかわらず、アポトーシスによって不釣り合いに影響され続けている。 出現したこのパターンは、末梢における活性化マーカー発現の増加は、特にPD-1の場合には、TE/EM優勢と直接相関するように見えたので、また興味深いもので
位置に依存するCD8T細胞における活性化および阻害マーカーの差動発現。 マウスを抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法で処置し、リンパ系（脾臓またはＬＮ）または末梢（肺または肝臓）器官における処置の１ ２日目に様々な免疫パラメータを評価した。 様々な器官にわたるＣＤ８（ａ、ｃ）およびＣＤ４（Ｆｏｘｐ３−ｖｅ）（ｂ、ｄ）Ｔ細胞のｎｋ Ｇ２Ｄ＋（Ａ−ｂ）およびＰＤ−１＋（ｃ−ｄ）の割合。 与えられた治療条件/器官の下での各器官のCD8EM/CMを描いた円グラフ。 これらのデータは、グループごとに2-4のマウスを用いた3つの独立した実験の代表である。 データは平均±ＳＥＭとして提示する。 統計量は、Bonferroniの事後検定*P<0を使用してANOVAを使用して導出しました。05,**P<0.01,***P<0.001
最近、循環するTE/EM細胞は、安静時のヒトにおいてPD-1のレベルが上昇していることが示されている。 したがって、我々はCD8+TE/EM細胞が優先的にそれに続く二次リンパ系および末梢器官における活性化マーカーを発現するCd44Highcd8+T細胞の差動頻度で、その結果、CD8+TCM上でこれらの活性化マーカーを発現する可能性があることを仮定した。 したがって、我々は、安静時およびIT処理マウスのすべての臓器にわたってCD8+Cd44Highcd25Neg TE/EMおよびTCM細胞上のNKG2DおよびPD-1発現を評価した。 対照マウスでは、両方のＮＫＧ２Ｄ（図１ ０Ｂ）が挙げられる。 およびＰＤ−１（図５Ａ）およびＰＤ−１（図５Ｂ）。 図５Ｃ）は、ＣＤ８＋Ｃｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ２ ５−集団のｔｅ／ＥＭサブセット上でより高い頻度で発現された。 しかしながら、休止マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の間のＴ Ｅ／ＥＭ集団の全体的な頻度は、ＴＣＭと比較して比較的低い（図１ ０ａ）。 したがって、全体として、ＰＤ−１およびＮＫ Ｇ２Ｄの両方の発現は、主に低い（図５Ａ）。 ＴＣＭは、安静時のＣＤ８＋ｔ細胞の大部分を構成するので、４）。 免疫療法で処置したマウスでは、ＮＫ Ｇ２ＤおよびＰＤ−１の発現の両方が、全ての器官にわたって増加した（図１ ０Ａ）。 4). 再び、両方のＮＫＧ２Ｄ（図１ ０Ａ）。 およびＰＤ−１（図５Ｂ）およびＰＤ−１（図５Ｂ）。 （図５ｄ）は、ＴＣＭ ＣＤ８＋ｔ細胞よりもＴ Ｅ／ＥＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞上でより高度に発現された。 対照と比較してｔ Ｅ／ＥＭ集団が拡大したリンパ器官において、それは依然としてＣＤ８＋ＴＣＭ細胞より有意に少なかった（円グラフ、図１ ０Ａ、図１ ０Ｂ、図１ ０Ｂ、図１ ０Ｂ、図１ ０Ｂ、図１ ０Ｂ、図１ ０Ｂ、 5b)これらの場所でより少なく重要な拡張に起因する。 リンパ系器官とは対照的に、ＣＤ８＋ＴＥ／ＥＭ細胞は、アッセイした末梢器官の大部分を構成した（円グラフ、図１ ０Ａ）。 これにより、これらの部位でＮＫ Ｇ２ＤおよびＰＤ−１の全体的な発現を有意に高くする。 再びそれは免疫療法処理マウスのリンパ器官では、両方の活性化マーカーの全体的な発現は、CD8集団の末梢上のリンパ管のtcmスキューのために末梢器官 発現レベルは、同じ治療群内の異なる器官（リンパ系および末梢器官の間に有意差はなかった）からのTE/EM間で大きく変化しなかったが、対照と比較して一般的にIT治療で増加し、NKG2DではPD-1よりも有意に顕著であった傾向があった（図。 5). 対照的に、ＴＣＭ活性化マーカーの発現は、処置群内のマウス由来の器官間だけでなく、対照群とＩＴ処置群との間でも比較的一定のままであった（図１ ０Ａ）。 5a-b）。 一緒に取られて、これらのデータは、メモリ/活性化プール（TCM対TE/EM）の構成は、特にCD8T細胞と、活性化されたT細胞集団の表現型に重く重さを示唆している。
位置によるCD8T細胞の差動表現型は、エフェクター/エフェクターメモリT細胞表現型の強化された拡張および活性化マー マウスを抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２免疫療法で処置し、リンパ系（脾臓またはＬＮ）または末梢（肺または肝臓）器官における処置の１ ２日目に様々な免疫パラメータを評価した。 対照（ａ、ｃ）および抗ＣＤ４ ０／ＩＬ−２（ｂ、Ｄ）におけるＣｄ２ ５Ｎｅｇｃｄ４ ４Ｈｉｇｈｃｄ８＋ｔ細胞におけるＮＫ Ｇ２Ｄ＋（Ａ−ｂ）およびＰＤ−１＋（ｃ−ｄ）の頻度は、ＴＣＭ（ｃｄ６ ２Ｌ＋、白）およびＴＥ／ＥＭ（ＣＤ６ ２Ｌ−、黒）によ これらのデータは、グループごとに2-3マウスを用いた3つの独立した実験の代表である。 データは平均±ＳＥＭとして提示する。 統計量は、Bonferroniの事後検定*P<0を使用してANOVAを使用して導出しました。05,**P<0.01,***P<0.001
高用量全身免疫刺激療法を受けている患者からのT細胞の評価
次に、我々は、高用量の全身免疫刺激療法を受けている患者からのt細胞の評価
次に、我々は、高用量の全身免疫刺激療法を受けている患者からのt細胞の評価
次に、我々は、高用量のt細胞の評価を受けている患者からのt細胞の評価を受けている患者からのt細胞の評価を受けている患者からのt細胞の評価を受けている患者からのt細胞の評価を受けている患者からのこれらの結果が癌の免疫刺激療法を受けているヒト患者に翻訳されたかどうかを評価することを望んでいた。 組換えヒトIL-2との併用アゴニスト抗CD40を評価する試験は現在ありませんが、我々は日常的に高用量TLRアゴニストと高用量全身サイトカイン療法を含む他の全身免疫刺激治療との併用療法を比較し、私たちの前臨床モデルで観察されているようにT細胞に同様の表現型および機能的変化を示しています。 診療所の患者が表面マーカー発現の同様の変化を表示したかどうかを評価するために、我々は全身高用量IL-2療法を受けている転移性黒色腫患者から末梢血単核細胞（PBMCs）を収集した。 患者は6×10^5IU/Kgを8時間ごとに受け、計画された合計14回の用量で投与した。 ＰＢＭＣサンプルは、Ｔ細胞表現型を評価するために、治療の開始の１日前（ベースライン）または治療の最初のサイクルの８日目（８日目）に収集した。 ベースラインおよび８日目の試料を比較すると、高用量ＩＬ−２療法後のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞サブセットの両方において、ＰＤ−１＋記憶表現型（ＣＤ４ ５ＲＯ＋）細胞 6a-c）。 この集団がさらに8日目の時点で中央メモリ（CD62L+）とエフェクター/エフェクターメモリ（CD62L-）に分解されたとき、エフェクター/エフェクターメモリサブセットは、中央メモリサブセットよりも有意に高いPD-1発現を発現した（図。 6d-e）。 一緒に、これらのデータは、これらのデータがヒトの研究に適用可能であり、局所的に何が起こっているかの指標である可能性があることを示唆するマウ
