結果
メモリT細胞 マウスにおけるエフェクターおよび記憶Ｔ細胞サブセットを定義するための新しいマーカーを探索しながら、本発明者らは、ＩＬ−７受容体α鎖／ＣＤ１ ２ ７の表面発現 1a）。 Ｌｍに対する一次応答の間に、抗原特異的脾臓Ｔ細胞集団の別個の亜集団を、ＣＤ１ ２ ７発現レベルに基づいて区別することができる。 CD127低発現細胞（Cd127Low）は、急性エフェクター相の間に優勢である。 しかし、記憶Ｔ細胞期への移行の間、Ｃｄ１ ２ ７Ｌｏｗ細胞は徐々に消失し、一方、高レベル（Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ）を発現する集団は、経時的にサイズが著しく安定したままである（図１Ｂ）。 1aおよびc)。 これらの異なる速度論的値は、CD127発現が長寿命の記憶T細胞の選択的特性であることを強く示唆している。 エフェクター期の間、Ｃｄ１ ２ ７Ｌｏｗ ＣＤ８＋ｔ細胞は、非リンパ器官に優先的に移動するが、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ ＣＤ８＋ｔ細胞のみがＬＮにおいて検出される（図１Ｂ）。 1b）。 脾臓は、すべての異なる亜集団が免疫化後早期に見出される「中間器官」を表す（22、23）。 その後、記憶期の間に、すべての器官における抗原特異的Ｔ細胞は、Ｃｄ１ ２ ７高表現型によって特徴付けられる（図１ ０Ｂ）。 1bおよびc）。 刺激に応答して増殖するCd127LowとCd127High抗原特異的T細胞の能力の比較は、二つのサブセット間の顕著な違いを明らかにした。 図に示すように。 図1dに示すように、精製されたリステリア特異的Cd127High T細胞は、抗CD3刺激後に急速に増殖するが、Cd127Low T細胞は不十分に増殖する。 既知のＣＤ１ ２ ７活性化または遮断活性を有する異なるＭＡｂクローンが、短期のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激アッセイにおいて同じ効果を示したので、増殖におけるこれらの差がＡ Ｂ媒介ＩＬ−７ｒ刺激を介したＣＤ１ ２ ７陽性細胞の利点を反映する可能性は低い（データは示されていない）。
より直接的に長寿命のメモリT細胞がcd127高発現コンパートメントに排他的に存在していることを実証するために、早期in vivoプライミング後、我々は機能的に直接ex vivo抗原特異的T細胞を単離するために、最近開発された可逆mhc多量体染色技術（21）を使用して養子移入研究を行った。 Ｌｍで１ ０日間感染したマウスからのＣｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ ＬＬＯ９ １−９ ９特異的Ｔ細胞の養子移入後、移入された細胞は、数週間後に未処置のレシピエントマウスの脾臓でまだ検 2a)、一方、Cd127Low細胞の転送後の細胞数は検出限界にあった。 この観察は、肺について同様の差異を見出したので、移入されたＣＤ１ ２ ７ｈｉｇｈ細胞およびＣｄ１ ２ ７Ｌｏｗ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ遊走の差異に起因するものではなかった（図１ ０Ａ）。 および他の器官（ＬＮおよび肝臓、データは示されていない）。 さらに、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ Ｔ細胞が抗原特異的記憶細胞を独占的に維持するという解釈を支持するために、レシピエントマウスをリステリア感染による養子移入後に挑戦した。 再び、感染前にCd127High T細胞を受けたマウスにおいてのみ、検出可能な転移したLLO91–99特異的T細胞の急速な拡大があった（図。 2b）。 再び、この結果は、移入されたＣｄ１ ２ ７Ｌｏｗ Ｔ細胞の維持または拡大が他のどの器官においても検出できなかったため、遊走の違いによるものではなかった（図 図2bおよびデータは示さない）。 養子移入研究からのこれらの結果は強く長寿メモリT細胞がCd127High T細胞コンパートメントに排他的に存在しているという仮説を支持するが、我々はまた、この実験的アプローチの実質的な制限を観察した。 特に、即時エフェクター機能を有する記憶T細胞は、養子移入実験に非常に敏感であり、精製およびi.v.適用後に急速に死ぬように見える。in vivoでそのまま放置されている場合、数ヶ月から数年生存するが(11)。 したがって、養子移入からの我々の結果は、CD127は、長寿命のメモリT細胞のマーカーであるという解釈に準拠しているが、我々は明確なT細胞亜集団の生存に関
養子移入研究は、長寿命の記憶T細胞がCD127陽性コンパートメントに排他的に存在することを示しています。 ＢＡＬＢ／ｃ Ｔｈｙ１からのＣＤ１ ２ ７高発現および低発現ＣＤ８＋、Ｈ２−Ｋｄ／ＬＬＯ９ １−９ ９多量体陽性細胞。1マウスは、リステリア感染の10日後にex vivoで直接選別した。 細胞をナイーブBALB/c(Thy1.2)レシピエントマウスに移し、3週間後の脾臓および肺をドナー細胞(CD8+およびThy1.1+)について染色した。 （ａ）棒グラフは、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ細胞（開放）またはＣｄ１ ２ ７Ｌｏｗ（充填）Ｔ細胞の移動後の臓器あたりのｔｈｙ１． （ｂ）１ ０ ３Ｌｍでの感染の５日後の、ａに記載されたのと同じデータ取得およびデータ提示。
Cd127およびCD62Lを用いた抗原特異的T細胞集団の共染色は、記憶T細胞亜集団間の識別を可能にする。 Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ ｔ細胞集団のさらなる特徴付けは、ｃｄ６ ２Ｌの高レベルおよび低レベルを発現する部分集団に細分することができることを示した（図１ ０Ａ）。 3). 精製されたT細胞の直接ex vivo機能分析（21）（すべての亜集団が脾臓で同時に検出可能である感染後10-12日）は、さらなる機能的差異を明らかにした。 Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗ Ｔ細胞サブセットは、活発で即時のｅ ｘ ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示すのに対し、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ／Ｃｄ６ ２Ｌｈｉｇｈ Ｔ細胞は、ペプチド被覆標的細胞の非常に乏しい溶解を示 3). ソートされたサブ集団の細胞内サイトカイン染色は、Cd127High/Cd62Llow t細胞は、Cd127Low/Cd62Llowサブセットのように、エフェクターサイトカインINF-γおよび腫瘍壊死因子αを産生することを明らかにした;対照的に、Cd127High/Cd62LhighサブセットはIL-2を産生するが、IFN-γおよび腫瘍壊死因子αは産生しない。 したがって、CD127とCD62Lのマーカーの組み合わせは、ヒトで以前に記載されたものと非常に類似した特性を有するT細胞亜集団の同定を可能にする。 ＣＤ１ ２ ７Ｌｏｗ／Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗ Ｔ細胞は、実際のエフェクター Ｔ細胞集団の全ての既知の特徴（ＴＥ、増殖活性の低下、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存の制限、および即時エフェクター機能）を示す。 Cd127High/Cd62LhighサブセットはTCMの特性と一致し、Cd127High/Cd62Llow T細胞はTEMの説明に適合する。
CD127/CD62L二重染色は、異なるCD8+T細胞サブセットを区別する;同様の結果は、ヒトで見つけることができます。 Ｌｍ感染後のＣＤ６ ２Ｌ（ｙ軸）およびＣＤ１ ２ ７（ｘ軸）の表面発現のためのＣＤ８＋、Ｈ２−Ｋｄ／ＬＬＯ９ １−９ ９多量体陽性細胞の二重染色；象限における亜集団の相対的な百分率を示 ＣＤ１ ２ ７Ｌｏｗ／Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗ、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ／Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗ、およびＣｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ／Ｃｄ６ ２ｌｈｉｇｈ亜集団を、リステリア感染の１ ２日後に直接ｅ ｘ ｖｉｖｏで選別し、異なる機能アッセイに移した。 細胞溶解活性は、標的細胞およびLLO91–99ペプチド（正方形）またはペプチド（円）なしの存在下でソートされた細胞のインキュベーション後に評価した。 Ｌｌｏ９ １−９ ９ペプチドによる短時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激の後、Ｅ Ｘ ｖｉｖｏで選別されたＬＬＯ９ １−９ ９特異的亜集団（上記に示すように）の細胞内サイトカイン染色を、ＩＬ−２（上）、ＩＦＮ−γ（中）、およ
異なるメモリT細胞亜集団の生成は、CD40Lを介したT細胞の助けに依存する。 我々は、cd127発現がエフェクターと長寿記憶T細胞を養子細胞移植実験で区別するためのマーカーとして使用できるという解釈を排他的にベースにすることが問題になる可能性があると感じたので、我々はT細胞記憶の生成に欠陥を持つマウス変異株を解析することにしました。 CD127は確かに”初期”メモリT細胞マーカーである場合、我々はメモリ欠陥を持つマウスのCD127陽性サブセット内の初期と後期の時点での違いを識別するこ
最近の研究は、長期的な記憶応答（2-4）の生成のためのT細胞ヘルプの重要性を示したので、我々はCD4+T細胞ヘルプの存在または非存在がCD8+t細胞 従来のCD4+T細胞を欠いているMHC II欠損マウスは、欠陥のあるCD8+メモリ応答を持っており、保護の質は、時間の経過とともに減少します（2-4）。 一次感染の１ ０日後のＴ細胞亜集団の染色により、Ｃｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ／Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗサブセットが、ＭＨＣ ＩＩ−／−マウスにはほぼ完全に存在しないことが明らかになった（図１ ０Ａ）。 他の亜集団は、ＷＴ Ｃ５ ７ＢＬ／６マウスのものと同様の頻度で存在する。 これらのデータは、T細胞のヘルプの不在は、迅速なin vivoでの拡張とエフェクター機能のために重要であると思われるエフェクターメモリ表現型を持つT細胞サブセットの効率的な生成を防ぐことを示しています。
Mhc II-/-およびCD40L-/-マウスにおける記憶応答の障害は、 （ａ）ＷＴ Ｃ５ ７ＢＬ／６（左）およびＭＨＣ ＩＩ欠損（右）マウスを、オボアルブミン発現Ｌｍの致死下用量で感染させた。; 一次感染の１ ０日後のＣＤ６ ２Ｌ（ｙ軸）およびＣＤ１ ２ ７（ｘ軸）について染色したＣＤ８＋、Ｈ２−Κ Ｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ陽性Ｔ細胞のドットプロットを示す。 （ｂ）ｃｄ４ ０Ｌ−／−（充填）およびＷＴ ＢＡＬＢ／ｃ（開放）中のリステリアによる再感染の３日後（≧１ ０×ＬＤ５ ０；一次感染後５週後）の脾臓中の生存細菌の数；群当たりｎ＝３。 (c)cd40L-/-(*)またはWT BALB/cマウスにおけるH2–Kd/LLO91-99四量体染色によって決定されたLLO91-99特異的T細胞の動態(□)一次感染後(0.1×LD50)およ; 時間点ごとに三つのマウス。 ５×ＬＤ５ ０；一次感染後５ｗ ｋ）の間に飲料水によってＢｒｄｕｒｄを受けた；ドットプロットは、Ｈ２−Ｋｄ／ＬＬＯ９ １−９ ９四量体（ｙ軸）で染色したＣＤ８＋ｔ細胞中のＢｒｄｕｒｄ取り込み（ｘ軸）を示 （ｅ）一次感染の１ ０日後のＣＤ６ ２Ｌ（ｙ軸）およびＣＤ１ ２ ７（ｘ軸）について、ＣＤ４ ０Ｌ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣＤ８＋、Ｈ２−Ｋｄ／ＬＬＯ９ １−９ ９四量体陽性細胞の二重染色（ＷＴ ＢＡＬＢ／ｃ対照図を参 2c）。 （ｆ）脾臓におけるＬＬＯ９ １−９ ９四量体陽性Ｔ細胞サブセットの絶対数は、ＣＤ６ ２ＬおよびＣＤ１ ２ ７の染色によって一次感染の１ ０日後に決定した。CD4+T細胞ヘルプの重要なメカニズムは、CD40とCD40L（24–26）の相互作用を介して媒介されるので、我々はCD40L–/–マウスはMHC II–/-マウスのそれと同様の表現型を示 他の最近の研究（２ ７）によれば、ＣＤ４ ０Ｌ−／−マウスは、一次リステリア感染後の細菌負荷または細菌クリアランスに差異を示さず（データは示さず）、Ｌｍの致死下用量 4c）。 しかし、より高用量のＬｍ（≧１ ０×ＬＤ５ ０）で再感染を迅速に除去するそれらの能力は低下する（図１ ０Ａ）。 障害されたＣＤ８＋記憶Ｔ細胞応答と相関する（図４Ｂ）。 るＣｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈ／Ｃｄ６ ２Ｌｌｏｗサブセット（図４Ｃ）を提供する。 4eおよびf)初期のposteffector段階の間に。 リステリアによる再感染の間、ＣＤ４ ０Ｌ−／−マウスにおける応答Ｔ細胞の増殖は、ＷＴマウスにおける細胞集団の増殖と同等であり、表現型が記憶Ｔ細胞の増殖能の一般的な欠陥によるものではないことを示している（図３）。 ではなく、抗原reencounterにすぐに応答することができるメモリT細胞の数を減少させた。 この表現型は、拡大期全体の間にＢｒｄｕｒｄが組み込まれたｉｎ ｖｉｖｏ標識実験によって実証された（図１ ０Ａ）。 図４ｄ）およびｉｎ ｖｉｖｏ Ｂｒｄｕｒｄ ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ研究により、増殖時の標識の喪失を監視する（データは示さない）。
プライミング後のエフェクターメモリ表現型を持つT細胞サブセットの生成が減少し、後期メモリT細胞プールに送信されます。
我々のデータは、CD4+T細胞またはCD40Lの非存在下では、Cd127High/Cd62Llow T細胞サブセットが大幅にプライミング後の早期に減少することを示しています。 さらに、我々（図。 4b)およびその他(3-5)は、T細胞プライミング中のT細胞ヘルプの障害が、Lmまたはリンパ球性絨毛膜炎ウイルスによる再感染に対する防御免疫の質 より明確にこれらのマウスにおけるその後のT細胞メモリの品質とCd127High/Cd62Llow T細胞の初期世代で観察された欠陥をリンクするには、我々は、メモリ相（一次リステリア感染後5週間）の間に抗原特異的T細胞集団をより詳細に分析した。 この時点で、抗原特異的T細胞の分析は、それらの明確な遊走行動のために、異なる組織に由来する細胞に対して実施されなければならない。 脾臓に加えて，リンパ器官の代表的な組織としてＬＮを選択し，典型的な末梢非リンパ区画として肺を選択した。 この時点で、これらの器官における抗原特異的Ｔ細胞は、ほぼ全てＣｄ１ ２ ７Ｈｉｇｈである（図１ ４Ａ）。 肺内の細胞はＣｄ６ ２Ｌｌｏｗである（データは示さず）が、ＬＮ内のほとんどの抗原特異的記憶Ｔ細胞はＣｄ６ ２Ｌｌｏｗである（図１Ｂ）。 5b）。 異なる器官における明確な即時エフェクター機能を有する抗原特異的記憶Ｔ細胞の数を決定するために，ＩＦＮ-γに対する細胞内サイトカイン染色を行った。 図に示すように。 図５Ａを参照すると、ＣＤ４ ０Ｌ−／−マウスは、ｗｔマウスと比較して、即時エフェクター機能を有する抗原特異的記憶Ｔ細胞の数が実質的に減少することを特徴 この結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画内の頻度（百分率）のレベルおよび絶対数において真である（図１ ０Ａ）。 5a）。 しかし、LN由来リンパ球のMHC四量体染色（図。 5b)Cd62Lhigh表現型を持つ抗原特異的T細胞のほぼ同一の数を明らかにした。 いくつかのＣｄ６ ２Ｌｌｏｗ抗原特異的Ｔ細胞は、ＷＴマウスのＬｎにおいても検出可能であり、ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度と相関している（図３）。 5a）。 この集団は、基本的にCD40L–/–マウスのLNsに存在しない;全体のCD8+/Cd62Lowサブセットは、CD40L–/–マウスで減少し、このT細胞サブセットの生成における一般的な欠陥を示唆している。 要約すると、我々のデータは、エフェクターメモリ表現型（Cd127High/Cd62Llow）を示す細胞の大幅に減少した数で、抗原特異的CD8+T細胞亜集団の定量的な違いでプライ 即時の早いエフェクター機能の細胞のこれらの量的な相違は記憶段階に送信され、防御免除の質に影響を与えます。
T細胞プライミング後の早期のT細胞サブセットにおけるCD40L依存的変化は、後続のメモリT細胞プールに送信されます。 （ａ）リンパ球を、肺、脾臓、およびＷｔ ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣＤ４ ０Ｌ−／−Ｌｍによる一次感染の３ ５日後に由来するＬＮから単離した（０.１×ＬＤ５ ０）。 細胞内IFN-γ染色は、即時エフェクター機能を有するT細胞を同定するために、LLO91–99ペプチドの存在下で簡単なin vitro再刺激後に行われた。 ドットプロットは、（示されているように）異なる臓器の代表的な結果を示し、数値は、ＩＦＮ−γ産生細胞の全体的な頻度を示す。 棒グラフの最初の行は、CD8+コンパートメント内のIFN-γ産生、LLO91-99特異的T細胞の頻度のデータを要約し、右の棒グラフの行は、異なる臓器におけるIFN–γ産生、LLO91-99特異的T細胞の絶対数のデータを要約している。 （ｂ）ＬＮ細胞を、ａに記載のように一次感染の３ ５日後に採取した；ＬＬＯ９ １−９ ９特異的Ｔ細胞を、ＣＤ８およびＣＤ６ ２Ｌの共染色（ドットプロット、ｘ軸）とともに、ＭＨＣ多量体染色（ド 代表的なドットプロットは、CD8+T細胞上でゲート細胞のために示されています; 各象限内の周波数が示されます。 左の棒グラフは、CD8+コンパートメント内のMHCS多量体陽性T細胞およびCD62L陽性t細胞の頻度に関するデータを要約し、右の棒グラフの行は、LNにおけるLLO91-99/H2-Kd多量体陽性T細胞の絶対数に関するデータを要約しています(CD40L-/-(充填)およびWT BALB/c(オープン);群あたりn=3)。p>
