真菌カンジダguilliermondiiは、皮膚および粘膜表面のヒト微生物叢を含む自然界に広く分布している。22この種は他のカンジダ種と比較して病原性が低下しているが、3現在、ラテンアメリカでの主要な発生率を有する新興病原体と考えられている。18℃ guilliermondiiは、主に免疫不全患者に播種されたもの、血管内装置を有する外科的患者における22および院内発生を含む、多種多様な臨床感染の病因として認識されている。13現在、neutropenic患者の侵略的なカンジダ症のための推薦された処置はフルコナゾール(FLC)はこの薬剤への感受性が確認されるときだけ推薦されるが、第一線療法23しかし、いくつかの研究は、C.guilliermondiiがFLC8、15、19に対する感受性が低下していることを示しており、高いアンホテリシンB（AMB）最小阻害濃度（MICs）を有する分離株に関連した治療障害が報告されている。9,12,24分離株のほぼ90％が感受性（2μ g/ml）の臨床ブレークポイント（CBP）よりも等しいか低いエキノカンデンマイクを示していますが、C.parapsilosisのようなカンジダの他の種に似た17、C.guilliermondiiのいくつかの分離株はかなり高いマイクを示しています。8,15侵襲性カンジダ症におけるAFG有効性に関する利用可能なデータは限られており、臨床診療におけるその薬物の潜在的な役割はあまり知られていこの文脈では、動物研究は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ相関のより良い理解のために重要な役割を果たすことができる。11したがって、我々の主な目的は、AMBおよびFLCの結果と比較して、C.guilliermondiiの異なる分離株に対するAFGのin vitroおよびin vivo活性を評価することでした。

材料および方法真菌分離株

Cの四つの臨床分離株。 guilliermondii（UTHSC11-142、UTHSC10-499、UTHSC11-685およびUTHSC10-3207）は、in vitro研究で使用され、それらの二つ（UTHSC11-685およびUTHSC11-142）は、それらの異なるin vitro感受性に基づいてマウスモデルに選択された。 分離株は、この種のタイプ株のものと配列を比較し、内部転写スペーサー（ITS）領域とrRNAのD1–D2ドメインを配列決定することによって同定された。

In vitro研究

AMB、FLCおよびAFGに対する四つの株のin vitro感受性は、基準ブロスマイクロ希釈法、6candida parapsilosis ATCC22019およびCandida krusei ATCC6258を品質コントロールとして含めて評価した。

タイムキル曲線は、以前の研究によると、すべての株のために開発されました。手短に言えば、各抗真菌剤の原液を調製した、AMB(Sigma–Aldrich Co. およびＡＦＧ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ． Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を、ジメチルスルホキシドおよびＦＬＣ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、マドリード、スペイン）蒸留水で。 さらに、標準的なＲＰＭＩ１ ６ ４ ０培地９ｍｌ中で薬物希釈物を調製して、以下の濃度を得た。0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 そして各薬剤の32μ g/ml。 分離株は、ジャガイモのデキストロース寒天（PDA）プレート上の35℃で24時間継代培養した。 Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉの培養物を滅菌生理食塩水に懸濁し、得られた懸濁液を、血球計数およびＰＤＡ上への連続めっきによって５×１ ０ ６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌで調整して、生存 希釈物および対照（薬物を含まない）に、１ｍｌの真菌懸濁液を接種し、５×１ ０ ５ＣＦＵ／ｍｌの開始接種物を得、３ ５℃でインキュベートした。0, 2, 4, 6, 8, 24, それらの30μ lをPDAプレート上に培養し、CFU/ml決定のために35℃で48hインキュベートした。 開始接種物と比較して≥99.9％または3log10単位のCFU減少は殺菌性であると考えられ、

log10単位の減少は真菌性であると考えられた。 検出限界は50CFU/mlであった。 すべての時間殺しのカーブの調査はで行われましたduplicate.In 平均重量が３ ０ｇの−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ；Ｃｒｉｆｆａ Ｓ Ａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎｓａ，Ｓｐａｉｎ）の雄性を実験に用いた。 マウスは、食物および水への自由なアクセスを有する標準的な箱に収容された。 すべての動物処置は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｒｏｖｉｒａ ｉ Ｖｉｒｇｉｌｉ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって監督および承認された。

マウスは、200mg/kgのシクロホスファミド（Genoxal;Laboratorios Funk SA、Barcelona、Spain）と静脈内（i.v.）の腹腔内（i.p.）注射によって感染の一日前に好中球減少させた。 ５−フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｏ；Ｆｅｒｒｅｒ Ｆａｒｍａ Ｓ Ａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を１ ５ ０ｍｇ／ｋｇで注射する。感染の10,14日に、マウスを、c.guilliermondii、UTHSC11-685およびUTHSC11-142の2株のそれぞれの1×108CFU/動物で、0.2mlの滅菌生理食塩水中で、外側尾静脈に静脈内に刺激した。3,4

八つの動物のグループは、各株と薬物のためにランダムに確立されました。 群を以下のように処理した：アンホテリシンＢデオキシコール酸（Ａｍｂｄ）（Ｘａｌａｂａｒｄｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｂａｒｃｅｌｏｎ，Ｓｐａｉｎ）を、１日１回、静脈内投与（Ｑ Ｄ）の用量で；リポソームアンホテリシンＢ（ＬＡＭＢ）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓ． Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）で１ ０ｍｇ／ｋｇ静脈内、ＱＤ；ＦＬＣ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）；およびａｆｇ（Ｅｃａｌｔａ；Ｐｆｉｚｅｒ Ｌｔｄ． 10mg/kgの体重/用量i.p.、QDである。 すべての処置は挑戦の後の24hを始め、7日間続いた。 コントロールは治療を受けなかった。 細菌感染を予防するために、すべてのマウスは、感染後1日目から7日目まで皮下に5mg/kgのセフタジジムを投与した。 マウスを毎日チェックし、CO2無酸素による感染後8日目に安楽死させた。 各薬剤の有効性は、組織負荷の低減および病理組織学的研究によって評価された。 腎臓を無菌的に除去し、そのうちの一つを秤量し、2mlの滅菌生理食塩水で均質化した。 ホモジネートのシリアル10倍希釈は、PDA上にメッキし、CFU/g計算のために48時間35℃でインキュベートしました。 病理組織学的研究のために残りの腎臓は10％緩衝ホルマリンで固定され、脱水、パラフィンが埋め込まれ、ヘマトキシリン–エオシン（H-E）と周期的な酸-シッフ（PAS）染色で染色された2μ mの切片にスライスされた。０ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用して、ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔを使用して、組織からのコロニー数を分析した。＜／ｐ＞統計量＜ｐ＞組織からのコロニー数を分析した。 P値が0.05以下であった場合、差は統計的に有意であると考えられた。

結果インビトロ試験

AMBのMicは、AFGの場合は0.25–1μ g/ml、AFGの場合は0.06–0.25μ g/ml、FLCの場合は0.5–1μ g/mlであった。 C.guilliermondiiに対するAMB、FLCおよびAFGに対する感受性のカットオフに続いて、16のすべての分離株は、三つの薬物に感受性であった。 品質管理株感受性は許容範囲内であった。6

AMBの殺殺速度論は、薬物濃度とともに増加する速い殺菌活性を示した。 MICに相当する濃度では、その薬物は、試験された4つの分離株のうちの3つに対して殺菌効果を示した（図10A）。 1). この活性は、1μ g/mlを超える濃度で接種直後に開始され、殺菌エンドポイントは4時間後に32μ g/mlに達した。 0.5μ g/ml以上の濃度でAFGは、インキュベーションの4時間後に開始殺菌活性を示した。 殺菌性エンドポイントは、32μ g/mlでのインキュベーションの12–24hに達した（図10a）。 2). ＦＬＣは、４つの分離株全てに対して静真菌活性を示した（図１）。 3).

1.

C.guilliermondiiの四つの株に対するAMBのタイムキリングキネティックスアッセイ。 (■)0.03μ g/ml、(△)0.12μ g/ml、(□)0.5μ g/ml、(○)1μ g/ml、(Δ)2μ g/ml、(△)8μ g/ml、(△)32μ g/ml、(●)対照。 破線は、最初の接種物（殺菌活性）と比較した成長における３ｌｏｇ１ ０単位のＣＦＵ減少を表し、点線は、試験の定量限界を示す。

(0,41MB)。

2.

C.guilliermondiiの四つの株に対するAFGのタイムキリングキネティックスアッセイ。 (■)0.03μ g/ml、(△)0.12μ g/ml、(□)0.5μ g/ml、(○)1μ g/ml、(Δ)2μ g/ml、(△)8μ g/ml、(△)32μ g/ml、(●)対照。 破線は、最初の接種物（殺菌活性）と比較した成長における３ｌｏｇ１ ０単位のＣＦＵ減少を表し、点線は、試験の定量限界を示す。

(0,38MB)。

3.

C.guilliermondiiの四つの株に対するFLCのタイムキリングキネティックスアッセイ。 （■）0.03μ g/mL、（△）0.12μ g/ml、（□）0.5μ g/ml、（●）1μ g/ml、（Δ）2μ g/ml、（△）8μ g/ml、（△）32μ g/ml、（●）対照。 破線は、最初の接種物（殺菌活性）と比較した成長における３ｌｏｇ１ ０単位のＣＦＵ減少を表し、点線は、試験の定量限界を示す。

(0,28MB)。

In vivo研究

10mg/kgの子羊は、他の治療法（P≤0.04）よりも有意に高い減少である、二つの株のそれぞれに感染したマウスの腎臓 AMBdおよびFLCは、これら二つの薬剤のための最も低いMICs、すなわち、AMBのための0.25μ g/mlおよびFLCのための0.5μ g/ml（p≤0.008）を示した株に感染したマウスの ＡＦＧの場合、真菌負荷の減少は、Ａｍｂｄの場合よりも適度で低く、そしてそれは、ｕｔｈｓｃ１ １−６ ８ ５株の対照群に関してのみ、腎臓における組織負荷を有意に減少させた（Ｐ＝０． 4).

Fig. 4.

Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.図８、ＡＦＧ１ ０およびＦＬＣ５ ０；ＣＰ０.０ ５対ａｆｇ１ ０およびＦＬＣ５ ０。

(0,1MB)。組織学的研究では、未処理動物の腎臓およびAMBd、FLCまたはAFGで治療したマウスにおける真菌細胞の局所浸潤が示された。 子羊で処理したマウスの腎臓は軽度の真菌浸潤のみを示した。 壊死、炎症反応または実質変化の徴候は、処置された動物においても対照においても観察されなかった（図１ ０Ａ）。 5).Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉに感染した対照マウスの腎臓部分における真菌浸潤（黒矢印）の存在（感染後８日目）（周期性酸Ｓｃｈｉｆｆ染色、倍率１ ０ ０ ０×）。＜／ｐ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞＜ｄｉｂ＞ バー=10μ m。

5.

c.guilliermondiiに感染した対照マウスの腎臓部における真菌浸潤（黒矢印）の存在は、感染後8日で（周期的な酸Schiff染色、倍率1000×）。 バー=10μ m。

(0,35MB)。

議論

in vitro研究では、FLCまたはAFGに対するC.guilliermondii分離株の感受性の低下は明らかにされなかった。 以前の研究と一致して、AMBのタイムキルカーブは、すべての分離株に対する濃度依存的な殺菌活性を示した、4、5、7とFLCは関係なく、試験された濃度の真菌Ａｍｂｄは、両方を同じ用量で投与した場合、特に腎臓において、その脂質製剤よりも高い有効性を示すことが知られている。しかしながら、薬物動態学的研究により、0.75mg/kgのAMBdの投与後、マウス血清中で達成されたAMBのCmaxは0.30μ g/mlであったことが示された。しかし、試験した２つの分離株のうちの１つのＡＭＢ ＭＩＣはこの値よりも高いので、より高い濃度に到達するために、高用量のＬＡＭＢを使用した。1実際、10mg/kgでの子羊の投与は、両方の株の真菌負荷を減少させるのに有効であった。 この事実は、AMBが1μ g/mlの濃度で、in vivoで試験された二つの分離株に対してその殺菌活性を達成した殺害曲線と相関した。 我々の知る限りでは、これは殺す速度論とC.guilliermondiiの臨床分離株に対するAFGとFLCのin vivo実験的有効性との間の関係を確立しようとした最初の研究です。 エキノカンディンに関する以前の研究のみが存在し、特にC.guilliermondiiによる播種感染におけるカスポファンギン（CFG）に存在する。 1mg/kgのCFGは、8μ g/mlのMICでC.guilliermondiiの一つの株に感染したマウスの腎臓真菌負荷を低減するのに有効であったが、時間殺しは殺菌活性が64μ g/mlの濃度で達成されなかったことを明らかにした。4逆に、我々の研究は、32μ g/mlで、以前に報告されているように、17 24hで、8μ g/mlで殺菌活性を発揮AFGの濃度依存的活性を示した。 以前の研究では、10mg/kgの用量で7日間の治療後、血清および腎臓中のAFG濃度が約13μ g/mlであることが報告されていました。21ここで、AFGは、試験した二つの株のいずれかに感染した好中球減少マウスの腎臓における真菌の負担を適度に軽減することができ、これは、試験した二つの株の間の低いAFG MICs差（1希釈）とは関連していないようであり、AFG治療に対する応答が株依存性であることを示唆している。 同様に、FLCはまた、わずかにその真菌活性のために驚くべきことではなかったMICs、2以上の血清濃度に達する投与用量にもかかわらず、二つの株のいずれかで挑戦したマウスの腎臓における真菌の負担を軽減することができました。

結論として、我々の研究は、FLCおよびAFGの貧弱な効果とは対照的に、C.guilliermondiiの二つの株に対する子羊の高い活性および有効性を示した。 しかし、AFG MICsの広い範囲を表すC.guilliermondiiのより多くの分離株とのさらなる研究は、MIC値とAFG有効性の間の任意の関係が存在するかどうかを評価するために行

利益相反

宣言することはありません。