自然免疫系の骨髄コンパートメントは、損傷した細胞およびアポトーシス細胞のクリアランス、抗原提示、免疫抑制、および外来微生物からの宿主の保

単球は、自然免疫系を構成する細胞の高度に可塑性のサブセットを表します。

これらの細胞は、血管系を横断することができ、特定のサイトカインに曝されると、異なる細胞型への分化を受ける。 循環単球は、非古典的または古典的のいずれかに分類され、細胞表面受容体発現のそれらのパターンによって区別することができる。 の単球の循環の表示CD14+++こんにちは/CD16−上下として現在特に場所の感染や病(1,2).

人間非古典単球の循環の表示CD16+++こんにちは/CD14+/lo表面表現(1). 活性化後、単球はいくつかの形態学的および生化学的機能的変化を受け、その結果、単球はマクロファージなどの新しい細胞型に分化する（3）。

古典的な活性化と呼ばれるパラダイムでは、ヒト単球は、Th1応答促進サイトカインインターフェロン—γ（IFN-γ）または腫瘍壊死因子α（TNF-α）、ならびにエンドトキシンリポ多糖（LPS）（4,5）への曝露によって開始することができる表現型可塑性を表示する。 古典的な活性化のこのメカニズムは、細菌やウイルスに対する宿主の保護を提供する炎症促進メディエーターを生成するために機能するM1マクロファージを生成します(6)。 ヒト単球はまた、インターロイキン−１ ０（ＩＬ−１ ０）および形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）（４，７）などのｔｈ２応答促進サイトカインへの曝露によってＭ２マクロファージに M2マクロファージは、CD206（マンノース受容体）とCD163の高レベルを発現し、プロ炎症性サイトカインの低レベルを生成し、創傷治癒とマトリックスリモデ樹状細胞（Dc）は、単球由来免疫細胞の別のセットであり、その機能は、適応T細胞ベースの免疫応答を開始するためにt細胞に抗原を提示することである。

ＤＣは、主に、古典的（ｃＤＣ）、形質細胞様（ｐＤＣ）、および単球由来（ｍＯＤＣ）の３つのサブグループに分類することができる。 CDCは、典型的には、リンパ組織、脾臓、リンパ節、および骨髄に見出される。 PDCは形質細胞に似ており、典型的には血液循環中に見出される（8）。 単球は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびIL-4（9,10）への曝露後、しばしば単球由来Dc（moDCs）と呼ばれるDcに分化することができる（9,10）。 ＭＯＤＣは、細胞表面マーカー ＣＤ８ ０、ＣＤ８ ３、ＣＤ８ ６、およびＣｄ１Ａをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現することが報告されている（１ １〜１ ３）。 MODCはマクロファージとは細胞の形状や機能が異なりますが、Cd11C、CD206、Cd1Aなどのいくつかの細胞表面抗原の発現を共有しています(14)。

いくつかのグループは、ヒトCD14+単球のマクロファージへの分化に成功したことを報告している; しかし、これらの公開されたプロトコルの多くは類似していません。 これらの方法の間の一般的な変形は、ＩＬ−６の包含（１ ５）または省略（１ ６）である。 プロトコル間のもう一つの違いは、治療のタイミングです。 このようなプロトコル間の一貫性の欠如は問題である。

これらの問題に対処するために、我々は検討し、一般的なヒト単球分化方法論で使用されるサイトカイン治療におけるIL-6の包含と省略を比較した。 我々は、IL-6の非存在下では、これらの戦略は、あいまいな実験結果をもたらすことができる均質性の低い程度の細胞を産生することがわかった。 第二に、さらにこの問題に対処するために、我々はIL-6を含む新しい段階的なin vitro戦略を開発しました。 我々は、この戦略が大幅にm1とM2マクロファージだけでなく、ヒトCD14+単球から分化したmodcの細胞の均質性を改善することがわかった。 この方法論の改善は、免疫系および疾患状態を調査するためのより良いモデルを研究者に提供する。

材料および方法

細胞調製物

バフィーコートは、プールされていた五人以上の健康な男性ドナーの全血から収集されました。 ０ ７ ７ｇ／ｍＬ密度）（１ ７−１ ４ ４ ０−０ ２；ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）密度勾配遠心分離により、バフィーコートから末梢血単核細胞（Ｐｂｍｃ）を調製し、血液成分を分離した。 細胞を、１×ＰＢＳを使用して数回洗浄し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４ｐｌｕｓ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ Ａ）を使用して計数した。 カウントされると、Cd14+単球は、MAb CD14共役マイクロビーズ（130-050-201）を使用して磁気標識することによってPBMCsから単離された; Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ）に続いて、製造業者の説明書に従って磁気カラム（１ ３ ０−０ ４ ２−４ ０ １および１ ３ ０−０ ４ ２−３ ０ ２；Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分離したが、１つの例外を除いて：磁気カラムからＣＤ１ ４＋細胞を 最初の5mLのすすぎに続いて、追加の5mLの緩衝液を加え、提供されたプランジャーを使用して穏やかに洗い流す。

細胞培養

ヒトCD14+単球を2.0–3の細胞密度で播種した。１ ０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ）、１ ０ ０Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１ ０ ０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を３ ７℃で添加した２ｍ Ｍ／ＬのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍ Ｄ）を含むＲＰＭＩ１ ６ ４ ０培地 細胞をＭ１マクロファージに分化させるために、使用したサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（２ ０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈ Ｉｌｌ，ＮＪ）、ＩＦＮ−γ（２ ０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２ ０ｎｇ／ｍｌ）、およびエンドトキシンＬＰＳ（２ ０ｎｇ／ｍｌ）であった。 M2マクロファージ分化のために、使用されるサイトカインは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、IL-4、IL-6、およびIL-13 20ng/mL（PeproTech）の濃度であった。 ＭＯＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ（１ ０ ０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２ ０ｎｇ／ｍｌ）の添加によって作製した。 各戦略のタイミングは、図1でさらに説明されています。

フローサイトメトリー

偏光マクロファージおよびDcを10cm2皿（BD Falcon、Billerica、MA）で9日間培養した。 ９日目に、培地および非付着性細胞を回収し、付着性細胞を１×ＰＢＳを用いて洗浄し、ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて除去した後、回収した培地／非付着性細胞に添加して洗 ５％ＢＳ Ａ、２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）、計数し、次いで、ＣＤ２ ０ ６（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３ ６（ＰＥ）、ＣＤ１ ６ ３（ＰＥ−Ｃｙ７）、Ｅ−カドヘリン（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４ ８ ８）、ＣＤ８ ６（ＰＥ）、Ｃｄ１Ａ（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８ ３（ＰＥ）、ＣＤ８ ０（ＰＥ）、ＣＤ１ ２ ４（ＰＥ）、およびＣＤ６ ４に対するフルオロフォア共役一次抗体と蛍光は、Ｓ３ＴＭ細胞選別機（Ｂｉｏ−ｒａｄ，ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ｃ Ａ）によって検出された。偏光したヒトマクロファージを４ウェルチャンバーガラススライド（Ｍ Ａ Ｎｕｎｃ Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍ Ａ）に３の密度でめっきした。

エンドサイトーシスアッセイ

0×105細胞/mLを7日目に培養し、残りの2日間適切なサイトカインと共に培養し続けた。 ペリレン-ビスイミド(pbi-12-Man)(17)は、河北大学のKe-Rang Wangからの親切な贈り物でした。 細胞を１ ０μ ｇ／ｍＬのＰＢＩ−１ ２−Ｍａｎと共に３ ７℃で３ ０分間培養し、次いで１×ＰＢＳで洗浄した。 細胞を７ ０％エタノールを使用して固定し、ＤＡＰＩ（Ｐ３ ６ ９ ６ ２；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を装着した。 ＰＢＩ−１ ２Ｍａｎのエンドサイトーシスを可視化するために、スライドを励起し、５ ８ ５ｎｍで放出した。 赤色蛍光画像を、Ｍｅｔａｆｅｒ ｓｌｉｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ Ａ）を用いて定量した。 統計的検定は、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２ ０ １ ５Ａソフトウェア（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、ナティック、マ）。 ランク和検定は、サンプル間の一変量統計的有意性を検定するために行われた。

免疫蛍光

マクロファージは、7日間、以前に記載された方法を用いて分化し、その後、適切なサイトカインとNunc Lab-Tek II4ウェルガラス室スライド 細胞を次の7日間増殖させた後、最初のめっきの14日間、細胞を70％エタノールを使用して固定し、DAPIを有するProlong Diamond anti-fade mountantを使用して取り付けた。 細胞を、ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を用いて可視化した。

結果と議論

ヒトCD14+単球分化のための戦略と条件

我々は、戦略がヒトM1とM2マクロファージだけでなく、modcの均質な集団を産生するのに最も効果的であったかを評価することから始めた。 ヒトCD14+単球を単離し、in vitroでマクロファージまたはmodcに分化する組織培養プレート上に播種した。 我々はその後、最も均一なマクロファージとmoDC集団をもたらした方法を決定するために三つの特定の治療条件をテストしました。 最初の条件では、GM-CSFまたはM-CSFのみを添加して細胞を9日間培養した（図1）。 この状態は”のみ”と呼ばれます（図1）。 第二の治療戦略は、0日目に適用可能なサイトカイン環境に細胞を連続的に暴露し、5日目に培地、サイトカインおよびLPSを補充し、9日目に細胞を分析 この条件は「連続」と呼ばれます（図1）。 第三の戦略は、5日間GM-CSFまたはM-CSFのいずれかでCD14+単球を刺激し、ヒトM1マクロファージのためのLPSと所与の治療群（GM-CSF、IFN-γ、およびIL-6m1マクロファージまたはM-CSF、IL-4、IL-13、およびIL-6m2マクロファージのためのすべての適用可能なサイトカインを含む新鮮な培地を添加することであった。 この治療戦略は”段階的”と呼ばれていました（図1）。 ＣＤ１ ４＋単球を１ ０ ０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で５日間処理し、５日目に培地および全てのサイトカインを置換してＭＯＤＣを生成した。 次いで、ＭＯＤＣを、ＤＣ成熟および活性化を促進するために、分析（８日目）の前に、ＩＬ−６およびＬＰＳで２ ４時間刺激した。 この培養方法を”刺激”と呼んだ（図1）。 ＩＬ−６およびＬＰＳ曝露を受けたことのないＭＯＤＣは、「非刺激」と呼ばれた（図１）。 上記の特定の条件下で９日間培養した後、細胞表面受容体発現および細胞機能性を分析した。

IL-6暴露は、in vitroでM2偏光効率を増加させます

以前の研究では、サイトカインIL-6へのマクロファージ暴露は、樹状細胞からマクロファージ表現型に単球分化をスキューするだけでなく、IL-6暴露はまた、M2マクロファージに関連付けられているmRNA発現プロファイルを増加させることが示されている（15,18）。 これらの知見を確認し、Ｍ１およびＭ２偏光に対するＩＬ−６の効果を試験するために、連続および段階的培養条件下でのヒトＣＤ１ ４＋単球を、ＩＬ−６の有無に M1分化細胞におけるM2マクロファージ表面マーカー発現の検査は、IL-6と培養したときに有意な変化を示さなかった（図2）、IL-6治療はM1偏光マクロファージ

逆に、連続および段階的なM2マクロファージ培養群の分析は、IL-6処理は、M2マクロファージ表面マーカーの発現を増加させることを明らかにした。 M2マクロファージ集団では、CD206とCD36の発現の両方が高いままであり、IL-6に曝されたときに変化しないように見えた（図2、AおよびB）。 しかし、CD163およびE-カドヘリンは、IL-6で処理した場合、表面発現レベルおよび集団均質性の有意な増加を示した（図2、CおよびD）。 これは、低発現ＣＤ１ ６ ３およびＥ−カドヘリンピーク（図２、ＣおよびＤの赤い矢印）の減少および結果として均質に高発現する集団へのシフトによって実証さ