操作されたCdkによるATP類似体の利用
我々は、ATP結合ポケットの保存されたかさばる残基にアミノ酸交換を含む変異体’Shokat’Cdkを生成した。 CDK2およびCDK3の場合、これはCDK2（F80A）と命名された位置80でのフェニルアラニンからアラニンへの交換であった。 我々はまた、設計されたCdkが組換え網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質をin vitroでリン酸化するためにこれらの類似体を使用できるかどうかを決定するために12のATP類似体を合成し、それらがN6-（2-フェニルエチル）-ATP（PE-ATP）を最も効率的に利用することを見出した（図1a、およびデータは示されていない）。 野生型とサイクリンE-CDK2（F80A）の両方がグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）-Rbタンパク質をリン酸化するために通常のATPを使用していたが、唯一のF80AキナーゼはPE-ATPを使用することができた。 サイクリンE-CDK3でも同様の結果が得られたが、この場合、F80A変異体は通常のATPを使用できなくなったが、この観察の構造的根拠は不明である（図1a）。 これらの研究は、野生型および操作されたキナーゼが所望のATP特異性を示すことを確認した。
設計されたCdkの特性評価。 （ａ）サイクリンＥ−ＣＤＫ２／３複合体、またはそれらのＦ８ ０Ａ操作された対応物（アスタリスクによって示される）を、ＣＤＫサブユニット上のＨ ａ−タグを介して形質移入されたＵ２ＯＳ細胞溶解物から免疫沈降させ、正常なＡＴＰまたはＰＥ−ＡＴＰアナログのいずれかの１ ０μ Ｍでｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイに供した。 ＧＳＴ−Ｒｂのリン酸化を、リン特異的抗ＰＳ７ ８ ０−Ｒｂ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による免疫ブロッティングによってモニターした。 野生型キナーゼはPE-ATPを使用できません。 （b）薄層クロマトグラフィー-分析は、細胞溶解物中のATPの加水分解とアクセプターヌクレオチドへの移動を明らかにする（左）。 遊離リン酸とATPの位置が示されている。 対照的に、ATP-γ-Sは細胞溶解物中で加水分解されない（右）。 (c)キナーゼアッセイは、200μ mのATP、ATP-γ-SおよびPE-ATP-γ-Sの存在下で大腸菌とGST-Rbから精製された野生型およびサイクリンA-CDK2(F80A)複合体を用いて室温で2h.キナーゼ反応をSDSゲル電気泳動によって分析し、クーマシー染色によって可視化した。 ＧＳＴ-Ｒ ｂのリン酸化の程度はｇｓｔ-Ｒ ｂの電気移動シフトによってモニターされた。
変異体CDKsがin vitroでRbをリン酸化するためにPE-ATPを効率的に使用したのに対し、細胞溶解物中の放射性標識PE-ATPを利用した同様の実験は、標識されたリン酸塩が溶解物中のAtpアーゼ活性によってPE-ATPから切断されたために失敗した（データは示されていない）。 したがって、我々は、溶解物によって加水分解されなかったATPアナログ（PE-ATP-γ-S）のチオリン酸形態に切り替えた（図1b）。 キナーゼは通常のATPよりもATP-γ-Sを効率的に使用することが多いが、チオホスホリル化にはこの文脈でいくつかの利点がある。 第一に、チオリン酸塩はより安定であり、ホスファターゼに対して耐性である。 第二に、細胞内に既存のチオホスホリル化イベントがないので、チオホスホリン酸ラベリングは、変異キナーゼによってリン酸化タンパク質のためのユニークなマーカーを提供します。 最後に、チオリン酸基は、スルフヒドリル基と同様の化学的性質を有し、化学修飾に従順である。 我々は発現し、細菌から可溶性野生型およびサイクリンA-CDK2（F80A）複合体を精製し、PE-ATP-γ-Sを使用する能力をテストするために同様のRbキナーゼアッセイ 図1cに示すように、両方のキナーゼはATPまたはATP-γ-Sを使用してGST-Rbタンパク質をリン酸化することができますが（その電気移動性シフトによって示
チオホスホリル化ペプチドのシングルステップ精製
設計されたCdkとATP類似体の使用は、高度に特異的な基質のリン酸化を容易にする：次の課題は、複雑なライセート内でそれらを識別する方法です。 我々は、共有結合的にリン酸化と溶解物の消化後にチオホスホリル化ペプチドをキャプチャし、豊かにチオホスホリン酸タグを利用しようとした。 しかし，チオホスホペプチドとシステイン含有ペプチドを化学的に区別することが重要な問題であった。 チオホスホペプチドを濃縮するための化学選択的方法が記載されているが、複雑なタンパク質混合物中のシステイン残基の圧倒的な豊富さは、こ 我々は、選択的にトリプシン化細胞溶解物（図2a）内のチオホスホリル化ペプチドを単離するために、簡単な捕捉-放出法を使用しました。 ライセート内のタンパク質は、サイクリンA-CDK2（F80A）とPE-ATP-γ-Sでin vitroでリン酸化されたタンパク質混合物は、その後消化され、得られたペプチドは、チオ 従来のジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶出は両方のタイプの結合ペプチドを放出するので，樹脂結合チオりん酸ペプチドとシステイン含有ペプチドとの間の定性的な違いをホスホロチオラートスルフィド結合とアルキルジスルフィド結合で利用した。 高いpH値では、ホスホロチオラートスルフィド結合が加水分解され、アルキルジスルフィドはそのまま残る。 強塩基（水酸化ナトリウムなど）で樹脂を処理すると、ホスホロチオレートスルフィド結合を加水分解することにより、チオホスホペプチドを特異的に放出する（また、システイン含有ペプチドに変換する）が、システイン含有ペプチドは放出されない（図2b）。 システインを介して結合したペプチドは最終段階で溶出されないため，システイン含有チオホスホペプチドを回収することはできない。 さらに、溶離は、チオホスホペプチドをホスホペプチドに変換することによってチオホスホネート署名の損失をもたらす。 チオホスホペプチド単離法は，Ｂｌｅｔｈｒｏｗらの単離法とは微妙に異なる。 アルキル化（ヨードアセトアミド樹脂）の代わりにジスルフィド交換化学（ジスルフィド樹脂）を用いてチオホスホペプチドを捕捉し，酸化ではなく塩基加水分解で選択的に溶出することを示した。
チオホスホペプチドのシングルステップ精製。 (a)チオホスホペプチド単離のための一般的なスキーム。 タンパク質は、サイクリンA-CDK2（F80A）とPE-ATP-γ-Sで標識し、トリプシン消化に供した。 得られたペプチドをチオホスホペプチドとシステイン含有ペプチドの両方を捕捉するジスルフィドビーズと混合した。 ビーズを塩基性溶液で処理し，ホスホペプチドのみを選択的に放出した。 (b)チオホスホペプチド選択性の基礎となる化学。 チオリン酸とシステインの両方の部分は、ジスルフィドビーズによって共有結合的に捕捉することができる反応性チオール基を含む。 高いpH値では、phosphorothiolatesulfide連結（上の矢印の近く）は、アルキルジスルフィド連結（下の矢印の近く）が安定している間、ビーズ結合ペプチドの放出を可能にするために加水分解され、したがってペプチドはビーズ上に保持される。 なお、ホスホロチオラートスルフィド結合の加水分解の際に、チオリン酸は通常のリン酸に変換される。このアプローチの実現可能性をテストするために、我々はサイクリンA-CDK2（F80A）とPE-ATP-γ-SでGST-Rbをリン酸化し、反応混合物のトリプシンダイジェストに精製手順を適用した。 分離したペプチドをイオントラップ質量分析計を用いたエレクトロスプレー-タンデム質量分析（ＥＳＩ-Ｍ Ｓ／Ｍ ｓ）により分析した。 ペプチドは、sequestソフトウェアを使用して（GST-Rb配列を追加した）ヒトタンパク質配列データベースにタンデム質量スペクトルを一致させることによ ＧＳＴ-Ｒ ｂ基質は五つのシステインと七つのＳＰ／ＴＰ部位を含み，これらはＣＤＫのリン酸化に好ましい部位である。 我々は、予想されるすべてのリン酸化部位のみを含む複数のホスホペプチドを回収した（表1）。 さらに，システイン含有ペプチドは回収されず，非特異的ペプチドはほとんど回収されなかった。 これは私達の大規模な試金に主義の証明を提供した。
細胞溶解物中のヒトサイクリンA-CDK2基質の同定
私たちの目標は、細胞溶解物上の潜在的なサイクリンA-CDK2基質を同定することでした。プロテオーム-ワイドスケール。 サンプルの複雑さを軽減するために、我々はイオン交換クロマトグラフィーと硫酸アンモニウム沈殿（追加のデータファイル1）を使用して11画分にHEK293細胞 次に，各画分についてｉｎｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。 陽性対照として、各反応に少量のＧＳＴ−Ｒｂを添加した。 反応混合物をトリプシンで消化した後，ペプチド混合物からチオホスホペプチドを単離するために精製プロトコルを適用した。 回収したペプチドを液体クロマトグラフィー-Ｍ ｓ／ＭＳ分析およびデータベース検索に供した。 我々は、溶解物画分（追加データファイル2）のそれぞれからペプチドと少なくとも一つのRbホスホペプチドの様々な数を回収した。
CDKsはセリンまたはスレオニンのいずれかにプロリン指向の方法でタンパク質をリン酸化し、モチーフS/T-P-X-R/KがCDKコンセンサスモチーフを表すという考えを支持する多くの研究がある。 ホスホペプチドから我々は203タンパク質の合計を同定した：180候補は、SPまたはTPモチーフ（プロリン指向;追加のデータファイル3）内でリン酸化された。 これらの候補基質は、細胞周期制御、DNAおよびRNA代謝、翻訳および細胞構造を含む広範囲の生物学的プロセスを表す（図3）。 プロリン指向部位の96のうち222（43％）の合計は、（+3位に正に帯電した残基を有する）既知のCDKコンセンサスに準拠していました。 興味深いことに、プロリン指向のサイト（53/222）の約24％は、このモチーフはまた、CDK2によって好まれるかもしれないことを示唆し、+4または+5の位置のいず 実際、Ｂｌｅｔｈｒｏｗ ｅ ｔ ａ ｌ． また、サイクリンB-CDK1基質の実質的な数は、非コンセンサスサイトを含むことに留意した。 非コンセンサス部位を含むペプチドについては、対応するタンパク質の約50％が少なくとも一つのK/Rxl ΦまたはK/Rxlx Φモチーフ（φは大きな疎水性残基であり、Xは任意のアミノ酸である）をリン酸化部位の遠位に運び、それらのほとんどすべてが少なくとも一つの最小RXLモチーフを運んでいることがわかった（追加データファイル3）。 これは、これらのモチーフは、基質へのサイクリンA-CDK2結合を促進することを十分に確立された考えと一致しています。 CDKコンセンサスモチーフとのリン酸化のために選択することに加えて、我々は以前にCDK基質として関与している28のタンパク質を同定した（追加のデータファイル3で太字でマークされている）。 したがって、私たちの候補のほぼ15％が以前にCDKターゲットとして発見されており、さらに私たちの方法がcdk2基質のために捕獲され、濃縮されているとい 最後に、我々が発見したリン酸化の43％は、以前にこれらのリン酸化は、ライセート条件で私たちに限定されないことを示す、大規模なin vivoリンプロテオーム分析
機能カテゴリによるタンパク質の分類。 数字は、各カテゴリーで同定されたタンパク質を示す。
私たちの研究とBlethrowらによって報告された研究の両方。 同様のホスホペプチド単離スキームと関連するサイクリン-Cdkを使用し、我々は両方の研究によって明らかにされた基板に実質的な重複があるかもしれ 実際、サイクリンA-CDK2候補のリストにサイクリンB-CDK1基質のほぼ50％（30/68）が見つかりました。 しかし、二つのリストの間にも実質的な違いがあり、これらはおそらく手続きの違い、異なる細胞型、MSによる不完全なペプチド同定、およびサイクリンおよび/またはキナーゼサブユニットによって付与された基質特異性を含む多くの要因に起因する。 これらの違いのいくつかはまた、サイクリンA-CDK2とサイクリンB-CDK1の異なる生物学的機能を反映している可能性があります。 例えば、タンパク質翻訳および/またはリボソーム機能に関与する九つのタンパク質を発見したが、これらのタンパク質のどれも、それらの比較的高い
我々は、既知のCDK2基板の数を同定したが、我々はいくつかの以前に記載されたCDK2基板を同定しませんでした。
我々は、既知のCDK2基板の数 上記の要因のいくつかはまた私達の分析の知られていたCDK2基質を見つける失敗を説明するかもしれません。 さらに、内因性Ｃｄｋによって既にリン酸化された基質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでチオホスホリル化されていないであろう。 いくつかのタンパク質は、溶解物調製および/または超音波処理工程中に可溶化されず、我々の分析から除外されなかったことも可能である。 最後に、大きなタンパク質複合体は、キナーゼ反応の前に分画手順によって破壊されている可能性があり、これらの複合体の文脈でのみCDK2によってリン
また、サイクリンAおよびCDK2に対応する四つのホスホペプチドと、非プロリン指向部位を有する27の追加のホスホペプチドを回収した（追加データファイル5）。 我々は、これらのホスホペプチドは、サイクリンA-CDK2の自己リン酸化と他のキナーゼによる背景リン酸化に起因する疑いがあり、他の人が同様の背景リン酸化を報告している。 これらの可能性を試験するために、サイクリンA-CDK2（F80A）およびPE-ATP-γ-Sを用いて対照キナーゼ反応を行い、細胞溶解物を添加せずに、四つのサイクリンA-CDK2ペプチッドのうち三つを回収した（追加データファイル5）。 さらに、我々はγ-32P-ATPの存在下で同様の”キナーゼのみ”反応を行ったとき、我々は用量依存的にこれらのタンパク質の両方に32Pの取り込みを観察した（追加 これらの実験は、元のアッセイでサイクリンA-CDK2の背景の自己リン酸化があったことを確認した。
サイクリンA-CDK2を添加せずに、ライセート画分、GST-Rb’spike-in’、およびPE-ATP-γ-Sを用いて対照キナーゼ反応を行った。 これらの”no-キナーゼ”制御反応は、7私たちのリスト（追加データファイル5）上の27非プロリン指向ホスホペプチドのリン酸化、これらのホスホペプチドのほ 例えば、これらのペプチドのほとんどは、カゼインキナーゼ2モチーフである酸性残基指向リン酸化部位を含む。 カゼインキナーゼ2は、ATPと同様にGTPを利用できるという点でユニークであり、したがって、活性部位は、PE-ATPなどのかさばるATP類似体を収容することがで 重要なことに、我々は我々のアッセイでは非特異的CDK活性がなかったことを示す、これらの対照実験から任意のRbホスホペプチドを回復しませんでした。 我々はまた、44の未修飾ペプチドを回収し、そのうち12はシステイン残基を含んでいた。 これらのペプチドの大部分は、いくつかのライセート画分に由来する（追加データファイル2）。 これらは厳しい洗浄条件にもかかわらずペプチドの樹脂への低レベルの非特異的結合に起因すると考えられ，システイン含有ペプチドの場合は溶出工程中のアルキルジスルフィド結合の少量の加水分解に起因すると考えられた。 要約すると、我々の方法は非常に選択的であり、我々の研究は、以前にCDKターゲットとして同定されていないそのほとんどが候補サイクリンA-CDK2基質の驚く
サイクリンA-CDK2ターゲットとして候補基質の検証
我々は、サイクリンA-CDK2基質として私たちのリスト内の新規候補のいくつかを検証す 私たちのタンパク質同定は、ペプチド配列に基づいていたので、我々はサイクリンA-CDK2がトランスフェクト293細胞（EF2、TRF2、およびRAP1）からエピトープタ これらのタンパク質はサイクリンB-CDK1リストに存在しなかったので、彼らはまた、サイクリンB-CDK1によってリン酸化されているかどうかを決定 各ＣＤＫ２候補は、サイクリンＡ−ＣＤＫ２およびサイクリンＢ−ＣＤＫ１の両方によってリン酸化されたが、ＥＦ２は、ＴＲＦ２またはＲＡＰ１のいずれかよりも低い程度までリン また、TRF2、RAP1、およびリボソームタンパク質RL12をGST融合として発現し、大腸菌からそれらを精製した。 サイクリンA-CDK2を用いてTRF2とRAP1をin vitroでリン酸化すると、タンパク質は高度にリン酸化され、MS分析により、これらのリン酸化が最初に同定されたのと同じ部位で起こっていることが明らかになった（図4b）。 また、サイクリンA-CDK2とサイクリンB-CDK1を用いてGST-RL12をリン酸化し、両方のCdkがrl12をin vitroでリン酸化することを見出しました（図4c）。 これらの研究は、したがって、我々のスクリーンで同定されたペプチドは、少なくともin vitroで、サイクリンA-CDK2によってリン酸化することができるタン 我々は、特定のタンパク質をリン酸化するサイクリンA-CDK2とサイクリンB-CDK1の能力の質的な違いを見つけたが、それぞれの場合に候補者は、両方のCdk 我々はこれらの研究で使用される酵素調製物は、遊離CDK2（F80A）の過剰が含まれていたので、我々はいくつかの基質のリン酸化は、単量体のいずれかであった、 我々は、これらの抽出物中のサイクリンB-CDK2（F80A）活性の量は、サイクリンA-CDK2（F80A）と比較して無視できることがわかった、と我々は任意のサイクリンE-CDK2（F80A）活性を検出することができませんでした（追加データファイル7）。 それにもかかわらず、我々はいくつかのペプチドは、内因性のサイクリンとの複合体でCDK2（F80A）によってリン酸化されている可能性を排除することはできず、CDK2を活性化する他のサイクリン対サイクリンAのための任意の候補基質の特異性は、以下に記載されているように検証する必要があります。
選択的候補CDK2基質のインビトロ検証。 （ａ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞を、ＦＬＡＧタグＥ Ｆ２、ＴＲＦ２、およびＲＡＰ１を発現するベクターで一過性にトランスフェクトした。 抗FLAG抗体免疫沈降物は、γ-32P-ATP（左上パネル）の存在下でサイクリンA-CDK2またはサイクリンB-CDK1でin vitroでリン酸化された。 並行反応では、ヒストンＨ１を対照としてリン酸化して、サイクリンＡ−ＣＤＫ２およびサイクリンＢ−ＣＤＫ１の活性を正常化した（右パネル）。 ‘C’は、トランスフェクトされた基質を含まない’キナーゼのみ’反応（左パネル）と’キナーゼなし’反応（右パネル）を示します。 タンパク質試料をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、ゲルをＰＶＤＦ膜上に移した。 オートラジオグラフィーによりホスホシグナルを可視化した。 続いて、膜を抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブして、ホスホシグナル担持バンド（左下のパネル）の同一性を確認した。 アスタリスクは、市販のサイクリンB-CDK2調製物からの非特異的バンドを表す。 （ｂ）キナーゼ反応は、野生型サイクリンＡ−ＣＤＫ２キナーゼの存在下または非存在下で、γ−３ ２Ｐ−ＡＴＰ、およびｇｓｔ−ＴＲＦ２、ＧＳＴ−ＲＡＰ１、ＧＳＴ−Ｒｂ（陽性対照）およびｇｓｔ（陰性対照）を基質とし 反応をＳＤＳ ＰＡＧＥによって視覚化し、続いてＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色およびオートラジオグラフィー（左パネル）を行った。 同様のキナーゼアッセイは、野生型サイクリンA/CDK2とATP-γ-Sを用いて行われ、その後、ホスホペプチド単離スキームに供された。 ＭＳ分析により、ＴＲＦ２およびＲＡＰ１がそれぞれ、ＲＡＰ１のための１つの追加の部位を有する画面から同定した正確な部位上でリン酸化されたことが確認された（右パネル）。 （ｃ）キナーゼアッセイは、精製されたＧＳＴ−ＲＬ１ ２の量を増加させるとともに、γ−３ ２Ｐ−ＡＴＰ、サイクリンＡ−ＣＤＫ２またはサイクリンＢ−ＣＤＫ１を用いて実施した。 試料をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（下部パネル）で染色し、続いてオートラジオグラフィー（上部パネル）を行った。 ‘C’は、トランスフェクトされた基質を含まない’キナーゼのみ’反応を示す。
vivocdk2基質としてRL12の検証
上記の研究は、in vitroでCDK2基質として私たちの画面で同定されたいくつかの新規候補 しかし、新規基質はまた、in vivoでCDK2によってリン酸化されているかどうかを決定するために、我々はリボソームタンパク質RL12のより包括的な分析を行 我々は、まず、エピトープタグサイクリンA-CDK2とrl12γ-32P-ATPの存在下でヒト細胞で発現したrl12の免疫沈降物を混合し、サイクリンA-CDK2がin vitroでRL12をリン リン酸化は、同定されたホスホセリンS38がアラニンに置き換えられた変異体RL12で大きく廃止され、S38がスレオニンに置き換えられたときに回復した（図5b）。 その後、ホスホペプチドマッピングを使用してS38を含むペプチドを同定し、IN vitroでCDK2によって直接リン酸化されたことを確認しました（図5c）。 RL12も同じサイトでCDK2依存的にin vivoでリン酸化されているかどうかをテストするには、我々は代謝32P-オルトリン酸塩と細胞を標識し、免疫沈降野生型ま 我々は、適切な抗RL12抗体の欠如のために内因性RL12リン酸化を研究することはできませんので、これらの研究は、in vivoで異所性RL12のリン酸化を調べた（これらのトランスフェクション条件は、RL12mRNAの約五から十倍の過剰発現につながった（追加のデータファイル8）。 本発明者らは、野生型RL12が、RL12-S38Aではなく、in vivoでリン酸化されていることを見出した（図5d）。 このリン酸化は、サイクリンE-CDK2を過剰発現する細胞で強化されたが、不活性なサイクリンE-CDK2ではなく、（内因性サイクリンCdkを阻害する）p21CDK; 図5d)。 最後に、標識された細胞から免疫沈降したRL12タンパク質のホスホペプチドマッピングとホスホアミノ酸分析を使用し、in vivoでのサイクリンE-CDK2によるrl12リン酸化もS38で発生したことを確認した（図5e）。 In vivoでのRL12S38リン酸化は、ホスホプロテオーム研究でも報告されている。
in vitroおよびin vivoでのRL12のリン酸化。 （ａ）Ｈ Ａタグ付きＲＬ１ ２またはベクター対照（「ｖｅｃ」）を、Ｕ２ＯＳ細胞に一過性にトランスフェクトし、１ ２ＣＡ５抗体を用いて免疫沈降させた。 サイクリンA-CDK2複合体も一過性U2OS細胞で別々に発現し、サイクリンaに対する抗体を用いて免疫沈降したキナーゼアッセイは、γ-32P-ATPの存在下でサイクリンA-CDK2免疫沈降の有無にかかわらず、RL12（またはコントロール）免疫沈降を用いて行われた。 （ｂ）野生型（ｗ Ｔ）および示されたＲＬ１ ２ホスホサイト変異体を含有するサイクリンＡ−ＣＤＫ２およびＲＬ１ ２免疫沈降物を用いて同様のアッセイを実施した。 星印は抗体の軽鎖を示す。 （ｃ）Ｒｌ１ ２の放射性標識された野生型（左パネル）およびＳ３ ８Ｔ変異体（右パネル）のホスホペプチドマッピングおよびホスホアミノ酸分析。 （ｄ）野生型ＲＬ１ ２、ＲＬ１ ２−Ｓ３ ８Ａ、またはベクター対照を、サイクリンＥ−ＣＤＫ２、触媒的に不活性な（ｄ Ｎ）サイクリンＥ−ＣＤＫ２、またはｐ２ １と一過性に共トランスフェク すべての細胞を32Pオルトリン酸標識に供した。 RL12は、細胞溶解物から免疫沈降し、オートラジオグラフィーに続いてSDS PAGEによって可視化された。 (e)ホスホペプチドマッピング解析は、(d)に示す放射性標識RL12についても行った。 下の矢印は、in vivoで検出された第二およびマイナーなリン酸化部位を示しています。
我々は、全長タンパク質がCDK2によってリン酸化されていることを示すことによって、これまでに試験した新規候補のそれぞれを検証しているが、私たちのリスト上のいくつかの候補は、おそらく生理学的に関連するサイクリンA-CDK2基質ではないことを証明するだろう。 例えば、キナーゼ反応は溶解物中で行われ、in vivoでの細胞内区画化は、いくつかの候補へのCDK2のアクセスを制限する可能性がある。 さらに、他の細胞キナーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏで個々の基質に関してＣＤＫ２と重複するか、またはＣＤＫ２よりも重要である可能性がある。 したがって、候補者ができるだけ生理学的な文脈で厳密に評価されることが重要です。 この目的のために、進行中の研究では、内因性遺伝子中のこれらのリン酸化部位のサブセットを変異させ、その生理学的意義を研究する遺伝子ターゲテ
