結果
我々は最初にCD63とh、K-ATPaseは、胃の壁細胞の同じ細胞内コンパートメントに存在するかどうかを評価しました。 以前の研究では、ラットの頭頂細胞が高レベルのCD63を発現することが示されている（22）。 ラット胃の凍結切片上の免疫蛍光顕微鏡観察は、CD63が頭頂細胞を含むラット胃の大部分の細胞に存在することを示している（図10B）。 1A）。 CD63は頭頂細胞においてHKaと部分的に共局在する。 さらに，豚の胃からの高度に精製されたＴＶＥ調製物（岡本Ｃ．Ｔ．からの親切な贈り物）を分析した。 H、K-ATPaseは、同様の調製物中のタンパク質含量の50％以上に寄与する（23）。 ウェスタンブロット分析は、ＣＤ６ ３がＴｖｅｓのこの精製された調製物中に豊富に存在することを示している（図１ ０Ａ）。 1B）。
CD63およびH、K-ATPaseの壁細胞における局在化および会合。 （Ａ）抗Ｈｋａ ＰＡｂ（緑色）および抗ＣＤ６ ３ｍＡｂ（赤色）と共染色されたラット胃凍結術。 （スケールバーは50μ mです。（Ｂ）２ ７％（６μ ｇ）および３ ２％（１ ４μ ｇ）ショ糖界面からのＴＶＥ試料を、抗Ｈ Ｋ Β ｍａｂまたは抗ＣＤ６ ３ｍａｂで免疫ブロットした（３ ５）。 (C)抗Hk Β mAbまたはビオチン化トマトレクチンでブロットした豚Tvs(13.3μ g)の精製調製物。 （Ｄ）精製Ｔｖｅを、２％ＣＨＡＰＳ（Ｃ Ｈ）または１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０（Ｔ Ｒ）溶解緩衝液中でインキュベートした。 Ｔｖｅｓはビオチニル化トマトレクチンと前結合した（＋レクチン）または（–レクチン）ではなかったストレプトアビジンビーズとインキュベートした。 沈殿させた物質を抗ＣＤ６ ３ｍＡｂで免疫ブロットした。 レーン標識されたＴＶＥ溶解物は、２ ５μ ｇの溶解物を含有する。
CD63とH、K-ATPaseの間の可能なin situ相互作用を調べるために、我々はビオチニル化トマトレクチンを用いたプルダウン実験を行った。 これまでの研究では、このレクチンが胃製剤中のHk Βに特異的かつ一意に結合することが示されている（24-27）。 抗Ｈ Ｋ Β ｍａｂおよびビオチン化トマトレクチンでＴＶＥ調製物をブロッティングし、レクチンがグリコシル化Ｈ Ｋ Βと特異的に結合することを確認した（図１）。 1C）。 その後、ビオチン化トマトレクチンを使用して、TVE調製物中のHk Βと相互作用するタンパク質を単離した。 ウェスタンブロット分析は、ＣＤ６ ３がトマトレクチンによって沈殿することを示している（図１）。 ＣＤ６ ３およびＨ，Ｋ−Ａｔｐａｓｅがｉｎ ｓｉｔｕで会合することを実証し、この会合が生理学的に関連し得ることを示唆している（図１Ｄ）。 ＴＶＥ調製物を４％ＳＤＳで前処理し、続いて溶解緩衝液中で２ ０倍希釈し、沈殿させたＣＤ６ ３の量を有意に減少させた。 沈殿させたＨ Ｋ Βの量は、この処理によって変化しなかった（データは示されていない）。 これらのデータは、プルダウンにおけるCD63の存在は、Hk Βとの関連に起因するものであり、CD63とトマトレクチンとの間の直接の関連に起因するものではないことを示唆している。
CD63とHk Βとの間の相互作用の機能的意義をさらに調べるために、我々は単独で、またはフラグタグ付きCD63構築物（CD63-FL）をコードするcDNAと一緒にウサギHk ΒをコードするcDNAとCOS-7細胞をトランスフェクトした。 本発明者らは、Hk ΒがトランスフェクションCOS細胞の細胞表面に到達するためにHk Αと集合する必要がないことを実証した（20）。 我々は、CD63のC末端は、このテトラスパニン（13）の細胞内輸送のために必要とされるチロシンベースのモチーフが含まれているため、そのN末端にフラグエピトープタグを運ぶCD63コンストラクトを使用しました。
HK ΒおよびCD63-FLと共感染したCOS細胞を、抗FLAG pAbを用いて免疫沈降させた。
HK ΒおよびCD63-FLと共感染したCOS細胞を、抗FLAG pAbを用いて免疫沈降させた。 免疫沈降された物質のウェスタンブロット分析は、Ｈ Ｋ ΒがＣＤ６ ３と共沈することを示す（図１ ０Ａ）。 2、Hk≤+CD63-FL）。 CD63-FLおよびHk Βタンパク質は、2%CHAPS、1%Brij96、および1%Triton X-100を含む様々な界面活性剤中で共免疫沈降する。 CD63とHk Βとの間の関連付けは、トリトンX-100で可溶化を存続し、したがって、直接の相互作用を表す可能性が高い記載されているいくつかのテトラスパニン錯体の一つを構成する（28）。 Βサブユニットには、複雑な炭水化物で修飾されたβ m（成熟）と、高マンノース炭水化物で修飾されたβ c（コア）の2つの形態があります（29）。 両方の形態はCD63と共沈するが、沈殿物中のσ cとσ mの比は可溶化条件の関数として変化する。
Hk ΒはCD63と共沈する。 ＣＯＳ細胞を、Ｈｋ Β単独、ＣＤ６ ３−ＦＬ単独、またはＨｋ ΒおよびＣＤ６ ３−ＦＬ（Ｈｋ Β＋ＣＤ６ ３−ＦＬ）でトランスフェクトした。 細胞を、２％ＣＨＡＰ、１％Ｂｒｉｊ９ ６（Ｂ ｒ）、または１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０（Ｔ ｒ）中で溶解し、抗ＦＬＡＧ ＰＡＢで免疫沈降させた。 第二のレーンは、ＣＤ６ ３−ＦＬおよびＨ Ｋ Βを別々にトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物の混合物から免疫沈降させた。 沈殿したタンパク質を、抗Ｈ Ｋ Β ｍａｂまたは抗Ｌａｍｐ−１ｍａｂでブロットした。
HK Βは、HK Βのみをトランスフェクトした細胞で行われたFLAG免疫沈降では検出されず、FLAG pAbがβサブユニットと相互作用しないこ 2、HKß）。 Ｈ Ｋ Βは、ＣＤ６ ３−ＦＬおよびβ−サブユニットで単独で形質移入された細胞から調製された溶解物の混合物（５ ０：５ ０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）からＦＬＡＧ ＰＡＢと共免疫沈降せず、相互作用がインビボ 2、第二車線）。 ＦＬＡＧ ＰＡＢとインキュベートされた試料は、リソソームタンパク質Ｌａｍｐ−１を沈殿させず、ＣＤ６ ３−ＦＬとＨ Ｋ Βとの間の相互作用が特異的であり、ＣＤ６ ３コンパートメントの不完全な可溶化のアーチファクトではないことを示している（図１）。 2).
我々は、Hk ΒとCD63の間の相互作用がβサブユニットの細胞内局在に影響を与えるかどうかを調べた。 Ｈ Ｋ Βは、一過性に形質移入されたＣＯＳ細胞中の細胞表面に存在する（図１ ０Ａ）。 3A-C）。 ＣＯＳ細胞をＨ Ｋ ΒおよびＣＤ６ ３−ＦＬの両方と共感染させると、βサブユニットの細胞内ＣＤ６ ３含有小胞への顕著な再分布が存在する（図１ ０Ａ）。 3D-F）。 この変更されたローカライズは、CD63過剰発現の非特異的な効果である可能性を除外するために、我々はAQP4の分布にCD63発現の効果を調べた。 AQP4は、壁細胞の基底外側原形質膜に存在する水チャネルである。 これは、H、K-ATPase（と調節されたエンドサイトーシスとエキソサイトーシスを受けていない30、31）。 このチャネルは、共感染したＣＯＳ細胞のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０溶解物中でＣＤ６ ３−ＦＬと共免疫沈降しない（図１ ０Ａ）。 4A）。 共感染細胞を免疫蛍光共焦点顕微鏡によって可視化する場合、AQP4はCD63含有区画内には存在しない（図10B）。 細胞内小胞へのＣＤ６ ３誘導性再分配が、このテトラスパニンと相互作用するタンパク質に特異的であることを示す図４Ｂ）を参照のこと。
細胞内小胞への共局在は、CD63と相互作用するタンパク質に特異的である。 （Ａ）ＣＯＳ細胞を、ＡＱＰ４単独でトランスフェクトしたか、または、ＡＱＰ４およびＣＤ６ ３−ＦＬ（ＡＱＰ４＋ＣＤ６ ３−ＦＬ）と共トランスフェクトした。 細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０中で溶解し、抗ＦＬＡＧ ＭＡｂで免疫沈降させた。 免疫沈降された材料および細胞溶解物を抗AQP4pAbでプローブした。 （Ｂ）ＣＯＳ細胞を、ＡＱＰ４（緑色）またはＡＱＰ４およびＣＤ６ ３−ＦＬ（赤色）のいずれかでトランスフェクトした。 AQP4は抗AQP4pAbで検出され、CD63は抗FLAG mAbで検出された。 （スケールバーは10μ mです。Hk ΒのCD63を介した再分配のメカニズムを調査するために、我々はCD63の細胞内輸送を特徴としている最近の研究を利用しました。 Rous et al. (13)CD63の極端なC末端に存在するチロシンベースのモチーフは、アダプターサブユニットλ2とλ3と相互作用することを示した。 Β2タンパク質はヘテロテトラマー AP-2複合体のメンバーである。 この複合体は、原形質膜に存在し、それらのエンドサイトーシスを仲介する、クラスリンコートと貨物タンパク質をリンクしている（14）。 Β3タンパク質はヘテロテトラマー AP-3複合体のメンバーである。 この複合体はリソソーム標的化に関与し、トランスゴルジネットワークと部分的にエンドソームと共局在小胞コンパートメントの両方で発見されている（12）。 CD63のYEVMチロシンベースのモチーフがAEVMに変異すると、CD63はγ2またはγ3のいずれかと相互作用することができず、主に細胞表面上で発現される（13）。 Ｈ Ｋ ΒをＦＬＡＧタグＣＤ６ ３−ＡＥＶＭ構築物と共発現させると、ＣＤ６ ３−ＡＥＶＭおよびβ−サブユニットの両方が細胞表面上に分布する（図３）。 3G-I）。 したがって、Hk Βの細胞内分布は、CD63細胞質尾部内に埋め込まれた人身売買シグナルによって影響される。
CD63の尾部のYEVM配列がYEVIに変異すると、修飾されたモチーフはγ3と相互作用し続けますが、もはやγ2とは会合しません(13)。
CD63の尾部のYEVM配列がYEVIに変異すると、修飾されたモチーフはγ3と相互作用し続けます。 変更されたテトラスパニン蛋白質がゴルジ（13）を介して、その最初の生合成通過後にこのコンパートメントに直接移動するため、CD63-YEVIは、最も可能性が高 それはもはやγ2（13）と相互作用することができないため、原形質膜に到達したCD63-YEVIの小さな集団は、損なわれた内在化を示しています。 Ｈ Ｋ ΒおよびＦＬＡＧタグＣＤ６ ３−ＹＥＶＩ構築物がＣＯＳ細胞で共発現される場合、ＣＤ６ ３−ＹＥＶＩの多くは後期エンドソーム−リソソーム区画に局在するが、β−サブユニットは細胞表面上に残り、細胞内区画に再分配されない（図３）。 J–L）の3社で構成されている。 共免疫沈降分析は、Ｈ Ｋ ΒがＣＤ６ ３−ＹＥＶＩおよびＣＤ６ ３−ＡＥＶＭの両方に関連し得ることを確認する（データは示さない）。 これらのデータは、Hk ΒがCD63陽性細胞内コンパートメントに分布するためには、これらのタンパク質は、細胞表面で相互作用し、複合体としてエンドサイト
細胞内小胞で検出されたHk Βが細胞の表面からエンドサイトーシスされたタンパク質に対応するかどうかを決定するために、我々は外因性CD63発現の ＣＯＳ細胞を、Ｈ Ｋ ΒおよびＣＤ６ ３−ＦＬと共感染させた。 次いで、細胞を４℃に冷却してエンドサイトーシスを停止させ、表面をＨ Ｋ Β ｍＡｂで標識した。 標識された細胞を３ ７℃で４ ０分間インキュベートして、エンドサイトーシスを再開させた。 インキュベーション後、細胞を４℃に冷却し、表面をＣｙ５結合ヤギ抗マウスＩｇｇで標識した。 細胞を固定し、抗FLAG pAbとインキュベートし、フルオレセインイソチオシアネート共役ヤギ抗マウスIgGとローダミン共役ヤギ抗ウサギIgGの両方で標識した。 したがって、表面に残ったHk ΒはCy5チャネル上で可視化され、内部化されたHk Βはフルオレセインイソチオシアネートチャネル上で可視化され、CD63-FLはローダミンチャネル上で可視化された。 この分析は、内在化されたβ-サブユニットがCD63と共局在することを実証し、CD63と共局在化されたHk Βのプールが細胞膜からのエンドサイトーシスを介して誘導されることを示唆している（図10B）。 5E-H）。 ＣＤ６ ３を過剰発現しない細胞は、４ ０分インキュベーション後に、内在化されたβ−サブユニットがはるかに少ないことを示す（図１ ０Ａ）。 5A-D）。
Hk Βの内在化を定量し、さらにHk ΒとCD63が細胞の表面で会合することを確認するために、細胞表面ビオチン化実験を行った。
Hk Βの内在化を定量し、HK ΒとCD63が細胞の表面で会合することを確認した。 最初の実験では、COS細胞は、β-サブユニット単独でトランスフェクトし、4℃でビオチン-SS-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化された。 細胞を4℃に戻し、各時点から一つのプレートを膜不透過性還元剤MesNaへの暴露によって残りの細胞表面ビオチンを除去した。 細胞を溶解し、ストレプトアビジンビーズでインキュベートした。 ストレプトアビジンビーズに関連するタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、膜をＨ Ｋ Β ｍＡｂでプローブした（図３）。 6A）。 細胞表面上のβサブユニットの割合は、37℃の内在化が進行するにつれてかなり変化しない。 最初の１ ０分後、表面標識されたＨ Ｋ Βのごく一部が細胞の内部に隔離され、内面化されたＨ Ｋ Βに対する表面の比率は高いままである。 これらのデータは、CD63に関連付けられていないβサブユニットは、非常にゆっくりと内在化するか、内在化されるが、多くのトランスフェリン受容体のように、表面に戻って迅速にリサイクルされることを示唆している。
Hk Βの内部化は、CD63との関連によって強化されている。 (A)HK Β単独でトランスフェクトCOS細胞は、ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化し、内在化を可能にするために37℃でインキュベー 次いで、プレートを４℃に冷却し、各時点からの１つの皿（分単位）を、Ｍｅｓｎａストリップに供した。 ビオチン化物質をストレプトアビジン共役アガロースビーズで収集した。 三つの独立した実験を三重に行った。 （Ｂ）Ｈ Ｋ ΒおよびＣＤ６ ３−ＦＬと共感染したＣＯＳ細胞を、上記のようにＭｅｓｎａストリップの有無にかかわらずビオチン化した。 全ての細胞を２％ＣＨＡＰ中で溶解し、抗ＦＬＡＧ ＰＡＢで免疫沈降させた。 免疫沈降物を溶離し，ストレプトアビジン共役アガロースビーズでインキュベートした。 四つの独立した実験を行った。 各時点からの試料を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび抗Ｈ Ｋ Β ｍＡｂによるイムノブロッティングによって分析した。 （右）各バンドからの信号強度を濃度測定法により定量した。
次に、CD63に関連するHKßの動作を特徴付けることを試みました。 ＣＯＳ細胞を、Ｈ Ｋ ΒおよびＣＤ６ ３−ＦＬと共感染させた。 細胞を上記のようにビオチン化し、除去した。 CD63に関連付けられているHk Βの集団を単離するために、細胞溶解物は、フラグpAbとタンパク質a共役アガロースビーズとインキュベートしました。 免疫沈降された材料を、３％ＳＤＳを含有する少量の緩衝液で溶出し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０で３ ０倍に希釈し、ストレプトアビジンビーズでインキュベートした。 ストレプトアビジンビーズに関連するタンパク質は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離され、Ｈ Ｋ Β ｍＡｂでプローブされた（図１ ０Ａ）。 6B）。 ストリッピングプロトコルに供されなかった細胞のために、このウェスタンブロットで検出された信号は、小胞に内在化されていた原形質膜と複合体にまだあった複合体を含むCD63に関連付けられている表面標識されたβサブユニットの総プールを表します。 ストリッピングプロトコルに供された細胞のために、シグナルは、ビオチン化中に細胞表面に存在し、その後内在化され、MesNaストリップから保護されたCD63
0分時点で、ビオチン化Hk Βは容易にHk ΒとCD63が細胞表面で会合することができることを実証し、非トリップ細胞から抗FLAG免疫沈降物で検出されます。
0分時点で回収されたビオチン化Hk Βのすべては、MesNaストリップに敏感です。 本発明は、ＰＲＯ２ ２ ４、ＰＲＯ９ ７ ８ ３、ＰＲＯ１ １ ０ ８、ＰＲＯ３ ４ ０ ０ ０、ＰＲＯ２ ４ ０、ＰＲＯ９ ４ ３、ｈｕＡ３ ３、ＰＲＯ２ ３ ０、ＰＲＯ１ ７ ８、ＰＲＯ１ １ ９ ９、ＰＲＯ４ ３ ３ ３、ＰＲＯ１ ３ ３ ６、ＰＲＯ１ ９ ５ ９ ８、ＰＲＯ１ ０ ８ ３、ｈｕＴＲＰＭ２又はＰＲＯ１ ８ ０ １ポリペプチド、ＰＲＯ２ ２ ４、ＰＲＯ９ ７ ８ ３、ＰＲＯ１ １ ０ ８、ＰＲＯ３ ４ ０ ０ ０、ＰＲＯ２ ４ ０、ＰＲＯ９ ４ ３、ｈｕＡ３ ３、ＰＲＯ２ ３ ０、ＰＲＯ１ ７ ８、ＰＲＯ１ １ ９ ９、ＰＲＯ４ ３ ３ ３、ＰＲＯ１ ３ ３ ６、ＰＲＯ１ ９ ５ ９ ８、 これらの知見は、CD63に関連付けられているβサブユニットが内在化され、細胞表面に戻らないことを示唆している。
