結果
制御されたタンパク質分解を介して細胞p107レベルの変調によって細胞タンパク質の機能的複雑 我々は以前に内因性p107、Scf Β Trcpの天然基質ではないタンパク質のRBファミリーのメンバーは、hpvオンコプロテイン、E7（E7N）のN末端35–aa残基から派生したp107結合ペ しかし、多くの細胞タンパク質の機能は、単にその存在または不在によってではなく、細胞内の豊富さによって決定される。 これまでのところ、哺乳類細胞の細胞内タンパク質レベルを正確に調節するための信頼できる方法はなかった。
我々は最初にp107レベルが体系的にβ trcp-E7Nの異なる量の制御された発現を介して減少させることができるかどうかを調べた。ヒトC33A子宮頸癌細胞は、β trcp-E7Nまたは対照アデノウイルスを24時間投与する組換えアデノウイルスの用量を増加させて感染させた。 全レシピエント細胞におけるアデノウイルスによって運ばれたＧＦＰの発現によって判断されるように、使用された最低用量でさえ、感染は１ ０ ０％であった（ 図に示すように。 Ｃ３ ３Ａ細胞を１ ０、３ ５、および８ ０のｍｏｉで組換えβ ＴＲＣＰ−Ｅ７Ｎアデノウイルスで形質導入したとき、内因性ｐ１ ０ ７レベルは、定常状態レベルの７ ８％、２ ５％、および５％に系 従って、設計されたScf Β Trcp-BPは生物的活動に対する適量の効果を試金するための定義されたレベルでターゲット蛋白質の全面的な量を減らす簡単で、再生可能な手段を提供する。
F-TrCP-E7N.C33A細胞による内因性p107の系統的な減少は、組換えAd-F-TrCP-E7Nアデノウイルスの用量を増加させて48時間感染させた。 内因性p107、サイクリンA、Cdk2、およびβ-アクチン（ロードコントロール）のレベルは、それぞれの抗体と免疫ブロッティングによって検出され、F-TrCP-E7Nの発現の用量依存的な増加と比較して。
P107は、増殖細胞における高親和性結合部位を介してサイクリンAおよびCdk2と安定的に会合する（13-15）。 これらのp107関連タンパク質もβ trcp-E7Nによる標的化分解に供されるかどうかを調べるために、免疫ブロッティングは、Ad-F-TrCP-E7Nウイルスに感染したc33A細胞において行われた。 図に示すように。 P107は劇的にダウンレギュレートされたのに対し、1、内因性サイクリンAとCdk2レベルは、変更されていないままでした。 さらに、非標的化β−アクチンのレベルは、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎによって影響されなかった（図１ ０Ｂ）。 1). この結果は、設計されたσ trcp-E7Nユビキチン–タンパク質リガーゼは、特異的に標的基質p107ではなく、その関連タンパク質を分解する強力な証拠を提
標的タンパク質の特定の翻訳後修飾された亜集団の選択的分解。
標的タンパク質の特定の翻訳後修飾された亜集団の選択的分解。 リン酸化などの翻訳後レベルでの細胞タンパク質の修飾は、細胞が機能を調節するか、またはタンパク質の新しい活性を付与するために用いる基本 特定の翻訳後修飾イベントに関連付けられた関数を解析するための実験ツールは現在制限されています。 タンパク質ノックアウトは、ターゲットタンパク質を直接認識する翻訳後レベルで動作するため、一つのアプリケーションではなく、全体の集団を破壊す
HPV16E7は、RB(16)の低リン酸化形態に選択的に結合することが見出された。 我々は、キメラβ trcp-E7nユビキチン–タンパク質リガーゼは、ハイポと過リン酸化RBを区別し、分解のための唯一のハイポフォームを選択することができるか ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上でのそれらの異なる電気泳動移動度に基づいて、容易に同定することができる両方の形態のＲＢを発現する（図１ ０Ａ）。 2a、レーン1）（17）。 これらの２つのＲＢ種の同一性は、低リン酸化型または高リン酸化型のＲＢに特異的な抗体を用いた免疫ブロッティングによってさらに検証された（図 ２ａ、レーン２およびレーン３）。 U2OS細胞は、組換えAd-F-TrCP-E7Nまたは対照Ad1アデノウイルスに48時間感染し、RB-PとRBの定常状態のレベルは、両方のフォームを認識する抗RBモノクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによって同時に分析した。 Ｅ７Ｎの低リン酸化ＲＢへの優先的結合と一致して、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎの異所性発現は、低リン酸化ＲＢの排除をもたらしたが、高リン酸化ＲＢ−Ｐは無傷のままであった（ 2B上部、レーン4-6とレーン1-3を比較してください）。 この結果は、ターゲットタンパク質の特定の翻訳後修飾の状態に基づいていた分解のためのRBの特定の亜集団を選択する際に設計されたF-TrCP-E7N
U2OS細胞におけるRBの低リン酸化形態の選択的分解。 (A)U2OS細胞は、低リン酸化型と高リン酸化型の両方のRBを含んでいます。 両方のＲＢ形態（ｌａｎｅ１）（ＩＦ８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を認識するか、またはハイポ−（ｌａｎｅ２）（Ｇ９ ９−５ ４ ９、Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または過リン酸化ＲＢ（ｌａｎｅ３）に特異的な抗体を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞抽出物中のＲＢを検 細胞抽出物を調製し、ＲＢ、ｐ１ ０ ７、ＦＬＡＧ（Ｍ２）、ｐ２ １ｗａｆ１、ｐ２ ７ｋｉｐ１、およびβ−アクチンに対する抗体で免疫ブロットした。完全長HPV16E7はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤P21WAF1およびP27KIP1と相互作用する可能性があるが、結合ドメインはE7Nフラグメント（残基18-20）の代わりにC末端ドメイン（残基40-98）にマッピングされた。 Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎの特異性をさらに調べるために、同じＵ２ＯＳ細胞抽出物を、ｐ２ １ＷＡＦ１およびｐ２ ７ＫＩＰ１に対する抗体を用いてプローブした。 図に示すように。 図2B(中央)では、p21waf1およびp27kip1の定常状態レベルは変更されていませんでした。 一緒に取られて、設計されたF-TrCP-E7Nは、RBファミリータンパク質に向かってタンパク質分解特異性を示したが、Cdk2、サイクリンA、p21waf1、およびp27kip1
構造ベースの変異誘発は、非常に特異的なβ trcp-E7Nユビキチン-タンパク質リガーゼを生成します。 キメラβ trcp-E7Nは、IkB、β-カテニン、およびATF4（3-7）を含む内因性β trcp基質を結合することがまだ可能である。 Β trcp-E7Nの過剰発現は、これらのネイティブ基板の分解を妨げる可能性があります。 逆に、β trcp-E7Nへの内因性基質の結合は、ユビキチン共役酵素からユビキチンを受け入れるように意図された基質の適切な位置を妨害し、したがって、標的化された分解の効率を低下させる可能性がある（図。 3）。 さらに、β ｔｒｃｐは擬似基質ｈｎｒｎｐ-Ｕと相互作用し、これはβ ｔｒｃｐおよびその誘導体を核内で結合させ、基質との相互作用を排除する（21）。 Β-カテニン、IkB、またはhnRNP-Uへの結合を排除するためにβ trcp上のアミノ酸残基の特異的変異を導入することにより、我々は特異性だけでなく、意図された基質をリクルートするために設計されたβ trcp-E7Nの可用性を向上させることが期待される（図。 3）。
エンジンβ trcp-E7Nユビキチン-タンパク質リガーゼ上の基質結合残基の構造ベースの変異誘発。 （Ａ）予測されたＳｃｆ Β Ｔｒｃｐ−ＢＰ／Ｉ Κ Ｂ／ｔａｒｇｅｔおよびＳｃｆ Β Ｔｒｃｐ（ｍ１）−ＢＰ／ｔａｒｇｅｔ複合体の概略図。 BP、結合ペプチド;T、標的。 (B)θ trcpのWD40繰り返しの三次元モデル。 正電荷を帯びた5つの残基はシアンである。 (C)修飾されたF-TrCP(m1)-E7Nユビキチン–タンパク質リガーゼはIkBに結合することはできませんが、p107との相互作用を保持します。 ＨｅＬａ細胞を、ｐｃＤＮＡ３（レーン１）、Ｆ−Ｔｒｃｐ（レーン２）、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ（レーン３）、およびＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎ（レーン４）と共に、Ｉｋｂで一過性にトランスフェクトし、ＭＧ１ ３ ２ｆｏｒ２ｈａｎｄで処理した後、ＴＮＦ−αで１ ５分間 細胞抽出物は、抗FLAG（M2）抗体で免疫沈降のために調製し、リン酸化IkB抗体または抗p107ポリクローナル抗体のいずれかでプローブした。 Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎは、まだ決定されていない理由のためにＳＤＳゲル上の二重項として移動する（レーン４）。 （Ｄ）Ｃ３ ３ａ細胞におけるＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎによるｐ１ ０ ７の効率的な分解。 示されたプラスミドおよび1μ gのpCMV-CD19をトランスフェクトしたC33A細胞は、免疫磁気選択によって富化され、内因性p107のレベルは、免疫ブロッ （Ｅ）個々のＣ３ ３Ａ細胞における一過性トランスフェクションおよびＦ−Ｔｒｃｐ、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ、またはＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−ｅ７Ｎ（左）の発現に応答して、内因性ｐ１ ０ ７（中央）を検出するために間接免疫蛍光アッセイを実施した（矢印でマークされている）。 4’、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）でcounterstained細胞の同じフィールドの画像は、トランスフェクト（矢印でマーク）と未感染細胞の両方の核を識別するために示
β trcpの基質結合ドメインは、C末端領域に七つのWD40リピートを含み、WD40タンパク質（3-7）の間で保存されている典型的な七つのブレードのβプロペラ構造に折り畳まれている。 WD40タンパク質のβプロペラ構造の全体的な整合性は、その機能のために重要であるため、標準的な削除変異誘発アプローチは、おそらく総構造変化を しかし、WD40タンパク質の既知の結晶構造は、β trcp基質の結合に関与する表面残基を同定するために利用することができる。 構造ベースの突然変異誘発アプローチは、WD40関連タンパク質への結合に関与するWD40βプロペラの上面に存在すると予測される5つの正に荷電残基（R285、K365、R474、R521、およびR524）を同定および変異させるために設計された（図10B）。 3月(22) このアプローチは、PNAS webサイトのサポート情報として公開されているSupporting Methodsで詳細に説明されています。 また、図１ ０を参照。 図6に示すように、PNASのwebサイト上で支援情報として公開されています。 さらに、これらのＬｙｓ／Ａｒｇ残基の置換は、全体的なβ Ｔｒｃｐ構造を変化させない可能性が高い。
QuikChange multisite-directed mutagenesis kit(Stratagene)を使用することにより、これらの残基をGluに同時に変異させました。 Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎと命名されたこのＦＬＡＧタグ付き化合物変異体を、内因性（Ｉ Κ Ｂ）および意図された（ｐ１ ０ ７）ノックアウト標的の両方へのその結合について試験した。 HeLa細胞は、一時的にF-TrCP（m1）-E7NまたはF-TrCP-E7Nをトランスフェクトし、IkBおよびp107との相互作用は、共免疫沈降によって決定された。 Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮおよびＦ−Ｔｒｃｐは、リン酸化Ｉｋｂタンパク質と同様の親和性を示したが、化合物ｍ１突然変異は、Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎ結合を廃止した（図１）。 3Cミドル）。 対照的に、同様のレベルのｐ１ ０ ７が、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮまたはＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−ｅ７Ｎの免疫複合体において検出された（図３）。 3C下）、設計されたF-TrCP（m1）-E7Nユビキチン–タンパク質リガーゼは、意図された細胞標的を募集する上で完全に機能していることを示しています。 これらの結果は図１の構造予測と一致した。 さらに、図３Ｂに示すように、内因性基質認識のために重要なβ ＴＲＣＰ上のアミノ酸残基を定義する。操作されたF-TrCP（m1）-E7Nは、内因性p107を分解する際のその効力についてさらに分析された。
Ｃ３ ３Ａ細胞を、ＣＤ１ ９発現プラスミドと共に、Ｆ−Ｔｒｃｐ、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ、またはＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−ｅ７Ｎと共感染させた。 トランスフェクションの四十から八時間後、細胞を収穫し、抗CD19モノクローナル抗体に結合した免疫磁気ビーズを使用してトランスフェクションプラスミドを受けているもののために濃縮した。 内因性p107レベルは、その後、免疫ブロッティングによって決定された。 図に示すように。 図３Ｄでは、Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎの異所性発現は、内因性ｐ１ ０ ７レベルの９ ５％の減少をもたらしたが、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎについては、ｐ１ ０ ７の８ ２％の下方調節が観察された（図 3D上部、レーン4と3を比較してください）。 さらに、Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎの発現は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α誘導された天然のＳｃｆ Β ＴｒｃｐによるＩｋｂの分解、またはＳｃｆｓｋｐ２ユビキチン−タンパク質リガーゼによるｐ２ ７ｋｉｐ１の破壊 したがって、設計されたF-TrCP（m1）-E7Nの異所性発現は、内因性F-boxタンパク質によって共有されるコアSCFコンポーネント（Skp1、CUL-1、およびRbx1/Roc1）をスケルチ
標的化されたp107分解は、間接免疫蛍光アッセイによって個々のC33A細胞においてさらに評価された。
標的化されたp107分解は、間接 一貫して、ｐ１ ０ ７は、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮまたはＦ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−ｅ７Ｎを発現するＣ３ ３Ａ細胞において大部分根絶されたが、Ｆ−Ｔｒｃｐ単独では根絶されなかった（図１Ｂ）。 3E）。 集合的に、これらの結果は、内因性β trcp基質の結合部位を排除することにより、設計されたF-TrCP（m1）-E7Nユビキチン–タンパク質リガーゼは、意図されたター
効率的な基質募集のためのターゲティングペプチドとしての最小限の結合ドメイン。 基質募集の高い特異性を達成するために、他の細胞タンパク質の非特異的ターゲティングを最小限に抑えるために、我々はLXCXEモチーフ（23）にまたがるe7の残基21-29を包含するE7N（指定E7M）の最小p107/RB相互作用ドメインは、p107の効率的な結合と分解を達成することができるかどうかを試験した。 キメラユビキチン-タンパク質リガーゼは、β trcpとE7Mが共有結合gly-Serリピート（指定された10GS）の10コピーからなる柔軟な20-aaスペーサーによって一緒にリン Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮまたはＦ−Ｔｒｃｐ−１ ０ＧＳ−Ｅ７Ｍを一過性にＣ３ ３Ａ細胞にトランスフェクトし、内因性ｐ１ ０ ７へのそれらの結合を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１ ３ ２で処理した後に調製された抽出物中の免疫沈降によって評価し、この相互作用の結果としての分解を阻害した。 図に示すように。 Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮおよびＦ−Ｔｒｃｐ−１ ０ＧＳ−Ｅ７Ｍは、図４Ａ（レーン２および３）のように、Ｃ３ ３Ａ細胞における一過性トランスフェクションによるｐ１ ０ ７分解におけるそれら 図3Dに示すように。 図４Ｂに示すように、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７ＮおよびＦ−Ｔｒｃｐ−１ ０ＧＳ−Ｅ７Ｍは、ｐ１ ０ ７の９ ２％および９ ５％ダウンレギュレーションまで誘導され、これは、最小限のｐ１ ０ ７結合ドメインを担
E7の最小p107結合ドメインは、標的破壊のためにp107を募集するのに十分である。 （Ａ）設計されたＦ−Ｔｒｃｐ−１ ０ＧＳ−Ｅ７Ｍユビキチン−タンパク質リガーゼは、ｐ１ ０ ７に効率的に結合する。 一過性に示されたプラスミドでトランスフェクトC33A細胞は、プロテアソーム阻害剤MG132で2時間処理した。 細胞抽出物を、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降のために調製し、ＦＬＡＧまたはｐ１ ０ ７に対する抗体でプローブした。 (B)操作されたF-TrCP-E7M.C33A細胞による内因性p107の分解を、示されたプラスミド(μ g単位)および1μ gのpCMV-CD19で一過性にトランスフェクトした。 トランスフェクトされた細胞は、免疫磁気ビーズ選択によって濃縮され、p107、F-TrCP融合、およびβ-アクチン（負荷制御）の定常状態のレベルは、p107、FLAG、およびβ-アクチンに対する抗体を用いた免疫ブロッティングによって決定された。 実験を４回繰り返し、残りのｐ１ ０ ７の量をＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析により測定した。 内因性β-アクチンレベルも内部負荷コントロールとして測定した。内因性標的の持続的な分解のための設計されたβ TRCPのレトロウイルス媒介送達。
次に、設計されたユビキチン–蛋白質リガーゼが安定して意図されたターゲットの持続的な分解を達成するために発現することができるかどうかを調 Ｈ Ｌ−６ ０前骨髄球性白血病細胞を、ＰＢＭＮ−ＧＦＰ、Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎ、または対照Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ（Δ ＤＬＹＣ）を発現する組換えレトロウイルスで形質導入し、ＲＢ／ｐ１ ０ ７結合部位を欠失した（１）。 染色体的に統合されたキメラＦ−Ｔｒｃｐ導入遺伝子を有する感染細胞を、ウイルスからのＧＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳ選別により単離し、感染直後のいずれかの感染ｈ Ｌ−６ ０細胞から内因性ｐ１ ０ ７の分解を評価した（図１）。 5A)、または3ヶ月後の培養に成長中。 5B）。 さらに、RBファミリータンパク質の他の2つのメンバー、RBとp130もHL-60細胞で発現されているので、我々は、単一のF-TrCP-E7Nが同時にE7Nの同じLXCXEモチーフと相互作用するタンパク質の全体のRBファミリーの分解を標的とすることができるかどうかを調べた。レトロウイルス的に形質導入されたF-TrCP-E7Nの異所性発現は、RBの低リン酸化形態だけでなく、p107の劇的なダウンレギュレーションを誘導した(図2)。 感染およびＦＡＣＳ選別の直後のいずれかで、Ｈ Ｌ−６ ０細胞中のｐ１ ３ ０（データは示さない）およびｐ１ ３ ０（データは示さない）が、ｈ Ｌ−６ ０細胞中のｐ１ ３ ０およびｐ１ ３ ０（データは示さ 5A)、または3ヶ月後感染の連続培養する。 5B、レーン3）。 対照的に、Ｈ Ｌ−６ ０細胞におけるＦ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ（Δ ＤＬＹＣ）の安定な発現は、ｐ１ ０ ７、ＲＢの変化に対する効果を有さなかった（図６Ｂ）。 図5A、レーン3）、およびp130レベル（データは示されていない）。 Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎが、Ｕ２ＯＳ細胞中の低リン酸化ＲＢを優先的に分解するという観察と一致する（図１ ０Ａ）。 図2)に示すように、F-TrCP-E7Nの安定な発現による過リン酸化RB種の減少は、HL-60細胞における低リン酸化形態のそれと比較して、あまり顕著ではなかった(図2)。 ＰＲ ＢおよびＰＲ Ｂ−Ｐのレーン２を比較する）。
Hl-60細胞におけるRBファミリータンパク質の標的分解のための設計されたF-TrCP-E7Nユビキチン–タンパク質リガーゼのレトロウイルス媒介送達。 （Ａ）示された組換えレトロウイルスに感染したＨ Ｌ−６ ０細胞をＦＡＣＳにより単離し、ＲＢ、ｐ１ ０ ７、Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ、およびＦ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎ（Δ ＤＬＹＣ）の定常状態レベルを、それぞれの抗体を β-アクチンレベルはまた、特異性および内部負荷制御として決定された。 ＲＢおよびＲＢ−Ｐは、低リン酸化ＲＢおよび過リン酸化ＲＢを示す。 （Ｂ）感染し、ＦＡＣＳ選別したＨ Ｌ−６ ０細胞を３ヶ月間培養し、未処理（レーン３）または１μ ＭのＡＴＲＡで７ ２時間処理した（レーン２）。 内因性ＲＢ、ｐ１ ０ ７、およびｐ１ ３ ０を、免疫ブロッティングによりＦ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎの発現に応答して決定した。 （Ｃ）正常な増殖条件下およびＡＴＲＡ誘導増殖停止に応答して、対照またはＰＢＭＮ−Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎレトロウイルスに感染した生のＨ Ｌ−６ ０細胞のＤＮＡ含量を決定する
オールトランスレチノイン酸（ATRA）による治療では、HL-60細胞は細胞周期を終了し、終末分化を受ける。 Hypophosphorylated RBの蓄積は、以前にhyposphorylated RBが検出できなかったのに対し、ATRA誘導成長停止に貢献することが報告された、観察された（24、25）。 Scf Β Trcp機械も細胞サイクル終了時に利用することができるかどうかを調べるために、hl-60細胞は安定してF-TrCP-E7NまたはF-TrCP（m1）-E7Nは1μ m ATRA72hで処理し、RBファミリータンパク質の分解を評価した。 Ｆ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎを安定に発現するＨ Ｌ−６ ０細胞は、対照ＰＢＭＮ−ＧＦＰウイルスに感染した細胞と比較して、それぞれ、ＲＢ、ｐ１ ０ ７、およびｐ１ ３ ０レベルの９ ５％、９ ８％、および８ ５％の減少を 5B、レーン2）。 ＡＴＲＡはまた、ＰＢＭＮ−ＧＦＰのＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスＬＴＲの制御下で遺伝子の転写を活性化するので（２ ６）、ＡＴＲＡ処理におけるＦ−Ｔｒｃｐ−Ｅ７Ｎの発現の増加は、ｐ１ ０ ７、ｐ１ ３ ０、およ 5B）。
正常な細胞周期進行に対するRBファミリータンパク質の効果は、RB、p107、およびp130遺伝子の破壊を伴うマウス胚線維芽細胞において検討されており、成長因子の撤回やDNA損傷などのG1停止を誘導するシグナルに応答しないことが分かった（27、28）。 しかし、効率的な逆遺伝的ツールの欠如のために、腫瘍細胞増殖におけるRBファミリーメンバーの集団的効果は研究されていない。 本研究からF-TrCP（m1）-E7Nを発現する安定したHL-60細胞は、すべての三つのRBファミリータンパク質の欠損腫瘍細胞がG1停止シグナルに応答する方法 RBファミリータンパク質の構成的分解を誘導するF-TrCP(m1)-E7Nを発現する指数関数的に増殖するHL-60細胞において、対照pBMN-GFPウイルスに感染した 5C左）。 この結果は、RB-/-、p107-/-、およびp130-/-トリプルノックアウトマウス胚線維芽細胞で観察されたG1–S遷移の制御障害と一致している（27、28）。ＡＴＲＡ処理は、対照ＰＢＭＮ−ＧＦＰに感染したＨ Ｌ−６ ０細胞におけるＧ１からＳへの相転移を阻害した（図１ ４）。＜／ｐ＞＜ｐ＞ＡＴＲＡ処理は、対照ＰＢＭＮ−ＧＦＰに感染したＨ Ｌ−６ ０細胞におけるＧ１ 非感染HL-60細胞について報告されたものと一致するF-TrCP-E7N（Δ DLYC）ウイルス（データは示さず）（図5C）またはF-TrCP-E7N（Δ DLYC）ウイルス（データは示さず）（図5C）。 5月(24) G1–S遷移の初期遅延はまた、atra後48時間でpBMN-F-TrCP（m1）-E7N/HL-60細胞で観察されました。 しかし、完全なＧ１停止は、後の段階（７ ２〜９ ６時間）では達成できず、細胞は、細胞周期進行の経過を継続した（図１ ０Ａ）。 5C）。 これらの観察は、F-TrCP（m1）-RBファミリーメンバーのE7Nを介した分解は、G1-S進行の初期の減衰は主に影響を受けなかったのに対し、成長停止の完了に必 さらに、細胞数の劇的な減少は、ＡＴＲＡ誘導細胞周期の出口および分化中の大量の細胞死のために、ＡＴＲＡ処置後７ ２時間および９ ６時間の間に観察された（２ ９）。 驚くべきことに、F-TrCP（m1）-E7Nを発現するHL-60細胞は、成長阻害条件下でRB-/-、p107-/–、およびp130–/–トリプルノックアウトマウス胚線維芽細胞細胞の増加細胞死と一致 総称して、F-TrCP（m1）-E7Nの構成的発現は、成長停止の阻害とATRA治療上の細胞死の増加につながる全体のRBファミリータンパク質のダウンレギュレーションを
ATRA誘導されたG1停止は、細胞周期を否定的に制御する複数の細胞シグナル/成分の協調的な調節を伴う（ref. 30). Dimberg et al. (31)は、ATRAがp21waf1発現の早期増加、p27kip1の安定化、およびg1停止の開始時にRBの後に脱リン酸化を含む骨髄細胞における一連のイベントをトリガ Β ＴＲＣＰ（Ｍ１）−Ｅ７Ｎは、ＲＢファミリーメンバーのみを分解し、ｐ２ １ｗａｆ１およびｐ２ ７ｋｉｐ１の安定性に影響を及ぼさないので、ｐｂｍｎ−Ｆ−Ｔｒｃｐ（Ｍ１）−Ｅ７Ｎ／ＨＬ−６ ０細胞がＧ１アレスタート７ ２−９ ６ 5C）。 ＡＴＲＡによる４ ８時間での観察された初期成長阻害（図１ ０Ａ）。 少なくとも部分的には、ｐ２ １ｗａｆ１およびｐ２ ７ｋｉｐ１の上方制御に起因する可能性があり、その安定性は、構成的Ｆ−Ｔｒｃｐ（ｍ１）−Ｅ７Ｎ発現によって影響されない（図５Ｃ）。 2および5)。
