CRBNはVhl-CRBNヘテロダイマー化によって効率的に分解されるProtac
PROTAC技術はE3リガーゼを利用して標的タンパク質を破壊する。 したがって、二つの異なるE3リガーゼが近接して配置されている場合、E3リガーゼ自体がユビキチン化され、別のE3リガーゼによって分解されるかどう VHLデグレーダーは、潜在的にhif1Aの活性化を介してエリスロポエチン代替可能性があります。 これを設計するために、我々は、CRBN標的分子であるポマリドミドを、VHL E3リガーゼリガンドであるVHL032に接続した（図。 1A）。 リンカーはポマリドミドのアミノ基とVH032の末端アセチル基を接続していたが、これらは溶媒に曝された領域であるため、それらの間の接続は各E3リガーゼへの結合を乱さない可能性が高い。 ＶＨＬ−ＣＲＢＮヘテロ二量化Ｐｒｏｔａｃｓの合成のために（図１ ４）。 図1Bおよび補足図。 S1A)、4-フルオロタリドミド(1)およびVHLリガンド(5)は、以前に報告されたように調製した33。 ジメチルスルホキシド（DMSO）中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の存在下でtert-ブチルエステル基を有する4-フルオロタリドミド（1）を四つのアミンリンカー（2）で処理し、中間体（3）を形成した。 ジクロロメタン（DCM）中のトリフルオロ酢酸（TFA）で処理することにより、3中のtert-ブチル基の脱保護に続いて、酸（4）は、1-1H-1,2,3-トリアゾロピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロリン酸（HATU）およびDIPEAの存在下でVHL配位子（5または7）と結合され、PROTACS（6）、TD-158、TD-165、TD-343およびTD-487（8）を得た。）。
CRBNは、VHL-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによって効率的に分解されます。 （Ａ）ポマリドミドおよびＶＨＬ配位子（Ｖ Ｈ０ ３ ２）を含有するＰＲＯＴＡＣの模式図。 （Ｂ）ＴＤ−１ ５ ８、ＴＤ−１ ６ ５、ＴＤ−３ ４ ３、及びＴＤ−４ ８ ７の構造。 (C)HEK293t細胞をTD-158、TD-165、TD-343またはTD-487(0.1、1、および10μ M)で24時間処理し、vhlタンパク質レベルを免疫ブロッティングによって分析した。 L.E.は西部のしみの長い露出を示す。 （Ｄ）ＴＤ−１ ５ ８化合物およびＴＤ−１ ６ ５化合物のＤＣ５ ０グラフ（ＴＤ−１ ６ ５、ＤＣ５ ０＝２ ０.４ｎＭ；ＴＤ−１ ５ ８、ＤＣ５ ０＝４ ４.５ｎＭ）。 （Ｅ）Ｈ Ａ−ＣＲＢＮおよびＦｌａｇ−ＶＨＬを、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現させた。 ２ ４時間後、細胞をＴＤ−１ ５ ８（５ ０ ０ｎＭ）で２ ４時間処理した。 全細胞溶解物は、示されたタンパク質の免疫ブロッティングによって分析された。 （Ｆ）ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞を、異なる時点で５ ０ ０ｎＭのＴＤ−１ ５ ８で処理し、ｃｒｂｎレベルを免疫ブロッティングによって分析した。 L.E.は西部のしみの長い露出を示す。これらの化合物で処理した後、ウェスタンブロット分析によってVHLおよびCRBNのレベルを調べた。 ＴＤ−１ ５ ８、ＴＤ−１ ６ ５、またはＴＤ−３ ４ ３による処置は、ＣＲＢＮタンパク質のレベルの濃度依存的な減少を引き起こした（図１ ０Ａ）。 1Cの上部のパネル）。 しかしながら、ＶＨＬ長型およびｖｈｌ短型の両方のレベルは、おそらく化学−タンパク質相互作用による安定化のために増加した（図１ ０Ａ）。 1C、上部中間および下部中間のパネル）34。 10μ M TD-158での治療の場合、CRBNレベルは回復した;この「フック」効果は、高用量のPROTAC誘導タンパク質分解の文脈で起こる典型的な特徴である9、35、36、37。 しかし、ＴＤ−１ ６ ５の立体異性体であるＴＤ−４ ８ ７は、ＣＲＢＮ分解を誘導することができなかった（図１）。 1C）。 TD-343は、リンカー中の酸素の取り込みがPROTAC活性を阻害することを意味し、比較的弱い活性を有していた。 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は、ＶＨＬ−ＣＲＢＮヘテロ二量化Ｐｒｏｔａｃｓによって誘導されるＣＲＢＮレベルの減少が、ｍＲＮＡの変化に起因しないことを示した（補足図 S1B）。 すべての合成化合物について、５ ０％分解濃度（ＤＣ５ ０）および最大分解（Ｄｍａｘ）値を測定した。 ＴＤ−１ ５ ８の計算されたＤＣ５ ０およびＤｍａｘ値は、４ ４．それぞれ１％であり、ＴＤ−１ ６ ５の対応する値は、２ ０． 図1Dおよび補足図。 S1D）。 より短いリンカー含有分解剤TD-156（DC50=100.6nM、Dmax=96.9％）は、TD-165と比較して弱い活性を示した（補足図。 S1C）。 リンカーに酸素が取り込まれたTD-343（DC50=367.8nM、Dmax=85.1％）は、CRBNの非効率的な分解をもたらした。 サリドマイドへの結合の効果をテストするために、我々は、異なる結合を有するVhl-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによるCRBNの分解を調べた。 TD-760(DC50=367.7nM、Dmax=82％）、グリコール結合とTD-033（DC50=2546.1nM）、アミド結合と、TD-759（DC50=28.8nM）、グリシン結合と、TD-165のそれと同様の効力を表示したのに対し、減少CRBN分解を示した。 相対的なタンパク質レベルがこの偏ったタンパク質分解に寄与するかどうかを決定するために、我々は、VHL、CRBN、またはその両方をTD-158で過剰発現する細胞を処理し、CRBNおよびVHLレベルを分析した。 全ての場合において、ＣＲＢＮレベルは減少したが、ＶＨＬレベルは類似したままであったか、または増加した（図１ ０Ｂ）。 1E）。 経時的な実験では、TD-158は3時間以内にCRBNを80％以上分解し、12時間後に完全に分解した（図10B）。 1階）。 ＴＤ−１ ５ ８誘導性ＣＲＢＮ分解は、種々のヒト細胞株においても観察された（補足図１ ４Ａ）。 S2A-D）。
VHL-CRBNヘテロ二量化PROTACsによるCRBNの分解はCRL2VHLに依存している
TD-158によるCRBNの分解がUPSまたはカリンリングユビキチンリガーゼ（CRL）に依存していたことを確認するために、我々はボルテゾミブ、プロテアソーム阻害剤、およびMLN4924、ネディル化阻害剤を試験した。 ＴＤ−１ ５ ８およびボルテゾミブまたはＭＬＮ４ ９ ２ ４との共処理により、ＣＲＢＮ分解が防止された（図４）。 図2Aおよび補足図。 S3A）。 予想されるように、ポリユビキチン鎖の形成は、TD-158の存在下で著しく増加した（図。 2B）。 加えて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＶＨＬのノックダウンは、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞におけるＴＤ−１ ５ ８誘導性ＣＲＢＮ分解を弱毒化した（図１）。 2C）。 対照的に、ＶＨＬ欠損腎癌細胞株である７ ８ ６−Ｏ細胞におけるＶＨＬの発現は、ＴＤ−１ ５ ８誘導性ＣＲＢＮ分解を回復させた（図１ ０Ａ）。 2D）。 これらの結果と一致して、CRL2VHL複合体の足場タンパク質であるCullin2のsiRNA媒介ノックダウンは、TD-158誘導CRBN分解を防止した（図10B）。 2E）。 総称して、これらの結果は、VHL-CRBNヘテロ二量化PROTACsによるCRBN分解がCRL2VHL複合体に依存していることを示しています。
VHL-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによるCRBNの劣化は、CRL2VHLに依存しています。 （Ａ）ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞をＴＤ−１ ６ ５（１μ Ｍ）で１ ２時間処理し、続いてボルテゾミブ（２ ０ｎＭ）またはＤＭＳＯを８時間添加した。 （Ｂ）ＦＬＡＧタグＣＲＢＮ（ＣＲＢＮ−Ｆｌａｇ）およびＨ Ａタグユビキチン（Ｈ Ａ−Ｕ Ｂ）を、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現させた。 ２ ４時間後、細胞をＴＤ−１ ５ ８（５ ０ ０ｎＭ）およびボルテゾミブ（２ ０ｎＭ）、またはＤＭＳＯおよびボルテゾミブ（２ ０ｎＭ）で１ ２時間処理した。 （Ｃ）ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞に、ＶＨＬに特異的なｓｉＲＮＡまたはスクランブルされた（対照）ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。 24時間後、細胞をTD-158(500nM)で24時間処理した。 （Ｄ）７ ８ ６−Ｏ細胞およびＶＨＬを発現する７ ８ ６−Ｏ細胞（７ ８ ６−Ｏ＋ＶＨＬ）を、ＴＤ−１ ５ ８（５ ０ ０ｎＭ）で２ ４時間処理した。 （Ｅ）ＨＥＫ２ ９ ３ｔおよびＣＵＬ２ノック所有Ｈ ＥＫ２ ９ ３ｔ細胞を、ＴＤ−１ ６ ５（１μ Ｍ）またはＴＤ−４ ８ ７（１μ Ｍ）で２ ４時間処理し、全細胞溶解物を免疫ブロッティングによって分析した。 （Ｆ）ＣＲＢＮ−ＦｌａｇをＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現させた。 ３ ６時間後、細胞をＴＤ−１ ５ ８（１μ Ｍ）およびボルテゾミブ（２ ０ｎＭ）、またはＤＭＳＯおよびボルテゾミブ（２ ０ｎＭ）で１ ２時間処理した。 （Ｇ）精製されたＣＲＢＮおよびＶＨＬ／ＥＬＯＢ／ＥＬＯＣ複合体タンパク質を混合し、４つの管に分注した。 ＴＤ−１ ５ ８およびグルタチオンビーズを示されるように添加し、３時間インキュベーションした後、グルタチオンビーズを洗浄し、ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって分析した。PROTACsによる効率的な分解は、標的タンパク質およびE3リガーゼ9,38との三元複合体の形成を必要とする。 これを試験するために、共免疫沈降実験を行った。 本発明者らは、Ｔｄ−１ ５ ８の存在下で外因的に発現されたＦＬＡＧタグ付きＣＲＢＮ共免疫沈降した内因性Ｖ Ｈ Ｌを見出したが、その非存在下ではなかった（図１ ０Ａ）。 2階）。 精製タンパク質を用いたＧＳＴプルダウン実験では、ＴＤ−１ ５ ８の存在下で、ＣＲＢＮがＶ Ｈ Ｌ−Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ／Ｃ複合体と直接相互作用することが示された（図１）。 2G）。 さらに、過剰なポマリドミドまたはVHLリガンドの添加は、TD-158誘導CRBN分解を阻害した（補足図。 S3B,C)。 外因的に発現されたＣＲＢＮ Ｙ３ ８ ４／Ｗ３ ８ ６Ａ（Ａ Ａ）、ポマリドミド結合欠損変異体１ ６は、ＴＤ−１ ５ ８によって分解されなかった（補足図１）。 S3D）。 したがって、これらのデータは、CRBN、VHL、およびTD-158の間の三元複合体の形成がCRBN分解の前提条件であることを示唆している。
グローバルなプロテオーム解析は、TD-158がCRBNの分解を誘導することを明らかに
公平な方法でCRBNの分解を調べるために、我々は定量的なプロテオーム CRBN分解の二次的な影響を最小限に抑えるために、我々はTD-158またはDMSO（ビヒクルコントロール）12時間で、CRBNとイミドネオ基質を発現したJurkat細胞を処理した。 この分析は、三つ以上の非冗長、ユニークなペプチドを含む7,148タンパク質を同定した（補足表S1）。 唯一の三つのタンパク質—CRBN、CNIH1とLMBRD2—P値=0.05と1.5倍以上の変化の基準を満たしました。 その中で、CRBNは2倍以上変化した唯一のタンパク質であった（図1）。 3A）。 しかし、ＣＲＬ４ＣＲＢＮ複合体（ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＤＤＢ１、およびＲＢＸ１）およびＣＲＬ２ＶＨＬ複合体（ｅｌｏｎｇｉｎ Ｃ、ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ、ＣＵＬ２、およびＲＢＸ１）の他の成分のレベルは変化しないままであった（図１）。 3B、C）。 興味深いことに、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＺＦＰ９ １、ＺＮＦ２ ７ ６およびＺＮＦ６ ５ ３を含む、以前に報告されたＩｍｉｄの新基質のレベルは、ＴＤ−１ ５ ８処理時に変化しなかった（図１ ５Ａ）。 3B）39,40,41。 これらの結果は、Ｊｕｒｋａｔおよび種々の多発性骨髄腫細胞株における免疫ブロッティングによって確認された（図１）。 図3Dおよび補足図。 S2A-D）。
TD-158処理時のグローバルなプロテオミクス変化。 （Ａ）定量的プロテオーム分析によって同定されたタンパク質の火山プロット、１μ Ｍ Ｔ Ｄ−１ ５ ８またはＤＭＳＯで１ ２時間処理されたＪｕｒｋａｔ細胞からの溶解物を比較する。 データは3つの生物学的複製を表しています。 X軸はタンパク質レベルの倍変化を対数スケールで表し、y軸はp値を対数スケールで表します。 (B)CRL4CRBN複合体、CRL2VHL複合体、およびCRBNのネオ基質の相対存在量(*P<0.05、**P<0.1)。 赤い線は1.5倍の差を示しています。 （Ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞をＴＤ−１ ５ ８（１μ Ｍ）またはＤＭＳＯで２ ４時間処理した。 （Ｄ）Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＤＭＳＯ、ＴＤ−１ ５ ８（１μ Ｍ）、ポマリドミド（１μ Ｍ）、またはＶＨＬリガンド（１μ Ｍ）の有無にかかわらず、２ ４時間処理した。
Vhl-CRBNヘテロダイマー化によるCRBN分解PROTACsはCRBN欠乏症を再現します
CRL4CRBNの内因性基質はグルタミンの生合成における重要な酵素であるグルタミン合成酵素GLULである。 アセチルトランスフェラーゼCBP/p300は、グルタミンの高レベルの条件下でGLULの二つのN末端リジン残基をアセチル化し、得られたアセチル化GLULはCRL4CRBNによって捕捉され、ユビキチン化され、続いてプロテアソームによって除去される22。 GLULレベルに対するTD-158の効果を調べるために、我々は48時間のグルタミンのHep3B細胞を飢え、その後、TD-158の存在下または非存在下でグルタミンを再補給 TD-158はグルタミン状態に関係なくCRBN分解を誘導し、GLULのレベルは、TD-158の存在下では、その不在下よりも時間の経過とともにゆっくりと減少した（図10）。 4A、B）。 さらに、in vivoでのユビキチン化アッセイは、GLULのユビキチン化がTD-158の存在下で減少することを示した（図10B）。 4C）。 我々はまた、TD-165治療は、IMiDへの細胞抵抗性を付与するかどうかを調べた。 ２つのイミド感受性細胞株、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２およびＲＰＭＩ８ ２ ２ ６を、ＴＤ−１ ６ ５またはＤＭＳＯで２ ４時間前処理し、次いで、ポマリドミド、ＴＤ−１ ６ ５、またはその両方で３時間前処理した。 4D、E）。 まとめると、これらのデータは、VHL-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによるCRBN分解は、CRBN欠損を再現することを示しています。
VHL-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによるCRBN劣化は、CRBN欠損を再現します。 （Ａ）Ｈｅｐ３ｂ細胞をグルタミン欠乏状態にし、ＴＤ−１ ５ ８（５ ０ ０ｎＭ）で４ ８時間処理した。 ＧＬＵＬの分解をイムノブロッティングにより解析した。 （Ｂ）３つの独立した実験からの定量的結果。 （Ｃ）ＧＬＵＬ−ＭｙｃおよびＶ５−ＵｂをＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現させた。 24時間後、細胞をTD-158(500nM)またはDMSOで12時間処理し、次いでボルテゾミブ(100nM)またはDMSOで12時間処理した。Myc磁気ビーズを用いて免疫沈降した全細胞溶解物およ （Ｄ、Ｅ）ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（Ｄ）およびＲＰＭＩ８ ２ ２ ６（Ｅ）細胞を、ＴＤ−１ ６ ５（１μ Ｍ）またはＤＭＳＯで２ ４時間前処理し、収穫後、４つの群に分けた。 次いで、各群を、ポマリドミド（１μ Ｍ）およびＤＭＳＯ、またはポマリドミド（１μ Ｍ）およびＴＤ−１ ６ ５（１μ Ｍ）で３日間処理した。 細胞生存率は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（＊＊Ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝”ｅａｃａ８ ４ ９ ３ｆ６”＞＜／ｄｉｖ＞０．VHL-CRBNヘテロ二量化PROTACsのin vivo効果を調査するために、我々はTD-165は、動物モデルにおけるCRBN分解を誘導することができるかどうかを決定しようとしました。 催奇形性に重要なマウスＣＲＢＮ（ＭＣＲＢＮ）中のアミノ酸残基は保存されていないが、ＭＣＲＢＮは、マウス胚性線維芽細胞におけるＴＤ−１ ６ ５によって、わずかに少ない程度ではあるが、 S4A）。 次に、TD-165がIN vivoでCRBN分解を誘導するかどうかを決定するために、マウスにtd-165を腹腔内投与した。 しかし、ｃｒｂｎレベルは、脾臓、末梢血単核細胞（Ｐｂｍｃ）、または肝臓において変化しなかった（補足図４）。 S4B）。 TD-165の薬物動態が妥当であることを考えると（補足表S2）、この効果の欠如は、TD-165の高い血漿タンパク質結合（99.9％）に起因する可能性がある（補足表S3）。
N末端切断CRBNはVHL-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによって分解されない
CRBNのどのドメインがTD-165媒介CRBN分解に重要であるかを決定するために、我々は、図1に示すように、一連のCRBN欠失変異体(D1-D4)を生成した。 全長ＣＲＢＮまたは個々の欠失突然変異体を発現する細胞を、ＤＭＳＯまたはＴＤ−１ ６ ５のいずれかで処理し、細胞溶解物を、ＴＤ−１ ６ ５処理後の分解について調べた。 驚くべきことに、４つのＣＲＢＮ欠失突然変異体のどれもＴＤ−１ ６ ５によって分解されなかったが、一方、全長ＣＲＢＮは効率的に分解された（図１ ０Ａ）。 5B）。 特に、ＶＨＬレベルは、おそらくＴＤ−１ ６ ５の存在下での化学−タンパク質相互作用の安定化のためにわずかに上昇したが、ｔｄ−１ ６ ５の存在下で切断されたＣＲＢＮ変異体の発 5B）。 これについての一つの可能な説明は、欠失変異体が三元複合体を形成することができないことであろう。 しかし、D1変異体は、TD-165およびVHLとの三元複合体を形成した(図10B)。 Ｄ１のユビキチン化は、ＴＤ−１ ６ ５の存在下で増加した（図５Ｃ）。 5D）。 我々はその後、CRBNのアミノ末端リジン残基がユビキチン化のために必要であることを仮定した。 このアイデアをテストするために、我々は、個々に、組み合わせて、アルギニンとCRBN（a.a.1-80）のN末端内のすべての三つのリジン残基を置換し、CRBN分解のための細胞 ＴＤ−１ ５ ８は、全ての変異体を野生型ＣＲＢＮと同程度に効率的に分解した（図１ ０Ａ）。 これは、ＣＲＢＮのＮ末端の３つのリジン残基が、ＶＨＬ−ＣＲＢＮヘテロ二量化Ｐｒｏｔａｃｓによって誘導される分解に必要とされないことを示している。
CRBNのN末端無秩序領域は、vhl-CRBNヘテロダイマー化PROTACsによる分解には必要であるが、ユビキチン化には必要ではない。 （Ａ）ＣＲＢＮ切断変異体を示す模式図。 LON、Lonプロテアーゼドメイン;TB、サリドマイド結合ドメイン。 （Ｂ）Ｘｐｒｅｓｓタグ付けされた全長ＣＲＢＮまたはＤ１、Ｄ２、Ｄ３、またはＤ４欠失突然変異体を、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞で発現させた。 ２ ４時間後、細胞をＴＤ−１ ６ ５（３μ Ｍ）またはＤＭＳＯで２ ４時間処理した。 全細胞溶解物は、示されたタンパク質の免疫ブロッティングによって分析された。 (C)XpressタグD1およびHis-SBPタグVHLをコードするプラスミドをHEK293t細胞にトランスフェクトした。 全細胞溶解物およびストレプトアビジンビーズを用いてプルダウンされたタンパク質は、示されたタンパク質の免疫ブロッティングによって分析された。 （Ｄ）Ｘｐｒｅｓｓタグ付きＣＲＢＮ、Ｋ３ ９Ｒ、Ｋ４ ２／４ ３Ｒ、またはＫ３ ９／４ ２／４ ３ｒ変異体をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞にトランスフェクトした。 ２ ４時間後、細胞をＴＤ−１ ５ ８（２μ Ｍ）またはＤＭＳＯで２ ４時間処理した。 全細胞溶解物は、示されたタンパク質の免疫ブロッティングによって分析された。
標的タンパク質の無秩序領域は、効率的なPROTAC誘導分解のために必要とされる
我々は、次に全長CRBNとCRBN欠失変異d1の間の構造 ＣＲＢＮ（ａ．ａ．１−８ ０）のＮ末端は、Ｉｕｐｒｅｄ２Ａ分析に基づいて、展開されたまたは本質的に無秩序化された領域を含むと予測された（補足図１）。 S5A）。 この無秩序な領域（a.a. 1-48）は、その柔軟性のためにCRL4CRBN結晶構造では確かに識別できなかった（PDBエントリ;6BN7）。 本質的に無秩序な領域がプロテアソームデグロンの主要な構成要素の一つであり、プロテアソームプロテオリシスのイニシエータとして作用することが示されている25。 また、無秩序な領域のない球状タンパク質の場合には、p97/バロシン含有タンパク質（p97/VCP）複合体は、タンパク質のプロテアソーム分解を促進し、二次構造 PROTAC誘導タンパク質分解とp97/VCP複合体との関係を調べるために、我々はN2、N4-ジベンジルキナゾリン-2,4-ジアミン（DBeQ）、TD-165誘導CRBN分解にp97/vcp阻害剤の効果 これらの実験は、ＣＲＢＮ分解がＤｂｅｑ処理によって影響されないことを示した（図３）。 6A）。 陽性対照として使用されたＤＮＡ損傷誘導性転写物３（ＤＤＩＴ−３；ＣＨＯＰ）および脂質化ＬＣ−３ＩＩのレベルは、Ｄｂｅｑ処理時に上昇した。 SiRNAまたはDBeQ処理によるp97のノックダウンは、ERADおよびオートファジー経路を障害し、十分に確立されたUPRマーカーであるCHOPのアップレギュレーション、および代表的なオートファジーマーカーであるLC-3IIの蓄積をそれぞれもたらす（図。 6A)42. したがって、CRBNの無秩序な領域がPROTAC誘導プロテアソーム分解を容易にするかどうかを調べるために、我々はD2、D3、およびD4変異体にCRBNの無秩序な領域（a.a.1-80）を取り付け、分解のためのキメラ蛋白質を調べた。 全てのキメラタンパク質、特にＤ４キメラは、濃度依存的にＴＤ−１ ６ ５によって分解された（図１ ０Ａ）。 6B）。 しかし、ＶＨＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかにＣＲＢＮ無秩序領域を導入しても、融合タンパク質の分解は誘導されなかった（図３）。 このことは、無秩序領域の付着が全ての標的タンパク質に十分ではないことを示す。 他のPROTACsによって誘導される分解にこのアイデアを拡張するには、ARはまた、N末端（a.a.）で展開された領域を保有するため、我々は、ARCC4、以前に報告されたアンドロゲン受容体（AR）PROTAC43をテストした。 1-330)、Iupred2A解析ツールを用いて決定されるように(補足図。 S5B）。 ARCC4処理時に、N末端無秩序領域（Δ N330）のないARは、全長ARよりも効率的に分解されなかった。 興味深いことに、CRBN無秩序領域（a.a.1-80）をAR Δ N330に結合すると、劣化効率が向上しました（図。 図６ｄおよび補足図６ｄおよび補足図６ｄ。 S5C）。 これに合わせて、ＡＲ無秩序領域（ａ．ａ．１−１ ７ ０）のＣＲＢＮ Ｄ１変異体への付着も、ＴＤ−１ ６ ５によるタンパク質分解を促進した（図１）。 図６ｅおよび補足図６Ｅおよび補足図６ｅ。 S5D）。
標的タンパク質の無秩序な領域は、PROTACsによる効率的な分解に必要とされる。 （Ａ）ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞を、ＴＤ−１ ６ ５（１μ Ｍ）、ｐ９ ７／ＶＣＰ阻害剤Ｄｂｅｑ（１ ０μ Ｍ）、またはその両方で６時間処理した。 (B)His-SBPタグVHLプラスミドのN末端またはC末端にN末端CRBN(a.a.1-80)を挿入し、HEK293t細胞でプラスミドを発現させた。 8時間後、細胞を回収し、4つのグループに分けた。 各グループは、その後、48時間のTD-165の濃度を増加させて処理しました。 （Ｃ）Ｄ２、Ｄ３、またはＤ４に融合したＣＲＢＮ（ａ．ａ．１−８ ０）のＮ末端を発現するプラスミドを、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞にトランスフェクトした。 8時間後、細胞を回収し、4つのグループに分けた。 各グループは、その後、48時間のTD-165の濃度を増加させて処理しました。 （Ｄ）全長Ａ Ｒ、Ｎ末端欠失Ａ Ｒ（Δ Ｎ３ ３ ０）、またはΔ Ｎ３ ３ ０に融合したＣＲＢＮ（ａ．ａ．１−８ ０）のＮ末端（ＣＲＢＮ（ａ．ａ．１−８ ０）＋Δ Ｎ３ ３ ０）を発現するプラスミドを、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞にトランスフェクトした。 8時間後、細胞を回収し、4つのグループに分けた。 全細胞溶解物は、示されたタンパク質の免疫ブロッティングによって分析された。 （Ｅ）Ｄ１（ＡＲ（１−１ ７ ０）＋Ｄ１）に融合した全長ＣＲＢＮ、Ｄ１欠失変異体、またはＡＲ（ａ．ａ．１−１ ７ ０）のＮ末端を発現するプラスミドを、ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞にトランスフェクトした。 8時間後、細胞を回収し、4つのグループに分けた。 各グループは、その後、48時間のTD-165の濃度を増加させて処理しました。
これらの知見をさらに強化するために、文献検索に基づいて高効力のPROTACs（DC50<1μ m）を選択し、iupred2aツールを使用して本質的 興味深いことに、選択されたPROTAC標的タンパク質の三分の二は、その末端または内部のいずれかで、40以上のアミノ酸の無秩序領域を有することが判明した（表1）44 44、45、46。 これに合わせて、VHL-Homo-PROTACは、そのN末端に無秩序な領域を有するが、vhl短い形態ではないVHL長い形態の分解を誘導することが示されている47。 したがって、これは、標的タンパク質の無秩序な領域がPROTACsによる効率的な分解に必要であるという我々の考えを支持している。
