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メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の治療は、抗生物質耐性の増加によって複雑になっている。 MRSA株は、抗生物質の存在下で継続する細胞壁の合成を可能にする、狭い、アクセスできない裂け目で反応性セリンを保護することにより、β-ラクタム セフトビプロールおよびセフタロリンは、治療上有用な濃度でPbp2Aを阻害する抗MRSAセファロスポリンである。 セフトビプロールのR2群は、活性部位にアクセスするためにPbp2Aの狭い裂け目に延びているのに対し、セフタロリン結合はPbp2Aのアロステリック変化を引き起こし、第2の分子による結合のための活性部位を明らかにする(3,4)。 Ceftobiproleは臨床試験で評価され、ceftarolineはMRSA（5-10）によって引き起こされるそれらを含む皮および皮の構造の伝染の処置のために承認されるFDAです。私たちのグループからの以前の研究は、セフトビプロールにおけるCOL株の通過は、Pbp2A（11）の変異を有する耐性変異体のために選択することを示している。
本研究では、セフタロリン継代も同様の変異を選択するかどうかを調べます。 通路実験は、二つの異なるMRSAの背景を用いて行われた：COL、1961年から古風な均質に耐性の分離株、SF8300、不均一に耐性の現代USA300MRSA株。 COLnexおよびSf8300Ex、colnおよびSF8300のmecA陰性誘導体株は、(12)染色体ブドウ球菌カセット染色体mec(SCCmec)を切除することによって得られた(13)。 野生型ＭｅＣＡは、継代研究のために、ｃｏｌｎｅｘおよびＳｆ８ ３ ０ ０Ｅ ＸにプラスミドｐＹＫ２ ０（プラスミドｐａｗ８に由来し、ＣＯＬからクローン化された野生型ＭｅＣＡを含む）に再導入した。 MecAが抵抗性を媒介していた場合、プラスミドの抵抗性変異体を硬化させるか、または感受性の背景にそれを導入することは、それぞれ表現型の損失ま 本研究で使用される株およびプラスミドを表１および表２に列挙する。 COLnex(pyk20)およびSf8300Ex(pyk20)は、以前に記載されているように、セフタロリン(Forest Laboratories)の濃度を増加させることを含むトリプシン大豆ブロス中で連続的に継代された(11)。この表を表示する：
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mecA陽性継代研究で使用される親および変異株のリストa
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mecA陽性継代研究で使用されるプラスミド
28日後、セフタロリン中に継代されたCOLnex（pyk20）およびSf8300Ex（pyk20）は、二つの変異体、COLnexpT（pyk20colt*）およびSf8300Ex（pyk20）を得た。sf8300expt(pyk208300t*)(アスタリスクは、colまたはsf8300背景でセフトビプロールまたはセフタロリン選択中に生成されたプラスミドを示す)(表1)。 セフタロリン、セフトビプロール、および他のβ−ラクタム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対するＭＩＣは、ｃｌｓｉ規格（表３）に従ってブロス希釈法によって決定した（１ ５）。 COLnexpT（pyk20colt*）は、それぞれ64μ g/mlと32μ g/mlのMICsで、セフタロリンとセフトビプロールの両方に高レベルの抵抗性を発現した。 ＳＦ８ ３ ０ ０Ｅｘｐｔ（ＰＹＫ２ ０ ８ ３ ０ ０Ｔ＊）は、４日目の継代までに低レベルの抵抗性を発現し、４μ ｇ／ｍｌのＭＩＣを有し、これは２ ４回以上の継代にもかかわらず変化しなかった（表３および図 1). COLnex(pyk20)(11)、COLnexpB(pyk20colb*)の前述のセフトビプロール継代変異体は、それぞれに64μ g/mlのMICで、セフトビプロールとセフタロリンの両方に高レベルの耐性を示した。
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mecA陽性の親および継代変異株のための薬物のMICs
セフトビプロールおよびセフタロリン継代meca陽性変異体。 ブロス中の各抗生物質の阻害下濃度で株を継代することにより，セフトビプロール（ＢＰＲ）およびセフタロリン（ＣＰＴ）に対する耐性を生成した。 株が毎日成長した薬物の最高濃度は、y軸に示されています。
プラスミドmecAは継代株の変異の配列を決定しました。 PBPsはβ-ラクタムの標的であるため、pbp1、-2、-3、および-4も配列決定された。 最後に、これらの遺伝子の変異がcol（16）のmecA陰性セフトビプロール耐性変異体で同定されていたとして、gdpとacrBは、配列決定されました。 プラスミドpyk208300t*(セフタロリンに継代されたSf8300Exからのpyk20)は、mecAにおいて単一点突然変異(コード配列位置1339でGからAへ)を有し、その結果、非synonymousアミノ酸変化、E447Kをもたらした。
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Ceftobiproleおよびceftarolineで継代されたmecA陽性変異株における変異
プラスミドpyk20colt*（ceftarolineで継代されたCOLnexからのpyk20）メカ GdpにH443Y変異を導入した点突然変異（CDS位置1327のCからT）、PBP2にD156N変異を導入した点突然変異（Cds位置466のGからA）、PBP4にT201AおよびF241L変異を導入した二つの点突然変異（CDS位置601のAからG、CDS位置723のCからG）が見出された（表4）。 注目すべきことに、その天然の染色体位置にＭｅＣＡを含有するＣＯＬのセフタロリン継代はまた、高レベルの抵抗性を有するが、ＭｅＣＡに変異を欠く変異を生じた（データ その継代変異体の配列分析は、pbp2の点突然変異（CDS位置1891のGからAへ）を明らかにし、アミノ酸変化G631Sをもたらし、pbp4の1つ（Cds位置414のTからAへ）、N138K変異を導入した。 これらのデータは、mecAの存在下でさえ、セフタロリンが他の遺伝子の突然変異を選択し、抵抗性をもたらすことを示している。それぞれがＭｅＣａ変異を有するそれらのプラスミドのＣｏｌｎｅｘｐｂ（ｐｙｋ２ ０ｃｏｌｂ＊）およびＳｆ８ ３ ０ ０Ｅｘｐｔ（ｐｙｋ２ ０ ８ ３ ０ ０ｔ＊）を硬化させると、試験した全てのβ−ラクタムのＭｉｃが減少した（表５および６）。 MecA変異を欠いていたそのプラスミドのcolnexpt（pyk20colt*）を硬化させることは、MICsに影響を及ぼさなかった（表5）。 MecAに6つの置換変異を含むpyk20colb*を感受性COLnex親に変換し、形質転換体COLnex（pyk20colb*）をもたらし、高レベルのセフタロリンおよびセフトビプロール耐性をもたらした。 ＭｅＣＡ中の単一変異Ｅ４ ４ ７Ｋを含むｐＹＫ２ ０ ８ ３ ０ ０Ｔ＊をＣｏｌｎｅｘに形質転換し、形質転換体Ｃｏｌｎｅｘ（ｐＹＫ２ ０ ８ ３ ０ ０Ｔ＊）を得た結果、セフトビプロール（６ ４μ ｇ／ｍｌのＭＩＣ）に対する高レベルの耐性が得られたが、セフタロリン（４μ ｇ／ｍｌのＭＩＣ）に対する低レベルの耐性のみが得られた（表５）。 ＰＹＫ２ ０ＣＯＬＢ＊をＳｆ８ ３ ０ ０Ｅ Ｘに形質転換し、形質転換体Ｓｆ８ ３ ０ ０Ｅ Ｘ（ＰＹＫ２ ０ＣＯＬＢ＊）を得て、セフタロリンおよびセフトビプロール（それぞれ３ ２μ ｇ／ｍｌのＭＩＣ）に対する高レベルの耐性を得た（表６）。 Sf8300Exをpyk208300t*で変換する複数の試みは失敗しました。
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COLバックグラウンドで継代株からプラスミドで形質導入されたプラスミドおよび親株の硬化したmecA陽性継代変異株の薬のMICs
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MECA陽性継代変異株に対する薬物のMICs USA300株SF8300背景における継代株からのプラスミドを形質導入したプラスミドおよび親株の硬化
mecAのE447における単一のアミノ酸変化は、抵抗性に重要な役割を果たすようである。 これは、（他の変異の中で）セフトビプロール継代COLに存在している（11）、それはセフタロリン継代SF8300の唯一のmecA変異であり、臨床分離株（17、18）で報告されています。 構造的には、E447はPbp2Aのペニシリン結合ドメインに存在し、セフトビプロールおよび他のβ-ラクタムのR2グループと相互作用する（3、19）。 E447Kは、おそらく二つの化合物の間の構造の違いによるCOLnexの背景に高レベルのセフトビプロール耐性と低レベルのセフタロリン耐性を付与しました。 ＭＥＣＡにおける複数の変異は、両方の抗生物質に対する高レベルの耐性をもたらす（２ ０）。 遺伝的背景も役割を果たします。 セフタロリンで継代された異種SF8300は、E447K（MIC4μ g/ml）とセフトビプロールとセフタロリンに対する低レベルの抵抗性を開発しました。 この変異は、臨床分離株におけるセフタロリンに対する低レベルの抵抗性と関連している（17）。結論として、ceftarolineまたはceftobiproleのいずれかの通過は、Pbp2AのE447K変異、ceftaroline耐性臨床分離株で見つかった変異を選択し、耐性表現型（17、18）を仲介する上での重要性を強調 全ゲノム配列決定は行われなかったが、これは本研究の限界であるが、mecA以外の遺伝子は、E447K変異の導入時にCOLとSF8300背景の間で抵抗性のレベルが異な おそらく他のものがありますが、PBP4とGdpをコードする遺伝子の変異は、これらが繰り返しセフトビプロールとセフタロリン継代変異体で同定されているように、特に重要であると思われます。 これらの遺伝子および他の遺伝子の役割は活発な調査中である。
