化合物

ALDH1A1阻害剤を用いた高スループット細胞熱シフトアッセイ(CETSA)が最近記載されています30。 ＬＤＨＡ阻害剤は、Ｒａｉ ｅ ｔ ａ ｌ．29. ＩＤＨ１阻害剤は、Ｕｒｂａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． およびＤａｖｉｓ ｅ ｔ ａ ｌ．24,36. 研究で使用された他の化合物は、メトトレキサート（Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｈ Ｙ−１ ４ ５ １ ９）、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ、Ｓ１ ０ ３ ０）、Ａ Ｇ−２ ２ １（Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈ Ｙ−１ ８ ６ ９ ０）、イソファゴミン（Ｔｏｒｎｏｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＃Ｉ８ １ ６ ０ １ ０）、Ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ＃２ ８ ５ ７）、およびＬＹ２ ８ ５ ７ ７ ８ ５（Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｈ Ｙ１ ２ ２ ９ ３）であった。 Qhtについては、機構尋問プレート（MIPE）内の化合物は、11点（intraplate、1：3希釈係数）で試験した。 977キナーゼ阻害剤を含むキナーゼ阻害剤コレクションは、7点用量（インタープレート、1：5希釈係数）で試験した。 全ての場合において、ＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。

クローニング

pcdna3。1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. 目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（Orf）は、補足表S1に詳細に定義されている注入互換性のあるオリゴヌクレオチドでコード領域を増幅するPcrに ＩＤＨ１、ＬＤＨＡ、ＤＨＦＲ、ＧＣ、およびＡＬＤＨ１Ａ１構築物を、ｐｃＤＮＡ３． ゲートウェイのクローニング(IDH2構成のみ)の場合、pcdna3.2-V5/DESTのV5タグを置き換えることによって、86bタグを含む宛先ベクトルが作成されました。 The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.ＨＥＫ２ ９ ３ｔ、ＬＮ１ ８、ＯＶ−９ ０、Ｈｅｌａ、２ ２ＲＶ１、ＭＤＡ−ＭＢ−４ ６ ８、およびＨ Ｔ−２ ９細胞をＡＴＣＣ（それぞれ、ＣＲＬ−１ ５ ７ ３、ＣＲＬ−２ ６ １ ０、ＣＲＬ−１ １ ７ ３ ２、ＣＣＬ２、ＣＲＬ−２ ５ ０ ５、ＨＴＢ−１ ３ ２、およびＨＴＢ−３ ８）から得た。 HuCC-T1とCC-LP-1は、N.Bardeesy博士（マサチューセッツ総合病院、ボストン）の親切な贈り物でした。 ＨＥＫ２ ９ ３ｔ細胞を、１ ０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、６ｍ Ｍ Ｌ−グルタミン、１ｍ Ｍピルビン酸ナトリウム、５ ０Ｕ／ｍＬペニシリン、および５ ０μ ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（４． ＬＮ１ ８、Ｈ Ｔ−２ ９、ＣＣ−ＬＰ−１およびＨｅｌａ細胞を、ピルビン酸ナトリウムなしで上記培地中で培養した。 ＯＶ−９ ０細胞を、ＭＣＤＢ１ ０ ５培地の１：１混合物中で培養した（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． １ ５％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および最終濃度１.８ ５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｇ Ｅ）を添加したＭ１ ９ ９培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｇ Ｅ）を添加した。 ２ ２ＲＶ１、Ｈｕｃｃ−Ｔ１、およびＭＤＡ−ＭＢ−４ ６ ８細胞を、１ ０％ＦＢＳ、６ｍ ＭのＬ−グルタミン、１ ０ ０単位／ｍＬのペニシリン、１ ０ ０μ ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１ ６ ４ ０中で増殖させた。 全ての細胞を、５％ＣＯ２に維持された加湿インキュベーター中で３ ７℃で増殖させ、Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いてマイコプラズマの陰性を試験した。

組換えタンパク質およびペプチドの生産および精製

11Sおよび86bタンパク質は、GenScriptによって生産されました。 組換え１ １Ｓ断片については、コードＤＮＡ配列を６ｘ ｈｉｓタグに融合させて下流精製を容易にし、配列をｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにサブクローニングした。 BL21スター（DE3）細胞は、組換えプラスミドで形質転換し、単一のコロニーは、タンパク質発現の誘導のためのIPTGを含むLB培地に接種した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を使用して、発現をモニターし、最適な収穫時期を選択した。 細胞を遠心分離によって回収し、ペレットを超音波処理によって溶解した。 Hisタグ精製後、画分を0.22μ mフィルターを通して滅菌した。 タンパク質は、標準プロトコルおよびマウス抗Ｈｉｓ ｍａｂ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０ ０ １ ８ ６）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによって分析した。 タンパク質は1X PBS、10％グリセロール、pH7.4に保存され、還元条件下でのCoomassie Blue-stained SDS-PAGEゲルの濃度分析によって推定されるように、純度は約90％であった。 15アミノ酸86bペプチドは、超純粋なdh2oに保存され、HPLCによって純粋な99.9％であった。

低スループット（96ウェルPCRプレートまたはストリップ）CETSA相補アッセイ

細胞は、1.25mlの複合体（6.25μ l Lipofectamine2000および3μ g DNA per well）と1.25mlのHEK293T細胞懸濁液（1×106/mL、1.25×106細胞合計）を組み合わせた逆トランスフェクション手順を用いて6ウェル皿にトランスフェクトした。 ＣＤＫ９については、ウェル当たり２μ ｇのＤＮＡを使用した。 ２ ４時間（ＣＤＫ９については４ ８時間）の後、細胞をトリプシン化によって回収し、ｄｐｂｓ（Ｃａｃｌ２およびＭｇｃｌ２を含む）＋１ｇ／Ｌグルコース、１Ｘ Ｈａｌｔ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、および０． 温度範囲の実験（化合物または単回投与なし）のために、試料を、チューブあたり30μ lでPCRストリップにアリコートした。 化合物を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートした。予備加熱されたサーマルサイクラーを用いて５分間、室温に平衡化させ、６μ ｌの６％ＮＰ４ ０を各ウェルに添加した。 凍結融解実験のために、チューブをドライアイス/エタノール浴上のアルミニウムPCRブロックに3分間入れ、37℃で3分間インキュベートし、3秒間ボルテックスし、これらのステップを3回追加して繰り返した。 １ １Ｓ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）およびｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ基質（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａから）を、１ ０ ０ｎＭおよび０の最終濃度で添加した。クリアフィルタを装備したViewLux High-throughput CCD imager（Perkin Elmer）を使用して、それぞれ5倍、およびサンプルを発光強度について分析した。

384-well CETSA assay

細胞を逆トランスフェクション手順を用いてT75フラスコにトランスフェクトし、9mLの複合体（45μ l Lipofectamine2000および22.5μ g DNA）と10mLのHEK293T細胞懸濁液（1×106細胞/mL、合計10万細胞）を組み合わせた。 ２ ４時間後、細胞をトリプシン化によって回収し、上記のように１×１ ０ ６細胞／ｍｌに再懸濁し、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して３ ８ ４−ｗｅｌｌ ＰＣＲプレート（Ｒｏｃｈｅ）に分注した（１ ５μ ｌ細胞／ウェル）。 プレートを密封し、指示された温度で3.5分間加熱し、加熱相に1.5℃/秒のランプ速度および冷却相に最大ランプ速度を使用してAB qPCR machine(Roche)を使用して25℃に冷却した。 ウェル当たり３μ ｌの６％ＮＰ４ ０を添加し、細胞溶解を可能にするために３ ０分間インキュベートし、続いて１ １Ｓおよびフリマジン基質を添加した（それぞれ、１ ０ ０ｎＭお 試料をＶｉｅｗｌｕｘリーダを用いて発光強度について分析した。

1,536-well CETSA assay

細胞をトランスフェクトし、上記のように収穫した（384-wellプロトコル）。 細胞を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉを使用して、１，５ ３ ６ウェルの白色プレート（Ａｕｒｏｒａ、環状オレフィンポリマー、ｃａｔ＃ＥＷＢ０ ４ １ ０ ０ ０Ａ）中に分注した（５μ ｌの細胞／ウェル）。 その後、化合物（２ ３ｎＬ）をｐｉｎ ｔｏｏｌ（Ｗａｋｏ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用してピン止めし、３ ７℃で１時間インキュベートした。プレートを、加熱ブロック（下記参照）を使用して示された温度および時間で加熱し、２ ５℃に冷却した。１μ ｌの６％ＮＰ４ ０をウェル当たり添加し、プレートを３ ０分間インキュベートして細胞溶解を可能にし、続いて３μ ｌの１ １Ｓ（最終濃度１ ０ ０ｎＭ）およびフリマジン基質を添加した。 プレートを遠心分離し、Ｖｉｅｗｌｕｘ ｒｅａｄｅｒを用いて発光強度について分析した。 ＬＤＨＡスクリーンおよびＣＤＫ９スクリーンについては、最終濃度は０．それぞれ25Xフリマジンを使用した。 正規化コントロールには、それぞれ、ＤＭＳＯおよびＧＳＫ２ ８ ３ ７ ８ ０ ８ａ処理試料またはＬＤＨＡおよびＣＤＫ９の非加熱試料が含まれる。 ＣＤＫ９カウンタースクリーンは、以下の相違点で上記のように実施した：５μ ｌの未移入Ｈ ＥＫ２ ９ ３ｔ細胞（ＣＥＴＳＡ緩衝液中１×１ ０ ６／ｍＬ）を、１，５ ３ ６ウェルプレートに分注し、続いて、化合物の添加、３ ７℃のインキュベーション、加熱および溶解工程を上記のように行った。 続いて、５ ０ ０ｐＭ（最終）の８ ６ｂをウェルに添加し、続いて、１ ０ ０ｎＭの１ １Ｓおよび０.２ ５倍のフリマジン基質（最終）を添加した。

1,536ウェル板を加熱するためのアルミニウムブロックは、XとYでモールドイン補強リブ、Zでボトムウェル面とボトムフランジ面に接する面積の寸法を決定するために板を測定することによって設計されました。6061T6アルミニウム板から機械加工されるブロックを成形し、全軸で板のクリアランスが約0.5mmのフリーフィットとなりました。 ブロックは手動縦のフライス盤、エンドミルおよび表面製造所を使用して機械で造られた。 オーブン加熱実験のために，プレートを対流実験室オーブン（サーモフィッシャー）の中央ラックに置き，蒸発を最小限に抑えるために金属蓋で覆った。細胞溶解物中のCETSA

細胞をCETSA緩衝液中に1.0×106細胞/mL（上記で概説したように）で収集し、NP40を最終濃度0.4％に添加した。 試料をエンド・オーバー・エンドで３ ０分間回転させた後（室温）、溶解物を２ ０，０ ０ ０×ｇで１ ０分間遠心分離（４℃）によって清澄化した。 補因子（例えば、ＮＡＤ＋）を清澄化された溶解物に添加した。 温度応答実験のために、25μ lのライセートをPCRチューブに移し、3.5分間様々な温度に加熱した。 等温の線量応答の実験のために、明確にされた溶解物の5μ lはBioRAPTR FRDワークステーションを使用して1536井戸の版に分配され、サンプルはアルミニウムブロック 試料を室温に平衡化させ、基質を添加した（最終濃度：100nM11S、0.5Xフリマジン）。 発光は、上記で概説したように、Ｖｉｅｗｌｕｘ ｉｍａｇｅｒを使用して捕捉した。

ウェスタンブロット

サンプルは、溶解のための凍結融解サイクルを使用して、低スループット相補アッセイのセクションで概説されているよ サンプルを、ＭＯＰＳ緩衝液を使用して、４〜１ ２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｎｕｐａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）上で実行し、ｉＢｌｏｔ２ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍを使用して、２ ５Ｖで７分間、ＰＶＤＦ膜に移した。 膜を５％ミルク溶液（５ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ Ｈ Ｃ Ｌ、ｐＨ６；１ ５ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ；０． 抗体は: 抗ＩＤ Ｈ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃８ １ ３ ７，１：５ ０ ０）、抗ＩＤ Ｈ１（Ｒ１ ３ ２Ｈ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＭＡＢＣ１ ７ １，１：５ ０ ０）、抗ＬＤＨＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃３ ５ ８ ２，１：１ ０ ０ ０）。 抗ウサギ／マウス−ＨＲＰ（ウサギ＝Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ７ ０ ７ ４；マウス＝ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃７ ０ ７ ６）を１：２ ５ ０ ０で添加し、室温で１時間インキュベートした。 Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌｗｅｓｔｄｕｒａ溶液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて化学発光信号を生成し，Ｂｉｏｒａｄｃｈｅｍｉｄｏｃシステムを用いて捕獲した。 濃度測定分析は、Photoshopソフトウェア（Adobe）を使用して行った。

2-HGアッセイ

HEK293t細胞は、2を添加することにより、24ウェル皿に逆トランスフェクトしました。トランスフェクション複合体（0.75μ gプラスミドDNA、1.5μ l Lipofectamine2000/ウェル）に5×105細胞。 72時間後に細胞培養培地を回収し、15μ lを384ウェル不透明プレートに移した。 1.5μ lの660mM HClを各ウェルに加え、試料を室温で10分間インキュベートした。 1.5μ lの720mM Tris-HCl塩基を各ウェルに添加した。 ０）、１ ０ ０μ ＭのＮＡＤ＋、１μ ｇ／ｍｌの活性組換えｄ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ２ＨＧＤＨ；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｃａｔ：Ｐ１ ０ ０ １）、５μ Ｍのレサズリン、０．: Ｄ５ ５ ４ ０）を添加し、プレートを室温でインキュベートした。 2-HG標準曲線を100mM HEPES(pH8.0)で調製した。 蛍光は、Ｅ Ｘ：５ ２ ５、Ｅｍ：５ ９ ８／２ ５フィルタを使用して、Ｖｉｅｗｌｕｘ ｒｅａｄｅｒ上で測定した。

生化学的アッセイ

LDHA生化学的アッセイは、以前に記載されたように実施した29。 手短に言えば、３μ ｌのヒト乳酸脱水素酵素５（２ｎＭ最終）（ｎｏ． A38558H,Meridian Life Science,Inc. ０ １％Ｔｗｅｅｎ−２ ０）を、黒色固体底部１ ５ ３ ６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に加えた。 化合物ｐｉｎ移動（２ ３ｎＬ）の後、ＬＤ Ｈアッセイ緩衝液中のＮＡＤＨ（最終０． 室温で５分間培養した後、１μ ｌの検出試薬を各ウェルに添加した。 プレートを直ちにViewLux readerに移し、得られた任意のレソルフィン蛍光を0分および10分で測定した（ex540nm、em590nm）。 蛍光は、各プレート上の酵素フリーおよびDMSO処理コントロールウェルを使用して正規化した。

タグなしタンパク質を用いたALDH1A1生化学アッセイは、以前に記載されているように行われた31,37。 手短に言えば、アッセイ緩衝液（0.01％Tween20を含む100mM HEPES pH7.5）中の3μ lの20nM精製ヒトALDH1A1を、1,536ウェルの固体底黒色プレート（Greiner Bio One）中に分注した。 化合物または制御ベイ11-7085の二十から三nLは、ピンツール（和光オートメーション）を介して転送しました。 試料を１ ５分間インキュベート（室温、光から保護）し、続いて１μ Ｌの基質添加のＮＡＤ＋およびプロピオンアルデヒド（それぞれ１ｍ Ｍおよび８ ０μ Ｍの最終濃度）を行った。 プレートを遠心分離し、３ ４ ０ｎｍ励起、４ ５ ０ｎｍ発光フィルターを装備したＶｉｅｗｌｕｘ ｉｍａｇｅｒ上で５分間速度論的モードで読み取った。 ５分間にわたる蛍光強度の変化を、各プレート上の酵素フリーおよびＤＭＳＯ処理対照ウェルを用いて正規化した。ＣＤＫ９／サイクリンＫのためのＴＲ−ＦＲＥＴ Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ Ｅ Ｕキナーゼ結合アッセイを、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入し、製造業者の指示に従って行った。＜／ｐ＞＜ｐ＞ＣＤＫ９／サイクリンＫのためのＴＲ−ＦＲＥＴ Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ Ｅ Ｕキ 手短に言えば、１Ｘキナーゼ緩衝液中の４ｎＭ ＣＤＫ９／サイクリンＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＰＶ４ ３ ３ ５）、２ｎＭビオチン抗Ｈ Ｉ ｓ Ａ Ｂ、２ｎＭ Ｅ Ｕ−ストレプトアビジン、および１ ０ｎＭキナーゼトレーサー２ ３ ６溶液を含むｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ４μ ｌを、Ｂｉｏｒａｐｔｒ ＦＲＤ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用して、Ｇｒｅｉｎｅｒ１，５ ３ ６−ｗｅｌｌ白色培地結合プレート中に分配した。 ２ ３ｎＬの化合物および対照（６μ Ｍの最終濃度でのＤＭＳＯおよびＬＹ２ ８ ５ ７ ７ ８ ５）を、ｐｉｎツール移送を介してアッセイプレートに直ちに送達した。 プレートを室温で１時間インキュベートさせ、続いて、Ｔｒ−ＦＲＥＴ蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（例：３ １ ７／２ ０；Ｅｍ１：６ ２ ０／１ ２；Ｅｍ２：６ ６ ５／１ ２；遅れ時間１ ０ ０μ ｓ；積分時間２ ０ ０μ ｓ）で測定した。

乳酸産生アッセイ

HEK293t細胞を上記のように培養した。 細胞をＰＢＳですすぎ、トリプシン化し、補足物なしのｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。 細胞を直ちに１ ５ ３ ６ウェルの黒色透明底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に４μ ｌ容量のウェル当たり２ ５ ０個の細胞でめっきした。 ２μ ｌの乳酸反応混合物（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｋ６ ０ ７−１ ０ ０）を各ウェルに添加し、プレートを被覆し、室温で３ ０分間インキュベートした。 蛍光は、Ｅ Ｘ／Ｅｍ５ ２ ８／５ ９ ８ｎｍフィルタを備えたＶｉｅｗｌｕｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｉｍａｇｅｒを用いて測定した。

Aldefluorアッセイ

86bタグ付きALDH1A1活性の初期決定のために、細胞は、複合体の1mL（6μ L Lipofectamine2000および3μ g DNA）の1mLのLN18細胞懸濁液（5×105/mL）と組み合わされ、100μ l/wellの混合物は、黒、クリアボトム96ウェルプレート（コーニング）に分配された逆トランスフェクション手順を用いてトランスフェクションされた。 ２ ４時間後、培地を除去し、ＢＡＡＡ基質およびＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、それぞれ最終濃度５ ０ ０ｎＭおよび０． 続いて、ビヒクルＤＭＳＯまたはＤＥＡＢ（最終１μ Ｍ）を添加し、ＢＡＡＡのＢＡＡへの変換を可能にするために、プレートを３ ７℃で３ ０分間インキュベートした。 細胞を洗浄し、１ ０ ０μ ｌ／ウェルのＡｌｄｅｆｌｕｏｒ緩衝液を、Ｉｎ Ｃｅｌｌ２ ２ ０ ０（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での画像化の前に分配した。 高スループットアッセイのために、ＬＮ１ ８細胞を、高スループットＨ ＥＫ２ ９ ３Ｔ ＣＥＴＳＡアッセイのために上記のように逆トランスフェクション手順を使用してＴ７ ５フラスコ中にトランスフェクションした。 １ ６時間後、細胞を採取し、ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ ｄｉｓｐｅｎｓｅｒを使用して、黒色、ｏｐｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ、ＴＣ処理された１，５ ３ ６−ｗｅｌｌプレート（Ａｕｒｏｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）に播種し（１，０ ０ ０細胞／ウェル／５μ ｌ）、３ ７℃で一晩インキュベートした。 ２分析ソフトウェアのｃａｎｄｅｄ Ｍｕｌｔｉ−Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像を分析した。

膜熱完全性アッセイ

30,000HEK293t細胞を、0.5％DMSO（合計1.5％DMSO）を補充した1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル（ThermoFisher）を含む30μ lのCETSA緩衝液中で調製した。

膜熱完全性アッセイ

30,000HEK293T細胞を、0.5％DMSO（合計1.5％DMSO）を補充した。 ＤＭＳＯ耐性実験のために、ＤＭＳＯを０、１、２、または３％でＤＰＢＳに添加した。 細胞懸濁液を4度間隔を用いて42〜74℃で3.5分間加熱し、次いで湿った氷上のアルミニウムブロックに除去した。 ２％ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）と混合し、直ちにＣ−ｃｈｉｐ血球計（Ｉｎｃｙｔｏ、Ｋｏｒｅａ）を使用して計数した。 トリパン陽性（透過処理）および陰性（無傷）を、各温度でｎ＝２で計数した。 追加の細胞株については、１ ０ ０μ ｌの１％ＤＭＳＯを含有するフェノール赤色遊離ＤＭＥＭ中で、１ ０ ０万個の細胞を調製した。 細胞を４度間隔で４ ２〜９ ０℃で３分間加熱し、次いで、湿った氷上でアルミニウムブロックに除去した。 膜の完全性を上記のように評価した。

PAMPA

pION社が特許を取得した攪拌ダブルシンクPAMPA法。 （Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍ Ａ）を使用して、先に記載された化合物透過性を測定した３ ８。 化合物をph7.4に緩衝されたドナーおよびアクセプター溶液中で希釈し、DMSO濃度は0.5％であった。 透磁率の計算は、Ｐｉｏｎ Ｉｎｃを用いて行った。 ソフトウェア。

qHTS分析

各アッセイからのデータは、前に説明したように対応する対照に対してプレート単位で正規化した39。 同じ対照を、各アッセイのＺ’因子の計算にも使用した。 パーセント活性は、社内ソフトウェア（http://tripod.nih.gov/curvefit/）を使用して導出されました。 すべての濃度−応答曲線を適合させ、ＡＣ５ ０をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで計算した。; 曲線は、以前に記述されたように分類された27。 曲線下面積（ＡＵＣ）は、濃度範囲にわたる応答曲線とｘ軸との間の面積を近似するために台形則を使用して計算された。 実験内の全ての化合物について、等価濃度範囲を使用した。 活性化合物を分類するために、（ビヒクル対照の）平均からの３μの有効性カットオフを使用した。