Abstract
システインカテプシンは、主に細胞内タンパク質ターンオーバーに関与するが、MHC IIを介した抗原の処理および提示に重要な役割を果たすエンドリソソームに通常見られる酵素群である。 しかし、いくつかの病理では、システインカテプシンは大きくアップレギュレートされ、細胞外環境に分泌され、細胞外タンパク質の数を分解することが見出された。 カテプシン活性の調節における主要な役割はグリコサミノグリカンを果たし，中性ｐ ｈを含む自己触媒活性化を促進するだけでなく，カテプシンＫのコラーゲン分解活性の場合のようにそれらの活性を批判的に調節することが分かった。
1. はじめに
システインカテプシンは、パパイン様システインペプチダーゼファミリーのメンバーです。 ヒトに見られるシステインカテプシンはヒトのタンパク質分解レパートリーのごく一部に過ぎないという事実にもかかわらず、これらの酵素は、エンドリソソーム経路内の非特異的なタンパク質ターンオーバーから組織恒常性における高度に特殊化された機能に至るまで、生理学的および病理学的プロセスにおける多様な役割のために多くの注目を集めている。 最近、健康および疾患におけるシステインカテプシンの構造的および機能的特性を要約した多くの優れたレビューが発表されている。
すべてのカテプシンは同じ構造足場を共有し、パパインのような折り畳みとも呼ばれます。
すべてのカテプシンは同じ構造足場を共有します。
の構造は、分子が標準的な配向で示されているときの位置を参照して、LドメインとRドメインと呼ばれている二つのサブドメインからなる（図1）。 活性部位の裂け目は、Ｌ−ドメインとＲ−ドメインの間の分子の頂部にあり、保存された触媒的二価のＣｙｓ−Ｈｉｓを含む（図１、ｒｅｓｐ．). 一般に、パパイン様ペプチダーゼは、エンドまたはエキソペプチダーゼとして作用することができる。 典型的なエンドペプチダーゼでは、一次特異性決定基はS2部位であり、酵素上の十分に決定された部位は、基質のp3を介して残基p2’と相互作用する。 11人のヒトのうち5人（カテプシンF、K、L、S、およびV）は排他的にエンドペプチダーゼであり、カテプシンBもペプチジルジペプチダーゼであり、カテプシンXはカルボキシペプチダーゼであり、カテプシンHはアミノペプチダーゼであり、カテプシンCはジペプチジルペプチダーゼである。 残りの二つのメンバー、カテプシンOおよびWのタンパク質分解活性は、決定されるべきである。 ほとんどのシステインのカテプシンは人間の体内で遍在的に表現されるが、いくつか（カテプシンK、S、VおよびW）はより制限されたパターンで表現される。 カテプシンKは破骨細胞および滑膜線維芽細胞で豊富に発現されるが、造血、上皮、および線維芽細胞系統の他の細胞にも見出される。 カテプシンSの最高発現レベルは抗原提示細胞に見出され、カテプシンVは主に胸腺および精巣で発現され、カテプシンWの発現はCD8+リンパ球およびナチュラルキラー細胞に制限される。
2. システインのカテプシンの活動の規則
Zymogenの活発化はカテプシンの活動の規則の主要な手段の1つです。 すべてのカテプシンは、すなわち、不活性ジモゲンとして合成され、endolysosomal小胞の酸性環境で活性化される。 それらの活性化の分子機構は長い間不可解であった。 重要な情報は、プロカテプシンB、K、およびLの構造研究の組み合わせから来ており、プロペプチドは基質の反対方向にカテプシンの活性部位を通って実行されることを示し、したがって、プロペプチドの巨大かつエネルギー的に不利な構造運動なしに分子内のプロペプチドの開裂を排除し、それによって最初に示唆された単分子機構を排除し、詳細な速度論的研究は、カテプシンBの活性化が二分子プロセスであることを明確に示した。 現在のモデルは、主にカテプシンB研究に基づいており、カテプシンzymogenのプロペプチドが、いわゆる”閉じた”と”開いた”という二つの立体配座の間を切り替えることを示唆している。”中性からわずかに酸性のpHで好まれる”閉鎖した”立体配座では、プロペプチドは活性部位をブロックし、基質の加水分解を防止し、一方、pH5.0以下の酸性pHで好まれる”開いた”形態では、プロペプチドは活性側の裂け目から除去され、zymogenの低い触媒活性をもたらす。 この活性は、そのような完全に活性な成熟カテプシンBがザイモゲン分子の大部分を処理する連鎖反応を開始し、一つまたはいくつかのステップで別のカテプシンザイモゲンを活性化するのに十分である。
システインカテプシンの他の主要な調節因子は、活性部位に結合し、それによってペプチダーゼとその基質との会合を防止する高分子阻害剤である。 それらは、セリンプロテアーゼに加えて、また複数のcathepsinsを禁じることができるcystatins、thyropinsおよびserpinsを含む複数の明瞭な家族に属します。
3. システインカテプシン活性の主要な調節因子としてのグリコサミノグリカン
グリコサミノグリカン（GAGs）は、高い負電荷を有する二糖単位を繰り返 これは、複数のカルボキシル基および硫酸塩置換の存在の結果である。 Gagのほとんどは硫酸化されており、コンドロイチン硫酸塩(CS)、ケラタン硫酸塩(KS)、デルマタン硫酸塩(DS)、ヘパラン硫酸塩(HS)、ヘパリンなどが含まれているが、ヒアルロン酸(HA)は唯一の非硫酸化されたGAGである。 近年、GAGsは、その標的に対する多様な効果を有するシステインカテプシンの重要な調節因子として浮上している。 伝統的に、システインのカテプシンはlysosomalプロテアーゼとして見られ、他のlysosomal酵素のように、休止のlysosomeのintralysosomal GAGsによって禁じられるために知られていました。 しかし今日システインのカテプシンは細胞外の蛋白質分解の主要なプレーヤーとして確立されます。 グリコサミノグリカンが豊富な細胞外環境での彼らの行動は、システインカテプシンとリソソームの外のGAGsとの間の相互作用についての疑問を提起した。 細胞外タンパク質分解に最も一般的に関連する内因性ヒトシステインカテプシンの二つのグループは、カテプシンL様プロテアーゼ（ヒトではカテプシンK、L、S、V）とカテプシンBである。 システインのカテプシンはプロテオグリカンの中心蛋白質を裂くことができ、それによりサポートからGAGsを解放しますが、GAGsは細胞外スペースのシステインのカテプシンの活動そして安定性にそれから影響を与えます。
gagsによるパパイン様システインペプチダーゼの調節は、カテプシンLについて最初に記述された。 これらの初期の研究では、GAGsと様々な負に帯電した表面が実質的に成熟した形にカテプシンL zymogenの活性化を加速することが判明しました,中性に近いpH これは他の複数のcathepsins、最も重要であるcathepsins BおよびSとT.のために確認されました。 ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ寄生虫ホモログｃｏｎｇｏｐａｉｎは，Ｇａｇｓおよび他の負に帯電した表面が疾患における細胞外カテプシン活性化に主要な役割を果たすことを示唆している。 しかし、高GAG濃度でカテプシンSとの最近の知見は、この酵素があっても減速効果を示すコンドロイチン-4-硫酸（C4S）とこのような条件下でやや異 それにもかかわらず，負に荷電した多糖類デキストラン硫酸によるカテプシンの自己触媒活性化を促進することは，組換えカテプシンの調製における日常的な方法となった。
GAG支援カテプシン活性化の分子機構に関する情報の大部分は、Cagliòらの研究から来た。 モデルとして人間のカテプシンBを使用して。 図に示すように、ギャグは2つの方法で処理に寄与しているようです。 第一に、結合すると、それらはカテプシンジモゲンをより良い基質に変換するようである。 第二に、GAGsの結合は明らかにそれによって酸性pHだけでなく、中性に近いpH値でだけでなく、活性化を促進する、ザイモゲンのオープン立体配座を支持する。 これはほとんどのGagの場合のようであり、HAも活性化を加速することができたので、Gagの電荷密度に批判的に依存しないが、タンパク質-GAG相互作用には珍しい程度である。 さらに、既に四糖は、他のGAG媒介反応の数のために見つかったよりも実質的に小さいカテプシンB自己活性化の顕著な加速のために十分であった。 相互作用はイオン相互作用によって媒介される; しかし，主にプロドメイン上に位置していたプロカテプシンＬおよびＢの完全に無関係な残基が相互作用を支配することが判明したため，ザイモゲン上に保存されたＧＡＧ結合表面はないと思われた。
カテプシン活性の調節におけるギャグの他の重要な役割は、家族の典型的な代表者であるパパインに関する研究から来た。 この調節様式は、軟骨からのコンドロイチン-硫酸がカテプシンKのコラーゲン分解活性を顕著に増加させることが発見され、すぐに注目された。 この特定のペプチダーゼは骨の改造のコラーゲンの低下に責任がある唯一のプロテアーゼとして数年前に発見され、osteoporosisしょう症のような新陳代謝の骨の病気 カテプシンＫとコンドロイチン-硫酸および他のグリコサミノグリカンとの相互作用を構造的および機能的観点から詳細に検討し，グリコサミノグリカンはシステインカテプシンペプチダーゼの最初の既知のアロステリックレギュレータとして認識されている。 並行して、glycosaminoglycansとの機能的に関連した相互作用はまたシステインのカテプシン家族の他のメンバーのために文書化されました。 一緒に取られて、glycosaminoglycansはシステインのカテプシンの活動そして安定性に影響を与えるために見つけられました。 速度論的プロファイルは、通常、おそらくアロステリック機構を介して、活性部位の外の酵素との相互作用を示す双曲線メカニズムと一致しています。 安定化効果は、特に細胞外マトリックス中に見出される中性ｐ ｈにおけるシステインカテプシンの相対的不安定性のために重要である。
4. カテプシンK活性と安定性の調節
すべてのパパイン様ペプチダーゼのカテプシンKは、最も密接にグリコサミノグリカンにリンクされているカテプシンとして確立されています。 それは破骨細胞で主に表現されるプロテアーゼとして最初に識別され、厳しい骨の無秩序で起因するために損なわれた活動は示されていました。 カテプシンKは、アロステリック機構を介してグリコサミノグリカンによって特異的に調節されるほ乳類のペプチダーゼの中でユニークな活性を持つコラゲナーゼである。 骨の転換、cathepsin Kに於いての中心的な役割が原因で現在骨粗しょう症の処置のための最も有望なターゲットの1つとして考慮されます。 骨リモデリングとは別に、カテプシンKは多様な生理学的および病理学的プロセスに関与している（最近のレビューについては参照）。 プロテオグリカンを含む多くの細胞外基質を切断して、活性グリコサミノグリカンを放出し、その活性を調節することができる。 軟骨では、カテプシンKはI型およびII型コラーゲンの両方を分解し、それによって様々な炎症性関節疾患の発症に寄与する。 さらに、カテプシンKは、心血管疾患、肥満、統合失調症、および癌と関連している。
カテプシンKと異なるグリコサミノグリカンとの相互作用は、詳細な調査の対象となっている。 これらの相互作用のいくつかの側面はとらえどころのないままであるが、蓄積されたデータは、相互作用が不均一で多様であり、おそらく酵素上の複数の結合部位を含むことを示唆している。 コンドロイチン-4-硫酸(C4S)は当初、カテプシンKに対して最も劇的な効果を持つGAGとして同定されたが、コンドロイチン-6-硫酸(C6S)、デルマタン硫酸(DS)、ヒアルロン酸(HA)の効果は弱かった。 すべての試験Ｇａｇｓは広いｐ ｈ範囲にわたってカテプシンＫの安定性を増加させた。 合成基質の加水分解に対するその効果は、C6SとDSのそれと実質的に同一であったし、特異性定数の値の二重の増加をもたらしたのに対し、c4Sは、カテプシンKによるI型およびII型コラーゲンの分解に最も顕著な効果を持っていた。 後の研究では、ケラタン硫酸（KS）とC6Sは、ヘパリンとHSがカテプシンKのコラーゲン分解活性に限られた効果を持っていたのに対し、c4Sのそれと同様のカテプシンKに対する刺激効果を有することが判明した。 初期の実験では、カテプシンKのコラーゲン分解活性にCSとの複合体形成が必要であることが示唆されているが、最近の知見では、i型コラーゲンもグリコサミノグリカンの非存在下で効率的に分解できることが示されている。 それにもかかわらず、骨常駐GAGsはカテプシンKのcollagenolytic活動を増強するために示され、骨の内生GAGの集中はカテプシンKの活動に対する最高の効果のた
カテプシンKに対するCS、DS、およびヘパリン（HP）の効果の速度論的メカニズムも7.4の生理学的血漿pHで詳細に調べた。 これらの条件下では，ＣＳおよびＤＳは基質に対する親和性に支配的な効果を有する非必須活性化剤として特徴付けられた。 ＤＳはＣ ｓよりも有効であり，分子内水素結合が少ないために柔軟性が高いことに起因していた。 固有の蛍光は、GAGsの結合がカテプシンKの立体配座に影響を与えることを示したpH5.5で行われた実験とは対照的に、CSとDSは、生理学的血漿pHでコ 全体として、ヘパリンは、そのコラーゲン分解とエラスチン分解活性の両方を増加させる、生理学的血漿pHでカテプシンKの強力な活性化剤であった。 さらに、ヘパリンは酵素の半減期の5倍以上の増加に終ってこれらの条件の下でカテプシンKに対して強い安定化の効果を、もたらしました。
5. カテプシンKとGAGsの相互作用の構造的基礎
カテプシンKとC4Sの結晶構造は、相互作用の構造的基礎を明らかにした。 結合部位はカテプシンKの背面に位置し、結晶構造中のCSの3つの二糖単位と相互作用します(図2(a))。 通常のように、グリコサミノグリカン/タンパク質相互作用は、主に酵素上の負に荷電したGAG鎖と正に荷電した残基との間の静電相互作用によって媒介される。 コンドロイチン-硫酸の結合は、CSを含まないカテプシンKと比較してカテプシンKに有意な立体配座変化を引き起こさない。逆に、cs鎖はカテプシンKに結合すると曲がっている(図2(b))。 配座変化の大部分は、CS上の4つの負に荷電した基と相互作用する短いヘリカル領域Arg8-Lys9-Lys10との相互作用に起因する可能性があります(図2(c))。 さらなる密接な接触には、Ａｓｐ６、Ｉｌｅ１ ７ １、Ｇｌｎ１ ７ ２、Ａｓｎ１ ９ ０、Ｌｙｓ１ ９ １、およびＬｅｕ１ ９ ５、ならびにいくつかの追加の水媒介接触が含まれる。
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6. GAGsとカテプシンSおよびBとの相互作用
カテプシンKとは別に、他の二つのヒトパパイン様ペプチダーゼ、カテプシンSおよびBは、その成熟した形でグリコサミノグリカンによって調節されることが示されている。 カテプシンKの最も近い親戚であるカテプシンSは、中性pHで安定であるため、システインカテプシンの中では珍しい。 カテプシンSは、抗原処理における最も重要なプロテアーゼとして抗原提示細胞において主要な生理学的役割を有し、最近C4Sによって調節される カテプシンKで観察された活性化効果とは対照的に、C4SはカテプシンSによるIV型コラーゲン分解の阻害剤として作用した。 C4S、C6S、およびHSはまた、部分的な、混合メカニズムを介してZ-Phe-Arg-AMCの加水分解を阻害した。 カテプシンKと同様に、カテプシンSの微妙な立体配座の変化は、固有の蛍光分光法によってc4S結合時に観察された。 C4Sの三つの結合部位は、分子ドッキングによってカテプシンS上で予測された（図3（a））。 提案されたサイトの一つは、しかし、C4Sの観察された混合阻害プロファイルと一致していない活性部位である; 第二は分子の右下に位置し、カテプシンKの最近同定されたアロステリック部位に対応し、第三は分子の底に位置し、ほぼカテプシンKで同定された二次ヘパリン結合部位に対応する。
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カテプシンBは、システインカテプシンの中では、エンドペプチダーゼとペプチジルジペプチダーゼの両方であり、閉塞ループの立体配座に応じて、両方の活性の間にpH特異的なスイッチを提供するカテプシンB特異的構造である。 リソソームでは，低ｐｈはプロテアーゼを閉じたエキソペプチダーゼ立体配座に制限するが，細胞外環境の中性に近いｐｈはカテプシンＢのエンドペプチダーゼ活性を促進する。 細胞外のカテプシンBは関節炎の癌そしてさまざまなタイプと最も一般に関連付けられます。 このプロテアーゼはいくつかの研究で細胞表面に局在し，生理学的および病理学的条件下での細胞遊走に関与することが分かった。 分子レベルでは、ラミニン、IV型コラーゲン、およびフィブロネクチンを含む細胞外基質の数を切断することが示された。 最近，カテプシンＢは，神経クロマフィン細胞の分泌小胞においてアミロイドβペプチドを産生するβ-セクレターゼであることが示唆されている。 但し、また動物モデルのアミロイドの沈殿物を低下させることを示し、全面的な結果はcathepsin Bと内生抑制剤cystatin C間のバランスによって定められるために
HPまたはHSの結合は、アルカリpH（8.0）で不安定な酵素の安定性を増加させ、酵素のpHプロファイル全体に沿って酵素の活性をわずかに低下させる 計算シミュレーションでは、ヘパリンがこれらの条件下で分子の立体配座を安定化させることが予測されており、2つの推定されるGAG結合部位（図3（b））が酵素の両側に1つずつ予測されている。 Ｌドメイン中の推定結合部位は、５つの塩基性残基（Ａｒｇ８ ５、Ｌｙｓ８ ６、Ｌｙｓ１ ３ ０、Ｌｙｓ１ ４ １、およびＬｙｓ１ ４ ４）からなり、一方、Ｒドメイン中の１つは、２つだけを含む（Ｌｙｓ１ ５ ８およびＡｒｇ２ ３ ５）。 Rドメインの結合部位は、ドッキングシミュレーションで使用されるヘパリン二糖のような短いGAG断片に対してより高い親和性を有するのに対し、Lドメインの結合部位は長いGAG断片の結合に関連している可能性が高いことが示唆された。
7. 他のパパイン様ペプチダーゼとのGAGsの相互作用
興味深いことに、パパインはまた、GAGsと相互作用することが示されています。 生理学的関連性を持たないにもかかわらず、これらの相互作用は、家族内の調節の進化的に保存されたメカニズムを指しています。 ＨＰは双曲線混合機構によってパパインを阻害し，その立体配座に影響を与えた。 古典的なヘパリン結合コンセンサス配列は、配列187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192の形で、パパインで同定された。 構造的には、この配列は分子の右側（図3(c)）にカテプシンKで知られている両方のアロステリックサイトの間にある領域に位置しています。
また、原虫寄生虫のプロテアーゼがGAGsと相互作用するいくつかの例が記載されており、それらが宿主-寄生虫相互作用に影響を及ぼす可能性が示唆されている。 原虫寄生虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉの重要な病原因子であるカテプシンＬホモログｂｒｕｃｉｐａｉｎはｈ ｓによってアロステリックに調節されることが分かった。 この研究におけるHSの効果は微妙であり、それは小さなジペプチド基質（Z-Phe-Arg-AMC）による基質阻害を逆転させる能力を有していた。 関連寄生虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉからのクルジパインに対するＨ ｓのより強い効果が観察された。 この場合、HSは、合成基質で測定されたペプチダーゼの活性の有意な（最大6倍）増加を引き起こしたペプチダーゼの活性化剤であった。 さらに，ＨＳはｉｎｖｉｔｒｏでのクルジパインおよび生きているトリポマスチゴートによる高分子量キニノーゲンからのキニンの放出を増加させ，クルジパインに対するキニノーゲンの阻害特性を減少させた。 同様に、HPは最近Leishmania mexicanaからのカテプシンLそっくりのペプチダーゼrcpb2.8の活動を調整するために示されていました。 この場合，ＨＰとＨ ｓは双曲線混合機構によってＺ-Ｐｈｅ-Ａｒｇ-ＡＭＣの加水分解を阻害し，蛋白質の立体配座に影響を与えた。 これらの例は、GAGsとの相互作用が内因性システインカテプシンに限定されず、宿主-病原体相互作用において多様な役割を果たすことができ、侵入する病原体に対する身体の防御の一部として、または病原体の侵襲的メカニズムに寄与する因子として作用することを示している。
8. 薬理学的標的化
カテプシンKは現在、カテプシンの中で最も魅力的な薬物標的を表しているが、カテプシンSは気管支喘息や乾癬などの免疫応答の上昇に関連する疾患においても関連する標的である。 いくつかのカテプシンK阻害剤が現在開発中であり、これは酵素の活性部位を標的とする（収集される）。 現時点では、最も有望な阻害剤はオダナカチブ（Merck&Co. （株）エヌ-ティ-ティ,Whitehouse Station,NJ,USA)は、カテプシンKに対して高度に選択的なニトリル弾頭含有阻害剤である。 Odanacatibの第III相臨床試験は成功裏に締結されており、承認申請はすぐに提出される予定です。 承認されれば、この薬剤は、抗ＲＡＮＫ−リガンド抗体ｄｅｎｏｓｕｍａｂ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）などの他の新世代薬剤に対して市場での地位を確立するであろう。 テリパラチド、副甲状腺ホルモンの組換え形態（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、ならびに十分に確立されたビスホスホネートを含む。 カテプシンK/コンドロイチン-硫酸相互作用を標的とすることは、これらの治療の代替を表すであろう。 内因性コンドロイチン硫酸は、カテプシンKに対する最大の活性化効果を示すのに十分であり、その消化はカテプシンKの活性を40％低下させる。 この大きさの骨の回転の減少は多分より少なく厳しい骨密度の減少を用いる患者の処置のために十分である。 追加の利点は、カテプシンK活性自体、ならびに破骨細胞および骨芽細胞の生存率および細胞数が妨げられないままであることであろう。
利益相反
著者らは、この論文の出版に関して利益相反はないと宣言しています。
謝辞
この研究は、スロベニア研究機関（P1-0140およびJ1-3602）からBoris Turkへの助成金によって支援されています。
