Animali

Zebrafish è stato mantenuto a 28,5 °C in un ciclo di luce ACCESO / SPENTO di 14 ore in soluzione Danieau . Il cristallo combinatorio mutante (albb4/b4;nacrew2/w2;roya9/a9) è stato generato dall’incrocio sequenziale di tre diversi ceppi mutanti singoli, vale a dire nacrew2/w2 (ref. 9), roya9/a9 (rif. 4) e albb4 / b4 (rif. 18) mutanti. È importante sottolineare che sia le larve che il pesce zebra di cristallo adulto sono vitali e non mostrano anomalie morfologiche, funzionali o comportamentali visibili oltre al fenotipo della pigmentazione. Il mutante casper è stato ottenuto incrociando i mutanti nacrew2/w2 e roya9/a9, come precedentemente descritto4. La linea AB è stata utilizzata per ottenere zebrafish wild type. Le linee transgeniche utilizzate in questo studio includono Tg (elavl3: GCaMP5G)21 e Tg(elavl3:GCaMP6f) 28. Esperimenti di imaging funzionale confocale sono stati eseguiti nel mutante madreperla. Sono stati eseguiti esperimenti di imaging a foglio leggero in madreperla, casper e mutanti cristallini. Esperimenti di imaging funzionale a due fotoni sono stati eseguiti in larve di cristallo. Per trattare le larve di zebrafish con PTU abbiamo seguito procedure standard8, in particolare le larve sono state allevate in PTU 200 µM (Sigma) in soluzione Danieau da 24 ore dopo la fertilizzazione (hpf). Le larve Tg(elavl3:GCaMP5G) utilizzate per l’imaging funzionale confocale dell’attività neurale visivamente evocata nel tectum ottico sono state trattate con PTU 200 µM da 24 hpf a 3 dpf e imaged a 4 dpf. Questo lavoro è stato approvato dall’ente locale per il benessere degli animali e la revisione etica (King’s College London), ed è stato svolto in conformità con l’Animals (Scientific Procedures) Act 1986, su licenza del United Kingdom Home Office (PPL70/8057).

Imaging

Microscopia in vivo di animali interi

Le immagini di animali interi di pesci zebra adulti sono state scattate con una fotocamera reflex digitale Nikon D7000 dotata di un obiettivo macro Sigma 150 mm. Zebrafish adulti sono stati anestetizzati con 0.2% tricaina (MS222, Sigma) in acqua impianto pesce e collocato in una capsula di petri 90 mm contenente acqua impianto pesce. L’imaging delle larve è stato eseguito utilizzando un microscopio ZEISS Axioskop collegato a telecamere CCD blu EXi (Retiga) e al software di acquisizione Volocity (PerkinElmer). Il pesce zebra larvale è stato anestetizzato con tricaina allo 0,02% in soluzione Danieau e immobilizzato in agarosio a basso punto di fusione all ‘ 1% (Sigma) su vetrini.

Imaging confocale di calcio

L’imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale ZEISS LSM 710 dotato di una testa di scansione a rilevamento spettrale e un 20X / 1.0 NA obiettivo di immersione in acqua (Carl Zeiss). Serie temporali funzionali di risposte di calcio evocate visivamente nelle cellule gangliari retiniche (RGCS) sono state acquisite ad una velocità di 4,1 Hz e risoluzione 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 pixel) e 1 apertura del foro stenopeico AU. La luce di eccitazione è stata fornita da un laser multilinea a 488 nm. Le larve non anestetizzate Tg(elavl3:GCaMP5G) sono state immobilizzate in agarosio a basso punto di fusione al 2% (Sigma) preparato in soluzione Danieau e montato sul lato dorsale su una piattaforma di vetro rialzata che è stata collocata in una camera riempita su misura Danieau. L’agarosio era sufficiente a trattenere le larve in modo che non fosse necessaria l’anestesia. L’imaging è stato eseguito nel pomeriggio (1-8 pm).

Light-sheet imaging

Full-brain light-sheet imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio ZEISS Lightsheet Z. 1 dotato di due obiettivi di illuminazione 10X/0.2 NA e un obiettivo di rilevamento ad immersione in acqua 20X / 1.0 NA (Carl Zeiss). la luce di eccitazione laser a 488 nm è stata utilizzata per suscitare la fluorescenza GCaMP6f e un filtro BP 505-545 è stato utilizzato per il rilevamento della luce emessa. Lo scanner pivot (Carl Zeiss) è stato utilizzato per fornire un’illuminazione omogenea e, quindi, evitare ombre lungo l’asse di illuminazione. Lo spessore del foglio luminoso era di 5,39 µm al centro e 10,8 µm ai bordi del campo visivo. Il tempo di esposizione era di 29,97 ms. La dimensione delle immagini volumetriche era 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixel) con una risoluzione di 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 dpf nacre, casper e crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) le larve sono state prima paralizzate per 10-15 minuti in α-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium) preparato in soluzione di Danieau. Successivamente, le larve sono state immobilizzate in 2% di agarosio a basso punto di fusione (Sigma) e poste all’interno di un capillare di vetro (volume 20 µl, 701904; Marca). Successivamente abbiamo estruso la sezione del cilindro di agarosio contenente la testa della larva dal capillare e orientato le larve in modo che il lato dorsale della testa fosse rivolto verso l’obiettivo di rilevamento e gli occhi fossero rivolti verso i due obiettivi di illuminazione. L’imaging a foglio luminoso di tutto il cervello delle larve mutanti di casper è stato eseguito utilizzando un microscopio a foglio luminoso su misura costruito dal Dr. Martin Meyer (King’s College London) e dotato di un obiettivo di rilevamento XLUMPlanFLN ad immersione in acqua 20X/1.0 NA (Olympus).

Imaging a due fotoni di calcio

L’imaging funzionale a due fotoni nella retina è stato eseguito utilizzando un microscopio Nikon A1R MP dotato di un GaAsP NDD a 4 canali e un obiettivo Apocromat 25X / 1.1 NA ad immersione in acqua (Nikon). L’eccitazione è stata fornita da un laser Chameleon Ultra II Mode-locked titanium-sapphire (coerente) sintonizzato su 930 nm. Serie temporali di risposte di calcio evocate visivamente sono state acquisite ad una velocità di 4 Hz e risoluzione 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 pixel). Dopo l’attivazione della scansione laser, abbiamo aspettato 60 secondi prima di iniziare la stimolazione visiva per garantire che la retina si adattasse al livello di luce di fondo causato dal laser multi-fotone. 4 dpf crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) le larve sono state prima paralizzate per 10-15 minuti in α-bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium) preparato in soluzione di Danieau. Successivamente, le larve sono state immobilizzate in agarosio a basso punto di fusione del 2% (Sigma) e montate su una piattaforma di vetro su misura sollevata con il lato dorsale verso l’alto (inclinazione dell’angolo di 45°) e un occhio rivolto verso uno schermo LCD (vedi Stimolazione visiva) che è stato posto sotto una camera riempita di Danieau su misura. L’imaging è stato eseguito nel pomeriggio (1-8 pm).

Stimolazione visiva

Barre mobili nella preparazione confocale

Gli stimoli delle barre mobili sono stati generati come precedentemente descritto22,33. Un filtro di diffusione (3026, Rosco) è stato incollato su un lato della camera per fungere da schermo di proiezione. L’agarosio davanti all’occhio rivolto verso lo schermo di proiezione è stato rimosso, consentendo una visione senza ostacoli dell’immagine proiettata sul lato della camera. Le larve sono state posizionate a 3 cm di distanza dallo schermo e l’immagine proiettata ha riempito un campo visivo di ~97° × 63°. Gli stimoli visivi consistevano in barre luminose (56 cd/m2) o scure (8 cd/m2) (rispettivamente il 175% e il 25% della luminanza media) su uno sfondo grigio medio (32 cd/m2). Poiché non sono state notate differenze qualitative tra barre chiare e scure, i dati ottenuti utilizzando i due stimoli sono stati combinati. Ogni barra aveva una larghezza di 10°in movimento ad una velocità di 20°/s e separata dalla barra precedente di 30°, consentendo più di una barra sullo schermo in qualsiasi momento. I lunghi assi delle barre erano ortogonali alla direzione del movimento. Ciascuna delle 12 direzioni di movimento è stata presentata una volta (3 secondi) in un ordine pseudo-casuale unico per ogni fetta in ogni animale fotografato. Ogni intervallo inter-epoca era di 10 secondi per consentire ai segnali GCaMP5G di tornare alla linea di base. Anche una condizione null dello schermo vuoto di 2 secondi è stata intercalata. Gli esperimenti visivi sono stati generati e controllati utilizzando Labview e MATLAB code (MathWorks) scritti su misura, implementati su un presentatore di stimoli ViSaGe (Cambridge Research Systems) e consegnati tramite un proiettore DLP Pico (Optoma).

Griglie mobili nella preparazione a due fotoni

Griglie mobili Gli stimoli nella preparazione a due fotoni sono stati generati e controllati usando PsychoPy39 e consegnati attraverso uno schermo LCD (SKD5VA-3, tecnologia GoodWell) posizionato sotto una camera di perspex su misura. Un filtro in vetro rosso a passaggio lungo (FGL610, Thorlabs) è stato posizionato tra lo schermo LCD e la camera per consentire l’imaging simultaneo e la stimolazione visiva. Le larve sono state posizionate a 2 cm di distanza dallo schermo e l’immagine sullo schermo LCD ha riempito un campo visivo di ~140° × 100° (luminanza media di sfondo 30,4 cd/m2). Gli stimoli visivi consistevano in griglie ad onda quadra (contrasto 100%, frequenza spaziale 1,66 cicli/cm, frequenza temporale 1 cicli/s). Ogni barra di griglia aveva una larghezza di 8,5° e gli assi lunghi delle barre erano ortogonali alla direzione del movimento. Ciascuna delle 12 direzioni di movimento è stata presentata una volta (6 secondi) con un intervallo inter-epoca di 10 secondi per consentire ai segnali GCaMP6f di tornare alla linea di base. Anche una condizione null dello schermo vuoto di 6 secondi è stata intercalata. Trigger TTL (0-5-0 Volt) per registrare eventi epoch time generati tramite un dispositivo LabJack USB DAQ (U3-LV, LabJack Corporation). Dopo l’attivazione della scansione laser, abbiamo aspettato 60 secondi prima di iniziare la stimolazione visiva per garantire che la retina si adattasse al livello di luce di fondo causato dal laser multi-fotone.

Test di risposta optomotoria

Le singole larve di 5 dpf sono state posizionate in una capsula di petri da 35 mm contenente la soluzione di Danieau. Lo schermo LCD di un iPhone 5 (Apple) controllato da un MacBook Pro (Apple) tramite Duet Display (Kairos Technologies) è stato utilizzato per visualizzare griglie a onda quadra in bianco e nero (85% di contrasto, frequenza spaziale 0,33 cicli/mm, frequenza temporale 3,5 cicli/s) muovendosi in 4 direzioni (distanza angolare di 90°) nella parte inferiore della capsula di petri. Stimoli visivi sono stati generati in Keynote (Apple). Ogni larva è stata testata 5 volte in totale (ogni prova è durata 6 secondi seguiti da 10 secondi di griglie statiche) e ha ottenuto un punteggio in base alle prove a cui ha risposto (cioè, il pesce si gira e nuota nella direzione delle griglie mobili). Il comportamento delle larve è stato monitorato visivamente utilizzando uno stereomicroscopio FC M165 (Leica).

Analisi

Analisi funzionali

I dati di imaging del calcio in vivo sono stati analizzati come precedentemente descritto22,33. In sintesi, le serie temporali funzionali sono state elaborate prima dell’analisi come segue: le immagini delle serie temporali di ogni esperimento sono state corrette per il movimento con un algoritmo a corpo rigido (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), filtrate in mediana con una dimensione del kernel di 1 voxel per rimuovere il rumore scuro e sparato, e smussate spazialmente con un kernel gaussiano 2D = 2 voxel per migliorare il segnale-rumore. Una linea di base (B) che corregge le derive a bassa frequenza è stata determinata utilizzando un algoritmo a spline cubica che estrapola tra nodi mediati da 5 s dei dati dell’intervallo inter-epoca. Entrambe le variazioni di intensità del segnale relativo (ΔF = F-B; dove F = fluorescenza grezza) e variazioni di intensità del segnale normalizzate sono state calcolate ad ogni voxel. ΔF è stato utilizzato per i dati funzionali della popolazione (analisi voxel), mentre %ΔF/F0 è stato utilizzato per le regioni di interesse definite manualmente (ROI). Per ogni voxel o ROI la risposta integrale sull’intervallo dell’epoca è stata calcolata per fornire una singola metrica di risposta di ciascuna direzione presentata del movimento dello stimolo. L’integrale all’interno di ogni finestra epoch è una metrica di sintesi più resistente agli effetti di saturazione della sonda di calcio rispetto alla variazione massima del segnale. Una soglia per ogni voxel all’interno di una sequenza di immagini di acquisizione è stata determinata dalla varianza delle variazioni ΔF durante gli intervalli inter-epoca e la condizione null, soglia = 5 × SDs. Tutti i voxel che erano sopra la soglia entro almeno due epoche di presentazione visiva sono stati considerati visivamente reattivi e sottoposti a ulteriore caratterizzazione.

Per analizzare la selettività di direzione e orientamento dei voxel visivamente reattivi sono stati calcolati gli indici selettivi di direzione e orientamento (DSI eSI)40, basati su von Mises o profili gaussiani41, insieme a una stima per la loro bontà di adattamento, R2. Il DSI è stato definito come (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), dove Rpref, la risposta alla direzione preferita, era la risposta integrale sull’intervallo dell’epoca della direzione preferita. Rnull è stato calcolato in modo simile come la risposta integrale evocata dalla direzione opposta alla direzione preferita. L’SI è stato definito come (Rpref-Rorth) / (Rpref + Rorth), dove Rpref, la risposta all’orientamento preferito, era la risposta integrale sull’intervallo dell’epoca di orientamento preferito. Rorth è stato calcolato in modo simile come la risposta integrale evocata dall’orientamento ortogonale. Per ridurre al minimo il cross talk e l’over-fitting associato alle metriche DSI eSI, è stato adottato un approccio rigoroso. Per un voxel da considerare come direction-selective (DS) o orientation-selective (OS), sono stati utilizzati criteri mutuamente esclusivi: DS if DSI > 0.5 e O < 0.5; e OS seSI >0.5 e DSI< 0.5. In entrambi i casi, la bontà di fit (R2) per DSI eSI, rispettivamente, doveva essere >0.8; quindi, le curve montate spiegavano almeno l ‘ 80% delle risposte integrali. Una singola distribuzione di von-Mises è stata utilizzata per adattare le risposte dei voxel DS e stimare la loro direzione preferita dell’angolo di movimento dal centro della curva montata. La somma di due von-Mises (180 ° angular distance apart) è stata utilizzata per adattare le risposte dei voxel del sistema operativo e stimare il loro orientamento preferito degli angoli di movimento dai centri delle curve montate. La varianza circolare è stata anche calcolata per il confronto come metrica alternativa della selettività dell’orientamento (varianza circolare < 0.4)41.

Analisi morfologiche

Per determinare il volume cerebrale ripreso in 4 dpf nacre, casper e crystal Tg (elavl3:GCaMP6f) larve, abbiamo calcolato il numero di voxel GCaMP6f+ in ogni immagine volumetrica applicando la funzione di soglia adjust> seguita dal comando analyse >istogramma> list in ImageJ42. Successivamente, i valori ottenuti sono stati moltiplicati per il volume di un singolo voxel (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

Analisi statistiche

I risultati dei test statistici sono riportati in Cifre e Legende di figure. Analisi e test statistici sono stati effettuati utilizzando Prism 6 (GraphPad) o MATLAB R2014b (MathWorks). Prima di eseguire test statistici, sono state utilizzate statistiche descrittive (ad esempio, test di normalità per vedere se i valori provengono da una distribuzione gaussiana o F-test per confrontare le varianze) per scegliere il test statistico appropriato (riportato nelle legende delle figure insieme ai risultati dei test). Il criterio per la significatività statistica è stato fissato a p < 0.05.