Il compartimento mieloide del sistema immunitario innato è costituito da un certo numero di tipi di cellule le cui funzioni includono la clearance delle cellule danneggiate e apoptotiche, la presentazione dell’antigene, l’immunosoppressione e la protezione dell’ospite da microrganismi estranei.

I monociti rappresentano un sottoinsieme altamente plastico di cellule che compongono il sistema immunitario innato. Queste cellule sono in grado di attraversare il sistema vascolare e, quando esposte a citochine specifiche, subiscono la differenziazione in diversi tipi di cellule. I monociti circolanti sono classificati come non classici o classici e possono essere distinti dal loro modello di espressione del recettore della superficie cellulare. I monociti classici all’interno del display circolazione CD14+++Hi/CD16−/lo e sono presenti soprattutto in luoghi di infezione o malattia (1,2).

Monociti umani non classici all’interno del display di circolazione CD16+++Hi/CD14+/lo espressione di superficie (1). Dopo l’attivazione, i monociti subiscono diversi cambiamenti funzionali morfologici e biochimici, con conseguente differenziazione dei monociti in nuovi tipi di cellule come i macrofagi (3).

In un paradigma definito attivazione classica, i monociti umani mostrano plasticità fenotipica che può essere iniziata dall’esposizione all’interferone—γ della citochina che promuove la risposta Th1 (IFN-γ) o al fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), così come al lipopolisaccaride endotossina (LPS) (4,5). Questo meccanismo di attivazione classica genera macrofagi M1, che funzionano per produrre mediatori pro-infiammatori che forniscono protezione dell’ospite contro batteri e virus (6). I monociti umani possono anche essere differenziati in macrofagi M2 mediante esposizione a citochine che promuovono la risposta Th2 come l’interleuchina-10 (IL-10) e il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) (4,7). I macrofagi M2 esprimono alti livelli di CD206 (recettore del mannosio) e CD163, producono bassi livelli di citochine pro-infiammatorie e promuovono la guarigione delle ferite e il rimodellamento della matrice.

Le cellule dendritiche (DCs) sono un altro insieme di cellule immunitarie monociti derivati la cui funzione è quella di presentare antigeni alle cellule T per avviare una risposta immunitaria adattiva basata sulle cellule T. I DCS possono essere categorizzati in gran parte in tre sottogruppi: classici (CDCS), plasmacitoidi (PDCS) e monociti derivati (moDCs). I CDC si trovano tipicamente nel tessuto linfoide, nella milza, nei linfonodi e nel midollo osseo. I PDC assomigliano alle plasmacellule e si trovano tipicamente nella circolazione sanguigna (8). I monociti possono essere differenziati in DCS, che sono spesso definiti DCS derivati dai monociti (moDCs), dopo l’esposizione al fattore di stimolazione della colonia dei macrofagi granulociti (GM-CSF) e IL-4 (9,10). I MODC sono stati segnalati per esprimere marcatori di superficie cellulare CD80, CD83, CD86 e CD1a in vitro (11-13). Mentre i MODC differiscono dai macrofagi per forma e funzione cellulare, condividono l’espressione di diversi antigeni di superficie cellulare, tra cui CD11c, CD206 e CD1a (14).

Diversi gruppi hanno riportato una differenziazione di successo dei monociti CD14 + umani nei macrofagi; tuttavia, molti di questi protocolli pubblicati sono dissimili. Una variazione comune tra questi metodi è l’inclusione (15) o l’omissione (16) di IL-6. Un’altra differenza tra i protocolli è la tempistica del trattamento. Questa mancanza di coerenza tra i protocolli è problematica.

Per affrontare questi problemi, abbiamo esaminato e confrontato l’inclusione e l’omissione di IL-6 nel trattamento con citochine utilizzato nelle comuni metodologie di differenziazione dei monociti umani. Abbiamo scoperto che in assenza di IL-6, queste strategie producono cellule con un basso grado di omogeneità, che può produrre risultati sperimentali ambigui. In secondo luogo, per affrontare ulteriormente questo problema, abbiamo sviluppato una nuova strategia graduale in vitro con l’inclusione di IL-6. Abbiamo scoperto che questa strategia ha notevolmente migliorato l’omogeneità cellulare dei macrofagi M1 e M2 e dei MODC differenziati dai monociti CD14+ umani. Questo miglioramento della metodologia fornirà ai ricercatori modelli migliori per studiare il sistema immunitario e gli stati patologici.

Materiali e metodi

Preparati cellulari

Buffy coats sono stati raccolti dal sangue intero di cinque o più donatori maschi sani che erano stati raggruppati. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state preparate da buffy coats mediante centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll-Paque (1.077 g/ml) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) a 400 × g a 18°C per 35 min per separare i costituenti del sangue. Le cellule sono state lavate più volte utilizzando 1× PBS e contate utilizzando un cellometro Nexcelom Auto T4 plus cell counter (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Una volta contati, i monociti CD14 + sono stati isolati dalle PBMC mediante etichettatura magnetica utilizzando microsfere coniugate MAB CD14 (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) seguita da separazione con colonne magnetiche (130-042-401 e 130-042-302; Miltenyl Biotec) secondo le istruzioni del produttore, con una sola eccezione: quando si raccolgono le cellule CD14+ dalla colonna magnetica, le cellule sono state scaricate inizialmente utilizzando un tampone da 5 mL basandosi solo sulla gravità (senza l’uso dello stantuffo in dotazione). Dopo il risciacquo iniziale da 5 mL, è stato aggiunto un tampone supplementare da 5 ml e lavato delicatamente con lo stantuffo fornito in dotazione.

Coltura cellulare

I monociti CD14+ umani sono stati seminati a una densità cellulare di 2,0–3.0 × 105 cellule / mL in mezzo RPMI 1640 con 2 mm / L L-glutammina (Life Technologies, Frederick, MD) integrato con 10% di calore inattivato FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicillina (Life Technologies), e 100 mg/mL streptomicina (Life Technologies) a 37°C in un umidificato 5% CO2 incubatore. Per differenziare le cellule in macrofagi M1, le citochine utilizzate erano GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) e LPS endotossina (20 ng / mL). Per la differenziazione dei macrofagi M2, le citochine utilizzate erano il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), IL-4, IL-6 e IL-13 ad una concentrazione di 20 ng/mL (PeproTech). I MODC sono stati generati dall’aggiunta di GM-CSF (100 ng/mL) e IL-4 (20 ng/mL). La tempistica di ciascuna strategia è ulteriormente descritta nella Figura 1.

Citometria a flusso

Macrofagi e DCS polarizzati sono stati coltivati per 9 giorni su piatti da 10 cm2 (BD Falcon, Billerica, MA). Il giorno 9, sono stati raccolti i supporti e le cellule non aderenti; le cellule aderenti sono state lavate usando 1× PBS, rimosse usando il buffer di dissociazione cellulare (Life Technologies) e poi aggiunte ai supporti raccolti/cellule non aderenti da lavare. Sospese le cellule sono state centrifugate e lavato due volte (1× PBS, 0,5% DI BSA, 2 mM EDTA), contati, e poi incubate con fluoroforo primario coniugato anticorpi contro CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-caderina (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), e CD64 (FITC) nel buio per 45 min a 4°C. la Fluorescenza è stata rilevata da un S3TM Cell Sorter (Bio-Rad, Hercules, CA).

Test di endocitosi

I macrofagi umani polarizzati sono stati placcati in vetrini a camera a 4 pozzetti (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) ad una densità di 3.0 × 105 cellule / mL al giorno 7 e ha continuato ad essere coltivato con le citochine appropriate per i restanti 2 giorni. Perylene bisimide (PBI-12-Man) (17) è stato un dono gentile da Ke-Rang Wang presso l’Università di Hebei. Le cellule sono state coltivate con 10 µg/mL PBI-12-Man per 30 min a 37°C, quindi lavate con 1× PBS. Le celle sono state fissate utilizzando etanolo al 70% e montate con DAPI (P36962; Life Technologies). Per visualizzare l’endocitosi dell’uomo PBI-12, le diapositive sono state eccitate ed emesse a 585 nm. Le immagini a fluorescenza rossa sono state quantificate utilizzando il software di scansione di diapositive Metafer (MetaSystems, Boston, MA). I test statistici sono stati eseguiti utilizzando il software MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc., Natick, MA). I test Rank-sum sono stati eseguiti per verificare la significatività statistica univariata tra i campioni.

Immunofluorescenza

I macrofagi sono stati differenziati utilizzando metodi precedentemente descritti per 7 giorni e poi trasferiti in vetrini da camera di vetro a 4 pozzetti Nunc Lab-Tek II con le citochine appropriate. Le cellule sono state lasciate crescere per i prossimi 7 giorni; 14 giorni dopo la placcatura iniziale, le cellule sono state fissate utilizzando etanolo al 70% e montate utilizzando Prolong Diamond anti-fade mountant con DAPI. Le cellule sono state visualizzate utilizzando il contrasto di fase e la microscopia a fluorescenza su EVOS FL Auto (Life Technologies).

Risultati e discussione

Strategie e condizioni per la differenziazione umana dei monociti CD14+

Abbiamo iniziato valutando quali strategie erano più efficaci nel produrre popolazioni omogenee di macrofagi umani M1 e M2 e MODC. I monociti umani CD14+ sono stati isolati e seminati su placche di coltura tissutale per essere differenziati in macrofagi o MODC in vitro. Abbiamo quindi testato tre condizioni di trattamento specifiche per determinare il metodo che ha prodotto le popolazioni di macrofagi e moDC più uniformi. Per la prima condizione, abbiamo coltivato le cellule con l’aggiunta di solo GM-CSF o M-CSF per 9 giorni (Figura 1). Questa condizione è definita “solo” (Figura 1). La seconda strategia di trattamento è stata quella di esporre continuamente le cellule all’ambiente di citochine applicabile al giorno 0, ricostituire i media, le citochine e gli LPS il giorno 5 e analizzare le cellule il giorno 9. Questa condizione è definita “continua” (Figura 1). La terza strategia era quella di stimolare i monociti CD14+ con GM-CSF o M-CSF per 5 giorni, seguita dall’aggiunta di nuovi supporti contenenti LPS per i macrofagi M1 umani e tutte le citochine applicabili per un determinato gruppo di trattamento (GM-CSF, IFN-γ e IL-6 per i macrofagi M1 o M-CSF, IL-4, IL-13 e IL-6 per i macrofagi M2). Questa strategia di trattamento è stata definita “graduale” (Figura 1). Trattare i monociti CD14 + con 100 ng / mL di GM-CSF e IL-4 per 5 giorni e sostituire i supporti e tutte le citochine al giorno 5 ha generato MODCS. I MODC sono stati quindi stimolati con IL-6 e LPS per 24 ore prima dell’analisi (giorno 8) per promuovere la maturazione e l’attivazione della DC. Questo metodo di coltura è stato definito “stimolato” (Figura 1). I MODC che non hanno mai ricevuto l’esposizione a IL-6 e LPS sono stati definiti “non stimolati” (Figura 1). Dopo 9 giorni di coltura nelle condizioni specifiche sopra descritte, sono state analizzate l’espressione del recettore della superficie cellulare e la funzionalità cellulare.

L’esposizione a IL-6 aumenta l’efficienza di polarizzazione M2 in vitro

Studi precedenti hanno dimostrato che l’esposizione dei macrofagi alla citochina IL-6 non solo altera la differenziazione dei monociti da una cellula dendritica a un fenotipo macrofago, ma che l’esposizione a IL-6 aumenta anche il profilo di espressione dell’mRNA associato ai macrofagi M2 (15,18). Per confermare questi risultati e per testare l’effetto di IL-6 sulla polarizzazione M1 e M2, i monociti umani CD14+ nelle condizioni di coltura continua e graduale sono stati trattati con o senza IL-6. L’esame dell’espressione del marcatore di superficie dei macrofagi M2 in cellule differenziate M1 non ha mostrato cambiamenti significativi quando coltivate con IL-6 (Figura 2), suggerendo che il trattamento con IL-6 non shunt M1 macrofagi polarizzati verso un fenotipo M2.

Al contrario, l’analisi dei gruppi di colture di macrofagi M2 in continuo e graduale ha rivelato che il trattamento con IL-6 ha aumentato l’espressione dei marcatori di superficie dei macrofagi M2. Nelle popolazioni di macrofagi M2, sia l’espressione CD206 che CD36 è rimasta elevata ed è apparsa inalterata quando esposta a IL-6 (Figura 2, A e B). CD163 ed E-caderina, tuttavia, hanno mostrato aumenti significativi dei livelli di espressione superficiale e dell’omogeneità della popolazione quando trattati con IL-6 (Figura 2, C e D). Ciò è dimostrato da una diminuzione dei picchi CD163 e E-cadherin a bassa espressione (frecce rosse in Figura 2, C e D) e dallo spostamento risultante verso una popolazione che esprime omogeneamente alta.

IL-6 è spesso usato per indurre la maturazione moDC (18,19). Al fine di determinare se il trattamento con IL-6 potesse causare MODC indesiderati all’interno delle popolazioni polarizzate dai macrofagi, è stata esaminata l’espressione del marker di superficie DC maturo (CD83). L’analisi citometrica a flusso ha dimostrato che nessuna delle condizioni di coltura M1 o M2 ha promosso un aumento significativo dell’espressione di CD83 (Figura 2E). Ciò suggerisce che non vi era alcuna contaminazione moDC all’interno di queste popolazioni di macrofagi o che qualsiasi MODC contaminante era IL-6 insensibile.

La polarizzazione graduale porta ad una maggiore espressione dei marcatori canonici M1, M2 e MODC della superficie cellulare

Per confermare che i monociti CD14+ umani erano completamente differenziati in macrofagi o MODC entro il giorno 9, la citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare i marcatori della superficie cellulare e valutare le differenze morfologiche (Figura 3, A-C). I monociti CD14 + umani sono stati differenziati (Figura 1) per valutare quale strategia avrebbe prodotto un’elevata espressione di marcatori di superficie appropriati di tipo cellulare. Un pannello di marcatori di superficie cellulare è stato testato per ciascuno dei tipi di cellule. Il nostro pannello M1 cell-surface marker consisteva dei marcatori canonici CD86 e CD80 (Figura 3, A-C). Per il pannello dei macrofagi M2, abbiamo usato CD206, CD163, CD124 (recettore IL-4-α), E-caderina e CD36 (recettore scavenger di classe B) (Figura 3, A-C). Per moDCs, CD83, CD86 e CD1a sono stati utilizzati. I livelli di espressione superficiale per tutti i marcatori testati sono stati determinati per tutti i tipi di cellule (figura supplementare S1). L’intensità mediana della fluorescenza (IFM) è stata calcolata e mostrata come variazione di piega rispetto al corrispondente controllo non colorato (vedere tabelle nella Figura 3).

È interessante notare che l’analisi dei marcatori di superficie cellulare M2, CD36 e IL-4Ra, nei macrofagi polarizzati solo GM-CSF M1 ha rivelato aumenti drammatici (Figura 3A). Quando si confrontavano le cellule trattate solo con GM-CSF con tutti i gruppi di trattamento M1, il gruppo trattato solo con GM-CSF presentava un’espressione CD36 nettamente superiore. Queste cellule GM-CSF – only hanno anche espresso bassi livelli dei marcatori associati a M1 CD86 e CD80. Allo stesso modo, la condizione continua ha prodotto celle che non solo erano basse in CD86 e CD80, ma erano anche alte nell’espressione di CD36 e IL-4ra. Al contrario, quando i monociti CD14+ umani sono stati differenziati sotto la condizione graduale M1, CD86 e CD80 sono stati notevolmente regolati, mentre l’espressione di CD36 e IL-4ra è rimasta bassa. Ulteriori analisi citometriche di flusso dell’espressione del marcatore cellulare-superficie hanno rivelato che i macrofagi M1 avevano un’espressione inferiore di CD206, CD36 e CD163 rispetto ai macrofagi M2 sia sotto esposizione graduale che continua (Figure supplementari S1 e S4). Inoltre, queste varie condizioni di coltura generano cellule con caratteristiche morfologiche e struttura distinte (Figura 3A). Mentre le cellule trattate solo con GM-CSF sembrano essere più grandi, i dati FSC (forward scatter) hanno rivelato differenze minime di dimensioni tra i gruppi (Figure supplementari S2 e S3). Il confronto della complessità interna (SSC) tra le condizioni di trattamento ha rivelato un aumento della granularità nel GM-CSF e nei gruppi a fasi (Figura supplementare S2). Insieme, questi risultati mostrano che il trattamento GM-CSF-only e continuo produce cellule che esprimono bassi livelli di marcatori M1 e alti livelli di determinati marcatori M2, oltre a presentare cambiamenti morfologici.

Le condizioni di coltura dei macrofagi M2 hanno prodotto risultati leggermente più ambigui rispetto a quelli riscontrati con le condizioni di coltura dei macrofagi M1 (Figura 3B). Rispetto al gruppo M-CSF-only, i gruppi graduale e continuo hanno mostrato un aumento dei livelli di espressione di CD206. Al contrario, i livelli di superficie di IL-4Ra erano marcatamente più alti in condizioni di M-CSF-only, rispetto sia continuo che graduale. L’espressione di E-caderina è rimasta uniforme tra i gruppi, mentre CD163 era significativamente più alto sia nei gruppi M-CSF-only che in quelli a fasi. Un’osservazione di nota è che il gruppo di esposizione continua era costantemente molto meno omogeneo per quanto riguarda l’espressione del marcatore della superficie cellulare. Ciò è illustrato dalla distribuzione bimodale e dalla grande varianza nei livelli di espressione trovati sull’istogramma. Inoltre, differenze morfologiche drammatiche possono essere viste tra i gruppi di trattamento. Sulla base delle immagini a contrasto di fase, il gruppo M-CSF-only ha prodotto celle che sembrano essere più piccole e altamente granulari (Figura 3B). L’analisi citometrica a flusso dimostra che queste cellule hanno dimensioni simili (FSC), tuttavia, vi è un aumento della granularità cellulare nelle condizioni di trattamento graduale e continuo (Figura supplementare S2). Infine, la privazione della glutammina ha alterato la polarizzazione M2, dimostrando che i prodotti metabolici sono necessari nell’ambito di questa strategia (Figura supplementare S5). Complessivamente, questi dati suggeriscono che le condizioni a fasi producono la massima efficienza per la polarizzazione dei macrofagi M2.

Abbiamo quindi esaminato l’espressione del marcatore superficiale di MODC che erano non stimolati o stimolati con IL-6 e LPS 24 h prima dell’analisi citometrica a flusso. La stimolazione con IL-6 e LPS ha portato ad un aumento dell’espressione CD80, CD83 e CD86 (Figura 3C). L’espressione della superficie cellulare CD83 del marker DC maturo è aumentata drasticamente all’attivazione utilizzando IL-6 e LPS il giorno 8 rispetto al gruppo non stimolato. Ciò ha confermato che IL-6 e LPS sono stati in grado di promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (Figura supplementare S1L). L’espressione di CD1a è rimasta uniforme tra i gruppi non stimolati e stimolati. È interessante notare che i DCS stimolati sono rimasti in sospensione, tuttavia, sembrano iniziare ad aggregarsi e aderire l’uno all’altro (Figura 3C). Questi risultati confermano i precedenti risultati riguardanti la polarizzazione moDC e forniscono un controllo aggiuntivo per l’analisi dei marcatori di superficie per identificare popolazioni MODC indesiderate all’interno delle varie condizioni di coltura dei macrofagi.

I macrofagi M2 generati dall’esposizione graduale alle citochine possiedono funzionalità associate a M2

Il recettore del mannosio (CD206) è un recettore endocitico e di riciclaggio che è altamente espresso nelle nostre popolazioni di macrofagi M2 in condizioni di trattamento graduale. Successivamente abbiamo voluto valutare l’assorbimento endocitico mediato da CD206 nei nostri macrofagi. Ciò è stata determinata facendo uso di PBI-12-Man, un agente biocompatibile che fluoresces sopra il legame al ricevitore del mannosio (17). Dopo un trattamento di 1 ora di macrofagi M1 e M2 con PBI-12-Man, la fluorescenza rossa di PBI-12-Man era prevalentemente intracellulare nei macrofagi M2 in condizioni di trattamento graduale e continuo (Figura 4, A e B). Questo risultato suggerisce che il legame della superficie cellulare con CD206 e l’endocitosi provoca la localizzazione vescicolare. Ciò concorda con i dati precedenti della citometria a flusso, che hanno dimostrato che in condizioni di trattamento graduale, i macrofagi M2 mostravano una maggiore espressione della superficie cellulare di CD206 rispetto alla popolazione di macrofagi M1. È interessante notare che, abbiamo scoperto che solo le cellule GM-CSF mostravano alti livelli di endocitosi PBI-12-Man (Figura 4, A e B). Ciò si correla con i nostri dati citometrici di flusso (Figura 2), che hanno dimostrato che le condizioni di coltura solo GM-CSF producono cellule M1 con espressione di marker di superficie associata a M2. Complessivamente, dimostriamo che queste cellule possedevano le normali caratteristiche dei macrofagi e che CD206 era funzionale nella popolazione di macrofagi M2.

Dopo 14 giorni di coltura, i macrofagi M2 hanno anche mostrato la capacità di fondersi, raggiungendo dimensioni superiori a 200 µm e contenendo più nuclei per cellula (Figura 4C). Questi assomigliavano a cellule giganti multi-nucleate (MNGCS) che sono state segnalate per possedere abilità fagocitiche e di altro tipo (20). Inoltre, gli MNGC sono stati associati a materiale estraneo nel corpo, tubercolosi e cancro (20-23). Questa fusione cellulare è stata trovata esclusivamente nelle nostre popolazioni di macrofagi M2 ed era molto più significativa nella condizione graduale M2. Mentre i gruppi M-CSF-only avevano alcune cellule multinucleate (Figura 4C), le loro dimensioni e il loro numero erano molto più bassi rispetto al gruppo graduale. Data la capacità di queste cellule di svolgere questa funzione associata ai macrofagi, questi risultati indicano inoltre che le condizioni di coltura graduale producono macrofagi altamente simili a M2.

Qui abbiamo descritto il nostro nuovo protocollo phased per la polarizzazione dei macrofagi. Abbiamo scoperto che l’inclusione di IL-6 e la tempistica del trattamento di polarizzazione graduale sono assolutamente fondamentali nella generazione dei macrofagi più simili a M1 e M2 in vitro. Questa scoperta è stata testata rigorosamente rispetto ad altri metodi di polarizzazione. Per questo motivo, riteniamo che il metodo di polarizzazione graduale offra un sostanziale passo avanti. Ciò darà ai ricercatori standard sperimentali unificati per produrre popolazioni omogenee di macrofagi da utilizzare in vitro e la capacità di confrontare i loro risultati. Sebbene questo protocollo offra una serie di miglioramenti rispetto alle attuali strategie di polarizzazione, riteniamo che ulteriori ricerche e ottimizzazione dei tempi di esposizione e del cocktail di citochine sarebbero utili. Questo ci aiuterà a comprendere ulteriormente i complessi ruoli dei macrofagi M1 e M2 in varie forme di progressione della malattia e ad avanzare lo sviluppo di nuove terapie.