Composti

Inibitori di ALDH1A1 sono stati recentemente descritti30. Gli inibitori della LDHA sono stati precedentemente descritti in Rai et al.29. Gli inibitori dell’IDH1 sono stati precedentemente descritti in Urban et al. e Davis et al.24,36. Altri composti utilizzati nello studio sono stati metotrexato (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomina (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) e LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Per qHTS, i composti nella piastra di interrogatorio del meccanismo (MIPE) sono stati testati in 11 punti (intraplate, fattore di diluizione 1:3). La collezione di inibitori della chinasi contenente 977 inibitori della chinasi è stata testata in dosi di 7 punti (interplate, fattore di diluizione 1:5). In tutti i casi, DMSO è stato utilizzato come veicolo.

Clonazione

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. I frame di lettura aperti (ORFs) dei geni di interesse sono stati clonati nelle dorsali dell’accettore utilizzando siti BamHI/EcoRI (N-terminale) o NheI/Bamhi (C-terminale) mediante PCR amplificando la regione codificante con oligonucleotidi compatibili per infusione, definiti in dettaglio nella tabella supplementare S1. I costrutti IDH1, LDHA, DHFR, GC e ALDH1A1 sono stati preparati mediante sintesi genica GeneArt (ThermoFisher) in pcDNA3.1 (+). Per la clonazione del gateway (solo costrutti IDH2), è stato creato un vettore di destinazione contenente il tag 86b sostituendo il tag V5 in pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

Coltura cellulare

Le cellule HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468 e HT-29 sono state ottenute da ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 e HTB-38, rispettivamente). HuCC-T1 e CC-LP-1 erano un gentile dono del Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). Le cellule HEK293T sono state coltivate in DMEM (4,5 g/L di glucosio) con siero bovino fetale al 10% (FBS), 6 mm di L-glutammina, 1 mm di sodio piruvato, 50 U/mL di penicillina e 50 µg / mL di streptomicina. Le cellule LN18, HT-29, CC-LP-1 e HeLa sono state coltivate nel mezzo sopra indicato, senza piruvato di sodio. Le cellule OV-90 sono state coltivate in una miscela 1:1 di MCDB 105 medium (Cell Applications Inc.) e mezzo M199 (HyClone, GE), integrato con 15% FBS, 1% penicillina-streptomicina (Life Technologies) e una concentrazione finale di 1,85 g/L bicarbonato di sodio (HyClone, GE). Le cellule 22RV1, HuCC-T1 e MDA-MB-468 sono state coltivate in RPMI 1640 integrato con 10% FBS, 6 mm L-glutammina, 100 unità/ml penicillina, 100 µg/mL streptomicina. Tutte le cellule sono state coltivate a 37 °C in un incubatore umidificato mantenuto al 5% di CO2 e testato negativo per micoplasma utilizzando un kit di rilevamento MycoAlert (Lonza).

Produzione e purificazione di proteine e peptidi ricombinanti

Le proteine 11S e 86b sono state prodotte da GenScript. Per il frammento 11S ricombinante, la sequenza di DNA codificante è stata fusa con un tag 6x His per facilitare la purificazione a valle e la sequenza è stata subclonata in un vettore di espressione di E. coli. Le cellule BL21 Star (DE3) sono state trasformate con plasmidi ricombinanti e una singola colonia è stata inoculata in mezzo LB contenente IPTG per l’induzione dell’espressione proteica. L’analisi SDS-PAGE e Western blot è stata utilizzata per monitorare l’espressione e selezionare i tempi di raccolta ottimali. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione e i pellet sono stati lisati mediante sonicazione. Dopo la purificazione del suo tag, le frazioni sono state sterilizzate attraverso un filtro da 0,22 µm. Le proteine sono state analizzate da SDS-PAGE e Western blot utilizzando protocolli standard e un mouse-anti-His mAb (GenScript, Cat.No.A00186). La concentrazione di proteine purificate è stata determinata utilizzando un test di proteina Bradford con BSA come standard. La proteina è stata immagazzinata in 1X PBS, 10% di glicerolo, pH 7,4 e la purezza è stata di circa il 90%, come stimato dall’analisi densitometrica del gel SDS-PAGE macchiato di blu di Coomassie in condizioni di riduzione. Il peptide 86b dell’aminoacido 15 è stato immagazzinato in dh2o ultrapuro ed era 99,9% puro da HPLC.

Test di integrazione CETSA a basso throughput (piastre o strisce PCR a 96 pozzetti)

Le cellule sono state trasfettate in piatti a 6 pozzetti utilizzando una procedura di trasfezione inversa, in cui 1,25 ml di complessi (6,25 µL di Lipofectamina 2000 e 3 µg di DNA per pozzetto) sono stati combinati con 1,25 ml di sospensione cellulare HEK293T (1 × 106 / mL, 1,25 × 106 cellule totali). Per CDK9, sono stati utilizzati 2 µg di DNA per pozzetto. Dopo 24 ore (48 ore per CDK9), le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione e risospese a 1 × 106 cellule/mL (se non diversamente indicato) in tampone CETSA contenente DPBS (con CaCl2 e MgCl2) più 1 g/L di glucosio, 1X cocktail di inibitori della proteasi Halt (ThermoFisher) e 0,5% DMSO (DMSO non è stato aggiunto per esperimenti che hanno ricevuto un successivo trattamento con composti e veicoli). Per gli esperimenti sull’intervallo di temperatura (senza dose composta o singola), i campioni sono stati assegnati a strisce di PCR a 30 µL per provetta. Il composto è stato aggiunto e le cellule sono state incubate a 37 °C per 1 h. I campioni sono stati quindi riscaldati per 3.5 min utilizzando un ciclatore termico preriscaldato, permesso di equilibrare a temperatura ambiente, e 6 µL di 6% NP40 è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Per gli esperimenti di congelamento-disgelo, i tubi sono stati posti in un blocco di PCR di alluminio su un bagno di ghiaccio secco/etanolo per 3 min seguito da incubare a 37 °C per 3 min, vortexing per 3 sec e ripetere questi passaggi tre volte supplementari. Sono stati aggiunti 11S (GenScript) e substrato di furimazina (dal sistema di dosaggio Nano-Glo Luciferasi, Promega), a concentrazioni finali di 100 nM e 0.5X, rispettivamente, e campioni sono stati analizzati per l’intensità della luminescenza utilizzando un imager CCD ad alta velocità ViewLux (Perkin Elmer) dotato di filtri trasparenti.

Test CETSA a 384 pozzetti

Le cellule sono state trasfettate in flaconi T75 utilizzando una procedura di trasfezione inversa, in cui 9 ml di complessi (45 µL di Lipofectamina 2000 e 22,5 µg di DNA) sono stati combinati con 10 mL di sospensione cellulare HEK293T (1 × 106 cellule / mL, 10 milioni di cellule totali). Dopo 24 ore, le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione, risospese a 1 × 106 cellule/ml come descritto sopra e dispensate (15 µL cellule/pozzetto) in piastre PCR da 384 pozzetti (Roche) utilizzando un Multidrop Combi (ThermoFisher). Composti (63 nL) o DI controllo del veicolo (63 nL) sono stati successivamente bloccato per mezzo di un perno strumento (GNF) e incubate per 1 h a 37 °C. le Piastre sono state sigillate e riscaldata alla temperatura indicata per 3,5 min e raffreddato a 25 °C, utilizzando AB qPCR macchina (Roche) utilizzando la velocità della rampa di 1,5 °C/sec per la fase di riscaldamento e max velocità di rampa per la fase di raffreddamento. Tre µL di 6% NP40 sono stati aggiunti per pozzetto e incubati per 30 min per consentire la lisi cellulare seguita dall’aggiunta di 11S e substrato di furimazina (a concentrazioni finali di 100 nM e 0,5 X, rispettivamente). I campioni sono stati analizzati per l’intensità della luminescenza utilizzando un lettore ViewLux.

Test CETSA a 1.536 pozzetti

Le cellule sono state trasfettate e raccolte come sopra (protocollo a 384 pozzetti). Le cellule sono state dispensate (cella 5 µL / pozzetto) in piastre bianche da 1.536 pozzetti (Aurora, polimero olefinico ciclico, cat# EWB041000A) utilizzando un Multidrop Combi. Composti (23 nL) sono stati successivamente bloccato per mezzo di un perno strumento (Wako Automazione) e incubate per 1 h a 37 °C. le Piastre sono state riscaldata alla temperatura indicata e l’ora utilizzando un blocco riscaldante (vedi sotto) raffreddato a 25 °C. Una µL del 6% NP40 è stato aggiunto per bene e le piastre sono state incubate per 30 minuti per consentire la lisi delle cellule, seguito dall’aggiunta di 3 µL 11S (concentrazione finale di 100 nM) e furimazine substrato. Le piastre sono state centrifugate e analizzate per l’intensità della luminescenza utilizzando un lettore ViewLux. Per gli schermi LDHA e CDK9, una concentrazione finale di 0,5 X e 0.25X furimazine è stato usato, rispettivamente. I controlli di normalizzazione includono campioni trattati con DMSO e GSK2837808A o campioni non riscaldati per LDHA e CDK9, rispettivamente. Il controschermo CDK9 è stato eseguito come sopra con le seguenti differenze: 5 µL di celle HEK293T non trasformate (1 × 106/mL in tampone CETSA) sono state erogate in piastre da 1.536 pozzetti seguite da aggiunta di composti, incubazione a 37 °C, riscaldamento e fasi di lisi come sopra. Successivamente, 500 pM (finale) di 86b è stato aggiunto ai pozzetti, seguito dall’aggiunta di 100 nM 11S e 0,25 X substrato furimazina (finale).

Il blocco di alluminio per il riscaldamento pari a 1.536-bene piastra è stata progettata, misurando una piastra per determinare le dimensioni dell’area delimitata da modellare-in nervature di rinforzo in X e Y, e in fondo pure la faccia inferiore e la faccia della flangia in Z. Quindi un blocco per essere lavorati da alluminio 6061 T6 alluminio piastra è stata modellata, che sarebbe un free fit con circa 0,5 mm di spazio per la piastra in tutti gli assi. Il blocco è stato lavorato utilizzando una fresatrice verticale manuale, frese e un mulino faccia. Per gli esperimenti di riscaldamento del forno, le piastre sono state collocate nel rack centrale del forno da laboratorio a convezione (ThermoFisher) e coperte con coperchi metallici per ridurre al minimo l’evaporazione.

CETSA nei lisati cellulari

Le cellule sono state raccolte nel tampone CETSA a 1,0 × 106 cellule / mL (come indicato sopra) e NP40 è stato aggiunto ad una concentrazione finale dello 0,4%. Dopo la rotazione dei campioni end-over-end per 30 min (temperatura ambiente), i lisati sono stati chiarificati mediante centrifugazione a 20.000 × g per 10 min (4 oC). Il cofattore (ad esempio NAD+) è stato aggiunto al lisato chiarito. Per gli esperimenti di risposta alla temperatura, 25 µL di lisato sono stati trasferiti in tubi PCR e riscaldati per 3,5 min a varie temperature. Per esperimenti isotermici dose-risposta, 5 µL di lisato chiarificato sono stati erogati a piastre a 1536 pozzetti utilizzando una workstation BioRAPTR FRD e i campioni sono stati riscaldati su un blocco di alluminio. I campioni sono stati autorizzati ad equilibrare a temperatura ambiente e il substrato è stato aggiunto (concentrazione finale: 100 nM 11S, 0,5 X furimazina). La luminescenza è stata catturata utilizzando un imager ViewLux come descritto sopra.

Western blots

I campioni sono stati elaborati come descritto nella sezione di analisi di complementazione a basso throughput, utilizzando cicli di congelamento-disgelo per la lisi. I lisati sono stati centrifugati a 15.200 × g per 20 min a 4 °C. I campioni sono stati eseguiti su un gel NuPAGE Bis-Tris al 4-12% (ThermoFisher) utilizzando un tampone MOPS e trasferiti su una membrana PVDF utilizzando un sistema di trasferimento iBlot 2 a 25 V per 7 min. Le membrane sono state bloccate con una soluzione di latte al 5% (50 mm Tris HCl, pH6; 150 mm NaCl; 0,1% Tween-20) e gli anticorpi primari sono stati incubati durante la notte a 4 °C in soluzione bloccante. Gli anticorpi erano: anti-IDH1 (, Segnalazione cellulare #8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Segnalazione cellulare #3582, 1:1000). Anti-rabbit / mouse-HRP (rabbit = Cell Signaling 7074; mouse = Cell Signaling # 7076) è stato aggiunto a 1:2500 e incubato per 1 h a temperatura ambiente. Un segnale chemiluminescente è stato generato con la soluzione Supersignal west dura (ThermoFisher) e catturato utilizzando un sistema Biorad Chemidoc. L’analisi densitometrica è stata eseguita utilizzando il software Photoshop (Adobe).

2-HG test

Cellule HEK293T inverso transfected in 24 piatti bene con l’aggiunta di 2.5 × 105 cellule su complessi di trasfezione (0,75 µg di DNA plasmidico, 1,5 µL di Lipofectamina 2000 per pozzetto). Il mezzo di coltura cellulare è stato raccolto dopo 72 ore e 15 µL è stato trasferito su una piastra opaca a 384 pozzetti. 1,5 µL di HCl da 660 mm sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e i campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 10 min. 1,5 µL di base Tris-HCl da 720 mm sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Quindi, 52 µL di soluzione di rilevamento 2-HG (100 mm HEPES (pH 8,0), 100 µM NAD+, 1 µg/mL ricombinante attivo D-2-idrossiglutarato deidrogenasi (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 µM resazurina, 0,03 mg/mL diaforasi (Sigma, Cat: D5540) è stato aggiunto e la piastra è stata incubata a temperatura ambiente. Una curva standard di 2-HG è stata preparata in HEPES da 100 mm (pH 8.0). La fluorescenza è stata misurata su un lettore ViewLux utilizzando filtri Ex: 525, Em: 598/25.

Saggi biochimici

Il saggio biochimico LDHA è stato eseguito come precedentemente descritto29. Brevemente, 3 µL di lattato umano deidrogenasi 5 (2 nM finale) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) nel tampone di dosaggio LDH (200 mm Tris HCl, pH 7,4, 100 µM EDTA e 0,01% Tween-20) è stato aggiunto a una piastra di dosaggio 1536-well fondo solido nero (Greiner Bio-One). In seguito al trasferimento del pin composto (23 nL), è stato erogato 1 µL di soluzione di substrato contenente NADH (0,06 mm finale) e piruvato di sodio (0,2 mm finale) (Sigma-Aldrich) nel tampone di dosaggio LDH per avviare la reazione. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, 1 µL di reagente di rilevamento è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Le piastre sono state immediatamente trasferite a un lettore ViewLux e l’eventuale fluorescenza risultante di resorufina è stata misurata (ex 540 nm, em 590 nm) a 0 e 10 min. La fluorescenza è stata normalizzata utilizzando pozzetti di controllo privi di enzimi e trattati con DMSO su ciascuna piastra.

Il test biochimico ALDH1A1 utilizzando proteine non etichettate è stato eseguito come precedentemente descritto31,37. In breve, 3 µL di ALDH1A1 umano purificato da 20 nM in tampone di dosaggio (100 mm HEPES pH 7.5 con 0.01% Tween 20) sono stati erogati in una piastra nera a fondo solido da 1.536 pozzetti (Greiner Bio One). Ventitré nL di composti o baia di controllo 11-7085 sono stati trasferiti tramite strumento pin (Wako Automation). I campioni sono stati incubati (a temperatura ambiente, protetti dalla luce) per 15 minuti seguiti da un’aggiunta di substrato di 1 µL di NAD + e Propionaldeide (concentrazioni finali di 1 mM e 80 µM, rispettivamente). Le piastre sono state centrifugate e lette in modalità cinetica su un imager ViewLux dotato di eccitazione 340 nm, filtri di emissione 450 nm per 5 min. La variazione dell’intensità della fluorescenza nel corso del min 5 è stata normalizzata utilizzando pozzetti di controllo privi di enzimi e trattati con DMSO su ciascuna piastra.

Il TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase Binding Assay per CDK9/cyclin K è stato acquistato da ThermoFisher ed eseguito secondo le istruzioni del produttore. In breve, 4 µL di una master mix contenente 4 nM CDK9 / Ciclina K (Invitrogen # PV4335), 2 nM Biotina Anti-His Ab, 2 nM Eu-Streptavidina e 10 nM Chinasi Tracer 236 Soluzione in tampone 1X chinasi sono stati erogati in piastre di legame medio bianco Greiner 1.536-well utilizzando una workstation BioRAPTR FRD. Ventitré nL di composto e controlli (DMSO e LY2857785 ad una concentrazione finale di 6 µM) sono stati immediatamente consegnati alle piastre di dosaggio tramite trasferimento utensile pin. Le piastre sono state lasciate incubare per 1 ora a temperatura ambiente e la fluorescenza TR-FRET è stata successivamente misurata con un lettore di piastre multilabel PerkinElmer EnVision (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Tempo di ritardo 100 µs; Tempo di integrazione 200 µs).

Test di produzione di lattato

Le cellule HEK293T sono state coltivate come descritto sopra. Le cellule sono state risciacquate con PBS, tripsinizzate e risospese in DMEM (Life Technologies) privo di fenolo rosso senza integratori. Le celle sono state immediatamente placcate su piastre inferiori trasparenti nere da 1536 pozzetti (Corning) a 250 celle per pozzetto in volume 4 µL. Il controllo del composto o del veicolo è stato aggiunto ai pozzetti tramite il trasferimento dello strumento pin e le cellule sono state incubate a 37 °C per 1 h. Due µL di miscela di reazione al lattato (Biovision K607-100) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e le piastre sono state coperte e incubate a temperatura ambiente per 30 min. La fluorescenza è stata misurata utilizzando un imager microplate ViewLux dotato di filtri Ex/Em 528/598 nm.

Aldefluor dosaggio

Per la determinazione iniziale del 86b-tagged ALDH1A1 attività, le cellule sono state trasfettate mediante una inversione di transfezione procedura di cui 1 mL di complessi (6 µL Lipofectamine 2000 e 3 µg di DNA) è stato combinato con 1 mL di LN18 sospensione cellulare (5 × 105/mL) e 100 µL/pozzetto di mix è stato distribuito in nero, trasparente con fondo in piastre da 96 pozzetti (Corning). Dopo 24 ore, i supporti sono stati rimossi e sostituiti con 100 µL / pozzetto di tampone Aldefluor (STEMCELL Technologies) contenente substrato BAAA e Hoechst 33342 (termofori, concentrazioni finali di 500 nM e 0,5 nM, rispettivamente). Il veicolo DMSO o DEAB (1 µM finale) è stato successivamente aggiunto e le piastre sono state incubate per 30 min a 37 °C per consentire la conversione di BAAA in BAA. Le cellule sono state lavate e 100 µL/pozzetto di tampone Aldefluor è stato erogato prima dell’imaging su un IN Cell 2200 (GE Healthcare). Per i test ad alto rendimento, le cellule LN18 sono state trasfettate in flaconi T75 utilizzando una procedura di trasfezione inversa come descritto sopra per i test HEK293T CETSA ad alto rendimento. Dopo 16 ore, le cellule sono state raccolte e placcate (1.000 cellule/pozzetto/5 µL) in fondo trasparente nero di qualità ottica, le piastre TC trattate da 1.536 pozzetti (micropiastre Aurora) utilizzando un dosatore Multidrop Combi e incubate durante la notte a 37 °C. Il test Aldefluor ad alto contenuto è stato successivamente eseguito su cellule LN18 transfettate o OV-90 non trasfettate come precedentemente descritto31. Le immagini sono state analizzate utilizzando l’algoritmo di analisi multi-Target (GE Healthcare) del software di analisi IN Cell Investigator v1.6.2 come descritto.

Test di integrità termica della membrana

30.000 cellule HEK293T sono state preparate in un tampone CETSA da 30 µL contenente 1X cocktail inibitore della proteasi (ThermoFisher) integrato con 0,5% DMSO (1,5% DMSO totale). Per l’esperimento di tolleranza DMSO, DMSO è stato aggiunto a DPBS a 0, 1, 2 o 3%. Le sospensioni delle celle sono state riscaldate per 3,5 min a 42-74 °C, utilizzando intervalli di 4 gradi, quindi rimosse in un blocco di alluminio su ghiaccio bagnato. Le sospensioni cellulari sono state mescolate con parti uguali di Trypan Blue (LONZA) (=0,2% di trypan blue) e contate immediatamente utilizzando un emocitometro a chip C (iNCyto, Corea). Sono stati contati tripano positivo (permeabilizzato) e negativo (intatto), con n = 2 ad ogni temperatura. Per linee cellulari aggiuntive, un milione di cellule sono state preparate in 100 µL di DMEM libero rosso fenolo contenente 1% DMSO. Le celle sono state riscaldate per 3 minuti da 42 a 90 °C a intervalli di 4 gradi, quindi rimosse in un blocco di alluminio su ghiaccio bagnato. L’integrità della membrana è stata valutata come descritto sopra.

PAMPA

Il metodo PAMPA a doppio lavello brevettato da pION Inc. (Billerica, MA) è stato utilizzato per misurare la permeabilità del composto come descritto in precedenza38. I composti sono stati diluiti in soluzioni di donatore e accettore tamponate a pH7.4 e la concentrazione di DMSO era dello 0,5%. I calcoli di permeabilità sono stati eseguiti utilizzando Pion Inc. software.

Analisi qHTS

I dati di ciascun saggio sono stati normalizzati in base alla piastra ai controlli corrispondenti come descritto in precedenza39. Gli stessi controlli sono stati utilizzati anche per il calcolo del fattore Z’ per ciascun saggio. L’attività percentuale è stata derivata utilizzando il software interno (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Tutte le curve concentrazione–risposta sono state montate e AC50 sono state calcolate con il software GraphPad Prism; le curve sono state classificate come descritte in precedenza27. L’area sotto la curva (AUC) è stata calcolata utilizzando la regola trapezoidale per approssimare l’area tra la curva di risposta e l’asse x nell’intervallo di concentrazione. Gamme di concentrazione equivalenti sono state utilizzate per tutti i composti all’interno di un esperimento. Per classificare i composti attivi è stato utilizzato un cutoff di efficacia pari a 3 σ rispetto alla media (del controllo del veicolo).