Abstract
I saggi di chemiotassi esistenti non generano gradienti chemiotattici stabili e quindi—nel tempo—misurano funzionalmente solo il movimento casuale non specifico (chemocinesi). In confronto, la tecnologia microfluidica ha la capacità di generare un microambiente strettamente controllato che può essere mantenuto stabilmente per lunghi periodi di tempo ed è, quindi, suscettibile di adattamento per l’analisi della chemiotassi. Descriviamo qui un nuovo dispositivo microfluidico per il saggio sensibile della migrazione cellulare e mostriamo la sua applicazione per valutare la chemiotassi delle cellule muscolari lisce in un gradiente di chemochina.
1. Introduzione
La migrazione cellulare diretta svolge un ruolo critico nei disturbi infiammatori, nelle malattie vascolari, nella guarigione delle ferite e nelle metastasi tumorali . Un certo numero di approcci in vitro sono stati sviluppati per quantificare la migrazione cellulare, tra cui la chiusura delle ferite monostrato (“scratch assay”) e la camera di Boyden . Tuttavia, questi metodi attuali sono relativamente insensibili. Inoltre, tali approcci possono effettivamente misurare solo la chemocinesi, cioè un aumento del movimento casuale, piuttosto che la migrazione cellulare diretta dalla chemiotassi.
In effetti, l’utilità del test di scratch e dei transwell della camera di Boyden è limitata dalla loro progettazione metodologica.
Per il test di scratch, una “ferita” definita (scratch) viene eseguita in un monostrato di celle confluenti; le celle ai bordi del difetto riempiono progressivamente il vuoto e viene quantificato il tempo di confluenza ripristinato. La riparazione più rapida del graffio è stata interpretata per riflettere la “chemiotassi” migliorata dovuta alla manipolazione cellulare o alla natura degli agenti solubili aggiunti al mezzo. Mentre l “esperimento è concettualmente semplice e tecnicamente facile da eseguire, le cellule sono bagnate in una concentrazione uniforme di agente, e non v” è alcun gradiente di concentrazione chemoattrattante durante l “intero esperimento; il movimento che riempie il divario rappresenta quindi solo una” passeggiata casuale.”Pertanto, la “migrazione” in un test di scratch è in gran parte una funzione solo di una maggiore chemocinesi. Inoltre, come tipicamente eseguito-specialmente per diverse ore di un dosaggio prolungato-la chiusura di una “ferita” da graffio probabilmente include anche una componente sostanziale della proliferazione cellulare.
L’altro metodo più comune per misurare la “chemiotassi” prevede l’uso di transwells a camera di Boyden. Diverse concentrazioni di chemochine specifiche sono poste nel compartimento inferiore del dispositivo, mentre le cellule da valutare sono incubate nell’inserto superiore; una membrana microporosa separa le due camere e forma un supporto per la crescita cellulare e una barriera parziale per la migrazione. Le cellule che vengono contate sulla faccia inferiore della membrana, o che si accumulano nella camera inferiore, sono tipicamente valutate in un singolo punto finale fisso. Questo saggio ha il vantaggio di un’apparente migrazione diretta, cioè dalla camera superiore a quella inferiore, ma è ancora problematico. In primo luogo, non esiste un “gradiente” di chemochine dall’alto verso il basso, ma piuttosto solo una funzione a passo singolo da basse ad alte concentrazioni. In secondo luogo, non c’è modo di sostenere il differenziale della chemochina dalle camere superiori a quelle inferiori . Inizialmente, la concentrazione di chemochine nel compartimento inferiore è maggiore ma in pochi minuti o ore, le concentrazioni si equalizzano a causa della diffusione, a quel punto la chemiotassi specifica cessa. Invece, le misurazioni a lungo termine riflettono più probabilmente un elemento significativo della chemocinesi. Inoltre, una volta che le cellule cadono attraverso la membrana e nella camera inferiore, non vi è alcuna possibilità di migrazione inversa. Infine, la camera di Boyden è anche limitata perché il conteggio delle cellule richiede la cessazione dell’esperimento; un corso temporale richiede quindi più dispositivi.
La tecnologia microfluidica può superare queste limitazioni generando un gradiente stabile e controllabile a lungo termine di fattori solubili che possono essere monitorati continuamente nel tempo . Utilizzando cellule che sono state trattate per bloccare la proliferazione, tale dispositivo consente una vera valutazione continua della chemiotassi rispetto alla chemocinesi. La figura 1 descrive un tale dispositivo in cui le concentrazioni di sorgente e di sink vengono mantenute creando pozzi corrispondenti i cui volumi sono grandi rispetto al flusso diffusivo attraverso il canale di collegamento dell’idrogel . Allo stato stazionario, si forma un gradiente di concentrazione lineare tra questi due pozzetti. Sebbene il flusso interstiziale attraverso la regione dell’idrogel possa interrompere il gradiente se le pressioni idrostatiche nei due pozzetti non sono uguali, i gradienti di pressione vengono eliminati collegando i pozzi di sorgente e lavello con canali e serbatoi aggiuntivi che fungono da vie di bassa resistenza per il flusso del fluido e l’equilibrio della pressione. I gradienti possono quindi essere mantenuti per diversi giorni e utilizzati per studiare la migrazione cellulare in modo sensibile e specifico con una varietà di tipi di cellule . Il lavoro qui presentato descrive l’uso di tali dispositivi per valutare la chemiotassi per colture primarie di cellule muscolari lisce e per confrontarla con le tecniche di scratch e Boyden chamber per la sensibilità.
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Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) I 3 pozzi inferiori sono pozzi di cella e/o sorgente per chemochine, e i 3 pozzi superiori servono come serbatoi per mantenere pressioni equivalenti nei pozzi inferiori. A seconda del progetto sperimentale, i pozzetti laterali o il pozzo centrale possono servire come pozzi di origine; le cellule in un pozzo centrale possono migrare verso diversi stimoli chemochine su entrambi i lati, o diverse popolazioni cellulari nei pozzetti laterali possono migrare verso uno stimolo chemochine centrale. (b, c) I gradienti di concentrazione sono mostrati schematicamente dopo l’aggiunta di un indicatore di colorante fluorescente a basso peso molecolare al pozzo sorgente e al serbatoio sorgente, a 2 ore (b) o 72 ore (c). d) Visualizzazione grafica dei gradienti di concentrazione da 0 ore a 72 ore dopo l’aggiunta di colorante fluorescente al pozzo sorgente e al serbatoio.
2. Materiali e metodi
2.1. Coltura primaria di cellule muscolari lisce (SMC)
Le Aortas sono state raccolte da topi C57/B6 di 8 settimane (Charles River, Wilmington, MA) con forbici da dissezione sterili. Il grasso aderente è stato rimosso e le aorte sono state incubate per 20 min a 37°C nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) contenente 1% di penicillina/streptomicina, 2% di siero bovino fetale e 5 mg/mL di collagenasi di tipo II (Invitrogen). Le aortas sono state risciacquate in DMEM freddo e l’avventizia è stata accuratamente sezionata; sono state poi tagliate in piccoli pezzi e incubate per 30 min a 37°C in DMEM contenente 1 mg/mL di collagenasi di tipo I (Invitrogen) e 0,125 mg/mL di elastasi di tipo III (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Dopo ripetuti pipettaggi per dissociare il tessuto, la miscela cellulare risultante è stata sospesa in “SMC medium” fresco (DMEM con siero bovino fetale al 10%, 1% penicillina/streptomicina; 2% aminoacidi non essenziali, 1% L-glutammina; tutti i reagenti di Invitrogen) e coltivata a 37°C in un incubatore al 5% di CO2 su piastre rivestite con 1 mg/mL di fibronectina per 30 minuti. Una volta stabilita la coltura cellulare (tipicamente dopo il primo passaggio), gli SMC vengono coltivati su flaconi di plastica non rivestiti (Corning Incorporated, Corning, NY).
SMC sono stati utilizzati dai passaggi 2 a 7 ed erano 99.5% puro come valutato dalla citometria a flusso dopo la colorazione per α-actina della muscolatura liscia. Per la colorazione, le cellule vengono raccolte e fissate con 1% di paraformaldeide (Sigma-Aldrich) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). L’anticorpo α-actina del muscolo antismooth coniugato FITC (Sigma-Aldrich) a diluizione 1 : 100 in tampone 10X BD perm/wash (BD Pharmingen, San Jose, California) è stato applicato per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule vengono lavate due volte con siero bovino fetale 1% in PBS e una volta con siero bovino fetale 1% in PBS contenente formaldeide 1% e immediatamente analizzate mediante citometria a flusso (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-coniugato topo is1 isotype (BD Pharmingen) è usato come controllo isotipo. Le cellule per i saggi chemiotattici sono state raccolte quando avevano raggiunto la confluenza.
2.2. Trattamento con mitomicina-C
Le cellule sono state tripsinizzate (0,25% tripsina-EDTA; Invitrogen) per 2 min a 37°C, lavate con mezzo SMC e quindi incubate come sospensione monocellulare in 40 µg/mL mitomicina-C (MMC; Sigma-Aldrich) in mezzo SMC per 30 min a 37°C. Dopo due lavaggi aggiuntivi in PBS, le cellule sono state valutate per la vitalità, la proliferazione o la capacità migratoria. Per il saggio di guarigione della ferita (scratch), il trattamento MMC è stato eseguito dopo la placcatura SMC e quando le cellule erano confluenti al 100%; le cellule sono state incubate in 40 µg/mL MMC in mezzo SMC per 30 min a 37°C e poi lavate due volte in PBS prima del saggio.
2.3. Test di inibizione della proliferazione di SMC
Dopo il trattamento con MMC o l’incubazione di controllo nel mezzo SMC, gli SMC sono stati coltivati in piastre a 6 pozzetti (Corning Incorporated). Le cellule sono state recuperate dopo 1 h, 24 h o 48 h mediante tripsinizzazione e il numero di cellule e la vitalità sono stati valutati contando utilizzando un emocitometro e l’esclusione del trypan blue.
2.4. Wound Healing / Scratch Assay
SMC sono stati coltivati in piastre a 12 pozzetti (Corning Incorporated) fino alla confluenza e quindi trattati con MMC. Dopo il lavaggio, è stato aggiunto un mezzo SMC fresco e il monostrato cellulare è stato graffiato in modo riproducibile utilizzando una punta di pipetta sterile da 200 µL. Diverse concentrazioni di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF; R & Sistemi D, Minneapolis, MN) in supporti SMC sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. La distanza tra i bordi del difetto di graffio è stata misurata e calcolata in media da cinque punti separati a 3, 6 e 9 h, o fino a quando il difetto della ferita si è chiuso.
2.5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 µL di sospensioni SMC a 1,0–1,5 × 105 celle/mL (1,0–1,5 × 104 celle totali) sono stati caricati negli inserti transwell superiori (Costar, Corning Incorporated) e 600 µL di supporti SMC contenenti diverse concentrazioni di PDGF sono stati collocati nel compartimento inferiore. Dopo 6 ore, 12 ore o 24 ore di incubazione, la membrana transwell è stata macchiata con Hoechst 33342 (Invitrogen) secondo la raccomandazione del produttore e le cellule trasmigrate sulla faccia inferiore sono state contate su un microscopio a fluorescenza utilizzando MetaMorph NX Microscopy Automation and Image Analysis Software (BioCompare, South San Francisco, CA). Nessuna cellula è stata mai identificata nel mezzo nella camera inferiore. Negli esperimenti per valutare se la migrazione cellulare rappresentasse la chemiotassi o la chemocinesi casuale in assenza di un gradiente di concentrazione, il fattore di crescita derivato dalle piastrine-BB (PDGF) è stato aggiunto alla camera inferiore, solo l’inserto superiore o sia l’inserto superiore che la camera inferiore.
2.6. Dosaggio del dispositivo microfluidico
I dispositivi microfluidici(Figure 1(a)-1 (c)) sono preparati come descritto altrove . Come mostrato nella Figura 1 (d), i gradienti dei reagenti aggiunti sono stabili per almeno 72 h. A seconda del protocollo sperimentale, le cellule da valutare sono collocate nel pozzo centrale e diversi gradienti chemiotattici sviluppati dai due pozzi laterali. In alternativa, la migrazione di due diverse popolazioni di cellule può essere valutata dai pozzetti laterali, sperimentando gradienti di concentrazione identici generati dai reagenti posti nel pozzo centrale. Le concentrazioni cellulari erano sempre 4-5 × 105 / mL e 40 µL delle sospensioni cellulari (1,6-2,0 × 103 celle) sono state caricate in pozzetti di prova.
Le cellule sono state incubate nei dispositivi per vari punti temporali e poi colorate con Hoechst 33342 (Invitrogen). La posizione di ogni cella è stata determinata utilizzando la microscopia a fluorescenza (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), e la distanza migrata è stata valutata utilizzando il programma Matlab (MathWorks, Natick, MA). “Migrazione totale” è definita come la somma delle distanze migrate da tutte le celle oltre una posizione iniziale iniziale; questo indice di migrazione viene utilizzato per l’analisi statistica (Figura 2).
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Valutazione della migrazione cellulare in dispositivi microfluidici. Le celle sono state placcate nel pozzo inferiore centrale di un dispositivo microfluidico, con 50 ng / mL PDGF in mezzo SMC posto nel pozzo inferiore sinistro e il solo mezzo SMC posto nel pozzo inferiore destro, seguito da incubazione a 37°C per 48 h. (a, b) Immagine a contrasto di fase della chemiotassi cellulare dal canale centrale in direzione del PDGF 50 ng/mL nel canale sinistro; le immagini sono divise lungo il canale tra il sink e i pozzetti sorgente in modo che l’intera lunghezza del canale possa essere mostrata con un ingrandimento sufficiente a consentire la risoluzione cellulare. (c, d) Immagine di contrasto di fase della chemocinesi delle cellule dal canale centrale nella direzione del medium di SMC soltanto. (e, f) Immagine a fluorescenza a bassa potenza della sinistra (e) o destra; (f) canale a 48 ore dopo la colorazione con Hoechst 33342. (g) Immagine a fluorescenza ad alta potenza del canale sinistro nel pannello (e); il quadrato nero senza celle vicino al lato destro dell’immagine (asterisco) è un post strutturale che segna il punto di partenza per la migrazione. (h) Esempio di analisi della migrazione. Una linea rossa verticale indica il punto di partenza; viene misurata la distanza dal punto di partenza al centro di ciascun nucleo cellulare e la somma di tutte queste misurazioni individuali diventa la distanza totale di migrazione utilizzando Matlab.
Il collagene di tipo I (Invitrogen) viene utilizzato per riempire il canale tra i pozzetti centrali e laterali ed è il substrato attraverso il quale le cellule migrano. È possibile utilizzare sia 1 mg/mL che 2 mg / mL di collagene. Sebbene il collagene da 1 mg / mL determini una chemocinesi cellulare di fondo non specifica leggermente più elevata e il caricamento del gel sia tecnicamente più difficile rispetto al collagene da 2 mg / mL, la concentrazione di collagene inferiore consente una maggiore migrazione delle colture primarie di SMC e la sensibilità del test è migliore. Se non diversamente specificato, la concentrazione di collagene nei canali di migrazione è stata di 1 mg / mL per tutti gli esperimenti.
2.7. Analisi statistica
I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test dello studente o ANOVA a senso unico. Il significato è stato definito a livello.
3. Risultati e discussione
Come mostrato nella Figura 3(a), la proliferazione cellulare è bloccata dal trattamento con MMC. Non vi è alcuna differenza significativa nella vitalità cellulare tra SMC trattato con MMC ( % ) e SMC non trattato ( % ) fino a 48 ore dopo il trattamento. Pertanto, l’accumulo cellulare nei vari saggi di migrazione rappresenta il vero movimento cellulare senza alcun componente della proliferazione cellulare. Questo è importante perché senza il trattamento con MMC, gli indici di migrazione da incubazioni a lungo termine possono essere confusi dalla proliferazione cellulare coincidente.
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la migrazione delle Cellule in scratch e camera di Boyden dosaggi. (a) Mitomicina-C (MMC) inibizione della proliferazione SMC. SMC trattati con o senza MMC (40 µg / mL per 30 min a 37°C) sono stati placcati in piastre a 6 pozzetti e successivamente raccolti. I conteggi delle cellule sono stati eseguiti manualmente su un emocitometro dopo 1 h, 24 h e 48 h; i conteggi delle cellule sono espressi come media ± una deviazione standard dei triplicati. L’esclusione di Trypan blue non ha mostrato differenze nella vitalità cellulare oltre 48 ore (%). Il trattamento con MMC porta a un numero stabile di cellule raccolte a 24 h e 48 h con un aumento significativo della proliferazione nelle popolazioni non trattate con MMC (). (b) Saggio di graffio; non si osservano differenze nell’entità della migrazione tra le cellule coltivate in nessuna chemochina rispetto a 25-100 ng/mL PDGF; nelle 3-6 ore di questo test, non si osservano differenze significative tra le cellule di controllo e quelle trattate con MMC. (c) Analisi Transwell; diverse concentrazioni di PDGF sono state aggiunte alla camera inferiore dei dispositivi transwell al tempo zero; le cellule sull’aspetto inferiore dell’inserto transwell sono state enumerate dopo 6 ore, 12 ore o 24 ore. Rispetto a nessun PDGF nella camera inferiore, c’erano numeri di cellule significativamente maggiori di cellule migrate nel gruppo PDGF 10 ng/mL, 25 ng/mL e 50 ng / mL dopo 12 h (). Dopo 24 ore, i numeri di cellule migrati in transwells con PDGF 5-50 ng / mL non erano significativamente diversi rispetto alle camere senza PDGF. Dopo 24 ore, i numeri di cellule migrati quando 100 ng / mL PDGF era presente nella camera inferiore sono stati significativamente ridotti rispetto al gruppo di controllo 0 ng/mL PDGF. (d) Chemocinesi in transwells; la stessa concentrazione di 50 ng/mL concentrazione di PDGF è stato caricato nella camera inferiore, superiore camera, o sia bottom e top chambers; la migrazione cellulare è stata analizzata dopo 6 h, 12 h o 24 h. Rispetto al no PDGF in camera, la migrazione delle cellule è stata significativamente maggiore con 50 ng/mL nella camera inferiore alle 12 ore (); da 24 ore, non vi era alcuna differenza significativa tra camere e 50 ng/mL di PDGF. In particolare, l’aggiunta di PDGF alla camera superiore, con o senza PDGF nella camera inferiore, ha portato ad un aumento significativo della migrazione a 12 ore rispetto al PDGF nella sola camera inferiore ().
Nei test di scratch (Figura 3(b)) con colture SMC primarie, le cellule migrate casualmente (chemocinesi) per riempire i difetti a tassi comparabili indipendentemente dalla concentrazione di PDGF, anche in assenza di qualsiasi agente chemiotattico. Senza trattamento MMC, i difetti della ferita tendono a chiudersi leggermente prima, suggerendo un elemento di proliferazione cellulare.
La figura 3 (c) mostra i risultati della migrazione per SMC utilizzando il test transwell a camera Boyden. Il punto di tempo iniziale (12 h) mostra una migrazione piccola ma significativamente aumentata in risposta a 10-50 ng/mL PDGF rispetto a nessuna chemochina nel pozzetto inferiore. Tuttavia, non vi era alcuna differenza distinguibile nella migrazione su un intervallo di concentrazione di 10 volte di PDGF, suggerendo che il test è relativamente insensibile, almeno per le colture SMC primarie. Inoltre, entro 24 ore, non ci sono differenze tra nessuna delle concentrazioni di chemochine (incluso il controllo del mezzo) suggerendo che la migrazione in questo momento non è specifica una volta che le concentrazioni di citochine hanno iniziato ad equilibrarsi tra i pozzetti superiore e inferiore.
Per dimostrare formalmente che la migrazione attraverso la membrana nel pozzo superiore non è necessariamente dovuta alla chemiotassi diretta, PDGF è stato aggiunto al pozzo superiore, con o senza PDGF nel compartimento inferiore. Anche in assenza di un gradiente di chemochina, il PDGF nella camera superiore ha portato ad un marcato aumento della trasmigrazione (Figura 3(d)); questo può essere attribuito solo ad un aumento della chemocinesi.
Gli esperimenti di transwell, quindi, suggeriscono che sebbene le differenze iniziali di concentrazione di PDGF possano indurre un certo grado di aumento della migrazione cellulare verso concentrazioni più elevate nei pozzetti inferiori, la successiva diffusione di PDGF porta alla chemocinesi casuale.
In confronto, esperimenti dose-risposta utilizzando i dispositivi microfluidici (Figura 4) dimostrano chemiotassi significativa a concentrazioni fino a 2.5 ng / mL PDGF (Figura 4 (b)), e mostrano un aumento dose-dipendente della chemiotassi con un picco di circa 25-50 ng/mL (Figura 4(a)). È interessante notare che concentrazioni più elevate di PDGF (ad esempio, 100 ng/mL) portano a una minore migrazione, coerente con un arresto di chemiotassi ad alte dosi (18). Da notare che, senza un precedente trattamento con MMC, l’indice di migrazione è maggiore (Figura 4(a)), evidenziando il contributo non obbligatorio della proliferazione alla chemiotassi “apparente” che si verifica con tempi di analisi più lunghi. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or “gold standard” Boyden chamber approaches.
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Microfluidic device assay. a) Curve dose-risposta con e senza precedente trattamento con MMC. Gli SMC trattati con MMC e non trattati sono stati collocati in pozzetti a cellule laterali, con diverse concentrazioni di PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL e 100 ng / mL) presenti nei pozzetti di origine centrale. La migrazione è stata misurata dopo la colorazione Hoechst 33342 e la microscopia a fluorescenza dopo 48 h, utilizzando il programma Matlab per calcolare la migrazione totale. I controlli (solo mezzo SMC) e ogni concentrazione di PDGF sono stati valutati in dispositivi triplicati. Differenze significative possono essere viste da 5 ng/mL a 100 ng / mL PDGF rispetto al controllo (). (b) Chemocinesi contro chemiotassi in dispositivi microfluidici. SMC trattati con MMC con o senza 2,5 ng/mL PDGF sono stati placcati nel pozzetto della cella centrale; 2,5 ng/mL o 50 ng / mL PDGF sono stati aggiunti ai pozzetti sorgente laterali. Senza PDGF presente nel pozzo della cella centrale, il test mostra una migrazione totale significativamente maggiore dopo 48 ore con 50 ng / mL nel pozzo sorgente (“0-50”) rispetto a 2,5 ng/mL nel pozzo sorgente (“0-2, 5”). La presenza di 2,5 ng / mL PDGF nel pozzetto della cellula centrale porta a una migrazione totale significativamente maggiore quando c’è un gradiente di concentrazione (“2,5-50”; ) attribuibile ad un effetto di chemocinesi locale. In assenza di un gradiente (“2.5–2.5”), c’è una migrazione associata alla chemocinesi che è significativamente inferiore alla migrazione osservata quando è presente un gradiente (“0-2.5”; ). (c) Esperimento di tempo di corso eseguito come panel (b).
Non solo il dispositivo microfluidico può essere utilizzato per misurare la chemiotassi, ma può anche distinguere in modo specifico i contributi della chemocinesi e della chemiotassi alla migrazione (Figura 4(b)). Quindi, in assenza di un gradiente di chemochina (ad esempio, 2.5 ng / mL PDGF in entrambi i pozzetti centrali e laterali), l’indice di migrazione riflette la chemocinesi. In confronto, senza PDGF nel pozzo centrale e 2,5 ng / mL nel pozzo laterale, l’indice di migrazione riflette la chemiotassi diretta. Il dispositivo microfluidico può anche valutare la chemiotassi in presenza di chemocinesi esistente, come quando il pozzo centrale contiene 2,5 ng / mL PDGF e il pozzo laterale contiene 50 ng / mL. C’è una migrazione piccola ma statisticamente maggiore quando lo stimolo è un gradiente chemiotattico piuttosto che una semplice chemocinesi.
Poiché il gradiente di chemochina viene stabilito entro 2 ore (17) ed è stabile per diversi giorni, le cellule possono migrare continuamente fino al gradiente di concentrazione nel tempo (Figura 4(c)). In confronto, altri metodi classici non hanno gradiente di concentrazione (scratch assay) o hanno solo un gradiente di chemochine transitorio, in modo che la chemocinesi—piuttosto che la chemiotassi diretta—contribuisca sempre più.
Il dispositivo microfluidico riportato in questo lavoro è superiore sotto diversi aspetti rispetto ad altri approcci in vitro precedentemente utilizzati per studiare la chemiotassi. In particolare, la camera di Boyden-che coinvolge un gradiente di chemochine attraverso una membrana porosa-è stato un test chemiotattico standard dal 1950. Tuttavia, questo dispositivo ha limitazioni significative in quanto i gradienti non sono né stabili né lineari, con un aumento iniziale della concentrazione acuta che si deteriora progressivamente nel tempo. Più recentemente sono state sviluppate tecnologie di sistemi micro-elettromeccanici (MEMS) che utilizzano biochip microfluidici per imitare le condizioni in vivo; in questi dispositivi, le cellule sono continuamente esposte a forze di taglio sotto flusso controllato. Tuttavia, il flusso continuo di questi dispositivi presenta una sfida per il mantenimento di gradienti di chemochine stabili. Sebbene gli idrogel tra la sorgente e il canale di sink possano creare gradienti di concentrazione lineari, sottili variazioni nei pozzetti e nei canali possono generare gradienti di pressione che interrompono i gradienti attraverso il flusso interstiziale ; inoltre, il flusso continuo dei dispositivi tende a diluire qualsiasi chemoattrattante secreto dalle fonti cellulari. Nel nuovo dispositivo microfluidico descritto in precedenza e convalidato per la migrazione delle cellule muscolari lisce in questo articolo, i pozzi di grandi volumi e pozzi di sink mantengono gradienti di chemochine stabili nell’idrogel di collegamento; qualsiasi flusso interstiziale viene eliminato collegando i pozzi di sorgente e sink con canali e serbatoi aggiuntivi che fungono da circuito resistore-condensatore. I gradienti di concentrazione sono quindi stabili e lineari per diversi giorni. Il lavoro attuale ha ulteriormente perfezionato l’applicazione, incorporando il trattamento con mitomicina-C per ridurre qualsiasi contributo confondente della proliferazione e dimostrando come la chemiotassi e la chemocinesi possano essere valutate nello stesso setup sperimentale.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Fondo BWH-BRI per sostenere l’eccellenza della ricerca-Bridge Research Grant. Chen Zhang è stato sostenuto dal China Scholarship Council per 18 mesi. Ovidio C. Amati e Riccardo T. Lee sono stati supportati in parte dal NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
