Il fungo Candida guilliermondii è ampiamente distribuito in natura, incluso il microbiota umano della pelle e delle superfici mucose.22 Sebbene questa specie mostri una virulenza ridotta rispetto ad altre specie di Candida, 3 è attualmente considerata un patogeno emergente, con una maggiore incidenza in America Latina.18 QUATER. guilliermondii è stato riconosciuto come agente eziologico di un’ampia varietà di infezioni cliniche, comprese quelle disseminate principalmente in pazienti immunocompromessi,22 e focolai nosocomiali in pazienti chirurgici con dispositivi intravascolari.13 Attualmente, il trattamento raccomandato per la candidosi invasiva nei pazienti neutropenici include caspofungin (CFG) o micafungin (MFG) come terapie di prima linea, l’amfotericina liposomiale B (LAMB) e l’anidulafungina (AFG) sono alternative, mentre il fluconazolo (FLC) è raccomandato solo quando la suscettibilità a questo farmaco è confermata.23 Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che C. guilliermondii ha una ridotta suscettibilità a FLC8,15,19 e sono stati riportati fallimenti terapeutici associati a isolati con alte concentrazioni inibitorie minime di amfotericina B (AMB).9,12,24 Anche se quasi il 90% degli isolati mostra echinocandine MICs uguale o inferiore a breakpoint clinici (CBP) di suscettibilità (2µg/ml),17 simile ad altre specie di Candida, come C. parapsilosis, alcuni isolati di C. guilliermondii mostrano MICs considerevolmente alto.8,15 I dati disponibili riguardanti l ‘efficacia dell’ AFG nella candidosi invasiva sono limitati e il ruolo potenziale di tale farmaco nella pratica clinica è poco noto.23 In questo contesto, gli studi sugli animali possono svolgere un ruolo importante per una migliore comprensione della correlazione in vitro–in vivo.11 Pertanto, il nostro obiettivo principale era quello di valutare le attività in vitro e in vivo di AFG contro diversi isolati di C. guilliermondii, confrontando i risultati con quelli di AMB e FLC.
Materiali e metodiisolati fungini
Quattro isolati clinici di C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 e UTHSC 10-3207) sono stati utilizzati nello studio in vitro e due di essi (UTHSC 11-685 e UTHSC 11-142) sono stati selezionati per il modello murino sulla base delle loro diverse sensibilità in vitro. Gli isolati sono stati identificati sequenziando la regione interna dello spaziatore trascritto (ITS) e i domini D1–D2 dell’rRNA, confrontando le sequenze con quelle del ceppo tipo di questa specie.
Studi in vitro
La suscettibilità in vitro dei quattro ceppi ad AMB, FLC e AFG è stata valutata utilizzando un metodo di microdiluizione del brodo di riferimento,inclusi come controlli di qualità 6Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida krusei ATCC 6258.
Le curve time-kill sono state sviluppate per tutti i ceppi secondo studi precedenti.5,20 In breve, è stata preparata una soluzione madre di ciascun antimicotico, AMB (Sigma–Aldrich Co. L’azienda si occupa di:, Madrid, Spagna) sono stati sciolti in dimetilsolfossido e FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spagna) in acqua distillata. Inoltre, le diluizioni del farmaco sono state preparate in 9 ml di mezzo standard RPMI 1640 per ottenere concentrazioni di 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 e 32µg / ml di ogni farmaco. Gli isolati sono stati sottoculturati a 35°C per 24 ore su piastre di agar di destrosio di patate (PDA). Le colture di C. guilliermondii sono state sospese in soluzione salina sterile e le sospensioni risultanti sono state regolate a 5×106 unità formanti colonie (CFU) / ml mediante conteggi emocitometrici e mediante placcatura seriale su PDA per confermare la vitalità. Diluizioni e controlli (senza farmaci) sono stati inoculati con 1 ml di sospensioni fungine, con conseguente inoculo iniziale di 5×105CFU / ml e incubato a 35°C. Un’aliquota di 100µl da ogni provetta è stata raccolta a 0, 2, 4, 6, 8, 24, e 48h dopo l’inoculazione e diluito in acqua distillata; 30 µl di essi sono stati coltivati su piastre PDA e incubati a 35°C per 48h per la determinazione CFU/ml. Una diminuzione di CFU ≥99,9% o 3 unità log10 rispetto all’inoculo iniziale è stata considerata fungicida, mentre una riduzione di
unità log10 è stata considerata fungistatica. Il limite di rilevamento era 50CFU / ml. Tutti gli studi sulla curva di uccisione del tempo sono stati eseguiti in duplicate.In nell’esperimento sono stati utilizzati studi vivo
Topi maschi DI-1 (Charles River; Criffa SA, Barcellona, Spagna) con un peso medio di 30g. I topi erano alloggiati in scatole standard con libero accesso al cibo e all’acqua. Tutte le procedure animali sono state supervisionate e approvate dal Comitato Etico e benessere degli animali dell’Universitat Rovira i Virgili.
I topi sono stati neutropenici un giorno prima dell’infezione mediante un’iniezione intraperitoneale (ip) di 200 mg/kg di ciclofosfamide (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcellona, Spagna) più una endovenosa (iv.) iniezione di 5-fluorouracile (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcellona, Spagna) a 150 mg/kg.10,14 Il giorno dell’infezione, i topi sono stati sfidati per via endovenosa con 1×108CFU/animale di ciascuno dei due ceppi di C. guilliermondii, UTHSC 11-685 e UTHSC 11-142, in 0,2 ml di soluzione salina sterile nella vena laterale della coda.3,4
Gruppi di otto animali sono stati stabiliti casualmente per ciascun ceppo e farmaco. I gruppi sono stati trattati come segue: amfotericina B desossicolato (AMBd) (Farmacia Xalabarder, Barcellona, Spagna) a dosi di 0,8 mg/kg i.v. una volta al giorno( QD); amfotericina B liposomiale (LAMB) (Gilead Sciences S.A., Madrid, Spagna) a 10 mg/kg i.v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spagna) a 25 mg/kg per via orale (p.o.) mediante sonda gastrica, due volte al giorno (BID); e AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Regno Unito) a 10 mg/kg di peso corporeo/dose i. p., QD. Tutti i trattamenti sono iniziati 24 ore dopo la sfida e sono durati 7 giorni. I controlli non hanno ricevuto alcun trattamento. Per prevenire le infezioni batteriche, tutti i topi hanno ricevuto 5 mg/kg al giorno di ceftazidima per via sottocutanea dai giorni 1 a 7 dopo l’infezione. I topi sono stati controllati quotidianamente e sono stati sottoposti a eutanasia il giorno 8 post-infezione da CO2 anossia. L’efficacia di ciascun farmaco è stata valutata mediante riduzione del carico tissutale e studi istopatologici. I reni sono stati rimossi in modo asettico e uno di essi è stato pesato e omogeneizzato in 2 ml di soluzione salina sterile. Le diluizioni seriali di 10 volte degli omogenati sono state placcate su PDA e incubate per 48h a 35°C per il calcolo CFU / g. Per lo studio istopatologico il rene rimanente è stato fissato con formalina tamponata al 10%, disidratata, paraffina incorporata e tagliata in sezioni da 2µm, che sono state colorate con ematossilina–eosina (H-E) e macchia periodica acido-Schiff (PAS) per l’esame al microscopio ottico.
Statistiche
I conteggi di colonie da tessuti sono stati analizzati utilizzando il Mann–Whitney U-test, utilizzando Graph Pad Prism 4.0 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Quando i valori di P erano inferiori a 0,05, le differenze sono state considerate statisticamente significative.
Risultatigli studi in vitro
MIC di AMB sono stati 0,25–1µg/ml, 0,06–0,25 µg/ml per AFG e 0,5–1µg/ml per FLC. A seguito dei cut-off di suscettibilità per AMB, FLC e AFG contro C. guilliermondii, 16 tutti gli isolati erano suscettibili ai tre farmaci. La suscettibilità dei ceppi di controllo della qualità era compresa negli intervalli accettati.6
La cinetica di uccisione di AMB ha mostrato un’attività fungicida veloce che aumentava con la concentrazione del farmaco. A concentrazioni equivalenti al MIC, quel farmaco ha mostrato un effetto fungicida contro tre dei quattro isolati testati (Fig. 1). Questa attività è iniziata immediatamente dopo l’inoculazione a concentrazioni superiori a 1µg/ml, l’endpoint fungicida è stato raggiunto dopo 4h a 32µg/ml. AFG a concentrazioni superiori a 0,5 µg / ml ha mostrato attività fungicida a partire dopo 4 ore di incubazione. L’endpoint fungicida è stato raggiunto a 12-24h di incubazione a 32µg / ml (Fig. 2). FLC ha mostrato attività fungistatica contro tutti e quattro gli isolati (Fig. 3).
Analisi cinetiche che uccidono il tempo di AMB contro quattro ceppi di C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ○ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controllo. Le linee tratteggiate rappresentano una diminuzione CFU di 3log10 unità di crescita rispetto all’inoculo iniziale (attività fungicida), le linee tratteggiate indicano il limite di quantificazione del test.
Analisi cinetiche che uccidono il tempo di AFG contro quattro ceppi di C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ○ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controllo. Le linee tratteggiate rappresentano una diminuzione di CFU di 3 log10 unità di crescita rispetto all’inoculo iniziale (attività fungicida), le linee tratteggiate indicano il limite di quantificazione del test.
Analisi cinetiche che uccidono il tempo di FLC contro quattro ceppi di C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ● ) 1µg/ml, (Δ)2µg/ml, (▿) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controllo. Le linee tratteggiate rappresentano una diminuzione CFU di 3log10 unità di crescita rispetto all’inoculo iniziale (attività fungicida), le linee tratteggiate indicano il limite di quantificazione del test.
studi In vivo
AGNELLO a 10 mg/kg è stato l’unico farmaco in grado di ridurre l’fungine carico di reni dei topi infettati con ciascuno dei due ceppi, essendo la riduzione significativamente maggiore rispetto a quello di altre terapie (P≤0.04). AMBd e FLC sono stati in grado di ridurre il carico tissutale solo nei topi infetti dal ceppo che mostrava i MICROFONI più bassi per questi due farmaci, cioè 0,25 µg/ml per AMB e 0,5 µg/ml per FLC (P≤0,008). Nel caso di AFG la riduzione del carico fungino è stata modesta e inferiore a quella per AMBd e ha ridotto significativamente il carico tissutale nel rene solo rispetto al gruppo di controllo per il ceppo UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 e FLC 50; cP0. 05 contro AFG 10 e FLC 50.
Lo studio istologico ha mostrato infiltrazione focale di cellule fungine nei reni di animali non trattati e nei topi trattati con AMBd, FLC o AFG. I reni di topi trattati con AGNELLO hanno mostrato solo una lieve invasione fungina. Segni di necrosi, risposta infiammatoria o alterazioni del parenchima non sono stati osservati né nei controlli né negli animali trattati (Fig. 5).
Presenza di infiltrazione fungina (freccia nera) nella sezione renale di un topo di controllo infetto da C. guilliermondii, a 8 giorni dall’infezione (colorazione periodica di Schiff acido, ingrandimento 1000×). Barra=10µm.
Discussione
Gli studi in vitro non hanno rivelato una ridotta suscettibilità degli isolati di C. guilliermondii a FLC o AFG. In accordo con studi precedenti, le curve time-kill di AMB hanno mostrato un’attività fungicida concentrazione-dipendente contro tutti gli isolati, 4, 5, 7 e FLC hanno mostrato un effetto fungistatico indipendentemente dalla concentrazione testata.7 E ‘ noto che AMBd presenta una maggiore efficacia rispetto alla sua formulazione lipidica, soprattutto nel rene, quando somministrato sia alle stesse dosi.1 Tuttavia, studi di farmacocinetica hanno mostrato che dopo la somministrazione di 0,75 mg/kg di AMBd la Cmax di AMB raggiunta nel siero di topi era di 0,30 µg / ml.25 Tuttavia, l’AMB MIC di uno dei due isolati testati è superiore a questo valore; pertanto, abbiamo usato una dose elevata di AGNELLO per raggiungere concentrazioni più elevate.1 In effetti, la somministrazione di AGNELLO a 10 mg/kg è stata efficace nel ridurre il carico fungino di entrambi i ceppi. Questo fatto è correlato con le curve di uccisione, in cui AMB ha raggiunto la sua attività fungicida contro i due isolati testati in vivo, a concentrazioni di 1µg/ml. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che ha cercato di stabilire una relazione tra la cinetica di uccisione e l’efficacia sperimentale in vivo di AFG e FLC contro isolati clinici di C. guilliermondii. Esiste solo uno studio precedente sulle echinocandine, in particolare su caspofungin (CFG) nell’infezione disseminata da C. guilliermondii. CFG a 1mg / kg è stato efficace nel ridurre il carico fungino renale nei topi infettati con un ceppo di C. guilliermondii con un MIC di 8µg / ml, mentre l’uccisione del tempo ha rivelato che nessuna attività fungicida è stata raggiunta a concentrazioni di 64µg/ml.4 Al contrario, il nostro studio ha mostrato un’attività dipendente dalla concentrazione di AFG, che a 32µg/ml ha esercitato un’attività fungicida, come riportato in precedenza,17 a 24h e a 8µg/ml. Studi precedenti hanno riportato concentrazioni di AFG nel siero e nel rene di circa 13µg / ml dopo 7 giorni di trattamento a dosi di 10 mg / kg.21 Qui, AFG è stato in grado di ridurre solo modestamente il carico fungino nei reni di topi neutropenici infetti da uno dei due ceppi testati, che non sembra essere correlato alla bassa differenza di AFG MICs tra i due ceppi testati (diluizione 1), suggerendo che la risposta al trattamento AFG è dipendente dal ceppo. Allo stesso modo,FLC è stato anche solo in grado di ridurre leggermente il carico fungino nel rene di topi sfidati con uno dei due ceppi nonostante la dose somministrata che raggiunge concentrazioni sieriche al di sopra dei MIC, 2 che non è stato sorprendente a causa della sua attività fungistatica.
In conclusione, il nostro studio ha mostrato la maggiore attività e l’efficacia di LAMB contro i due ceppi di C. guilliermondii, in contrasto con lo scarso effetto di FLC e AFG. Tuttavia, ulteriori studi con più isolati di C. guilliermondii che rappresentano una gamma più ampia di MIC AFG dovrebbero essere effettuati per valutare se esiste una relazione tra i valori MIC e l’efficacia AFG.
Conflitto di interessi
Nessuno da dichiarare.
