TESTO

Il trattamento per Staphylococcus aureus meticillina-resistente (MRSA) è stato complicato aumentando i tassi di resistenza agli antibiotici. I ceppi di MRSA esprimono la proteina legante la penicillina 2a (PBP2a), codificata da mecA, che fornisce resistenza ai β-lattami proteggendo la serina reattiva in una fessura stretta e inaccessibile, consentendo alla sintesi della parete cellulare di continuare in presenza di antibiotico (1, 2). Ceftobiprolo e ceftarolina sono cefalosporine anti-MRSA che inibiscono PBP2a a concentrazioni terapeuticamente utili. Il gruppo R2 di ceftobiprolo si estende nella fessura stretta di PBP2a per accedere al sito attivo, mentre il legame con ceftarolina causa un cambiamento allosterico in PBP2a, rivelando il sito attivo per il legame con una seconda molecola (3, 4). Ceftobiprolo è stato valutato in studi clinici, e ceftarolina è approvato dalla FDA per il trattamento della pelle e la struttura della pelle infezioni, comprese quelle causate da MRSA (5-10).

Studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che il passaggio del ceppo COL in ceftobiprolo seleziona per mutanti resistenti con mutazioni in PBP2a (11). Questo studio esamina se il passaggio di ceftarolina seleziona anche mutazioni simili. Gli esperimenti di passaggio sono stati condotti con due diversi background MRSA: COL, un arcaico isolato omogeneamente resistente del 1961, e SF8300, un ceppo MRSA USA300 contemporaneo eterogeneo. COLnex e SF8300ex, ceppi derivati mecA-negativi di COLn e SF8300, sono stati ottenuti mediante (12) asportazione cromosomica della cassetta stafilococcica cromosomica mec (SCCmec) (13). mecA wild-type è stato reintrodotto su plasmide pYK20 (derivato dal plasmide pAW8 e contenente mecA wild-type clonato da COL) in COLnex e SF8300ex per studi di passaggio. Se mecA stava mediando la resistenza, quindi curare un mutante resistente del plasmide o introdurlo in uno sfondo suscettibile dovrebbe comportare la perdita o il guadagno del fenotipo, rispettivamente, consentendo la determinazione del contributo di mecA alla resistenza. I ceppi e i plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nelle tabelle 1 e 2. COLnex(pYK20) e SF8300ex (pYK20) sono stati passati in serie in brodo di soia triptico contenente concentrazioni crescenti di ceftarolina (Laboratori forestali) come precedentemente descritto (11).

Dopo 28 giorni, COLnex(pYK20) e SF8300ex(pYK20) attraversate in ceftaroline ceduto due mutanti, COLnexpT(pYK20COLT*) e SF8300expT(pYK208300T*) (l’asterisco indica un plasmide generati durante ceftobiprole o ceftaroline selezione in un COL o SF8300 sfondo) (Tabella 1). MICs a ceftarolina, ceftobiprolo e altri β-lattami (Sigma-Aldrich) sono stati determinati con il metodo di diluizione del brodo secondo gli standard CLSI (Tabella 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) ha espresso una resistenza di alto livello sia a ceftarolina che a ceftobiprolo, con MICROFONI di 64 µg/ml e 32 µg/ml, rispettivamente. SF8300expT (pYK208300T*) ha espresso una resistenza di basso livello per il giorno di passaggio 4, con un MIC di 4 µg / ml, che è rimasto invariato nonostante altri 24 passaggi (Tabella 3 e Fig. 1). Il mutante ceftobiprolo-passato precedentemente descritto di COLnex (pYK20) (11), Colnexb (pYK20COLB*), ha mostrato una resistenza di alto livello sia a ceftobiprolo che a ceftarolina, con una MIC di 64 µg/ml per ciascuno.

Plasmid mecA è stato sequenziato per mutazioni in ceppi passati. Poiché i PBP sono l’obiettivo dei β-lattami, anche pbp1, -2, -3 e -4 sono stati sequenziati. Infine, gdpP e acrB sono stati sequenziati, poiché mutazioni in questi geni erano state identificate in un mutante resistente al ceftobiprolo mecA-negativo di COL (16). Plasmid pYK208300T* (pYK20 da SF8300ex passato in ceftarolina), ha avuto una mutazione a punto singolo (da G a A nella posizione di sequenza codificante 1339) in mecA, con conseguente cambiamento aminoacidico nonsynonymous, E447K. Nessuna mutazione era presente in altri geni PBP, acrB o gdpP (Tabella 4).

Plasmide pYK20COLT* (pYK20 da COLnex attraversate in ceftaroline) non aveva mutazioni in mecA. Sono state trovate una mutazione puntiforme (da C a T in posizione CDS 1327) che introduce la mutazione H443Y in GdpP, una mutazione puntiforme (da G a A in posizione CDS 466) che introduce la mutazione D156N in PBP2 e due mutazioni puntiformi (da A a G in posizione CDS 601 e da C a G in posizione CDS 723) che introduce le mutazioni T201A e F241L in PBP4 (Tabella 4). Da notare, il passaggio di ceftarolina di COL contenente mecA nella sua posizione cromosomica naturale ha portato anche a un mutante con resistenza di alto livello ma privo di mutazioni in mecA (dati non mostrati). L’analisi della sequenza di quel mutante passato ha rivelato una mutazione puntiforme in pbp2 (da G a A in posizione CDS 1891), con conseguente cambiamento dell’amminoacido G631S e uno in pbp4 (da T a A in posizione CDS 414), introducendo una mutazione N138K. Questi dati indicano che, anche in presenza di mecA, la ceftarolina può selezionare mutazioni in altri geni, con conseguente resistenza.

Curare COLnexpB(pYK20COLB*) e SF8300expT(pYK208300T*) dei loro plasmidi, ognuno dei quali presentava mutazioni mecA, ha ridotto i MIC per tutti i β-lattamici testati (Tabelle 5 e 6). La cura di COLnexpT (pYK20COLT*) del suo plasmide, che mancava di mutazioni mecA, non ha avuto alcun effetto sui MIC (Tabella 5). La trasformazione di pYK20COLB*, che contiene 6 mutazioni di sostituzione nella mecA, nel genitore colnex suscettibile, producendo il COLNEX trasformante (pYK20COLB*), ha determinato una resistenza di alto livello a ceftarolina e ceftobiprolo. La trasformazione di pYK208300T*, che contiene la singola mutazione E447K in mecA, in COLnex, producendo il colnex trasformante (pYK208300T*), ha determinato una resistenza di alto livello a ceftobiprolo (MIC di 64 µg/ml) ma solo una resistenza di basso livello a ceftarolina (MIC di 4 µg/ml) (Tabella 5). La trasformazione di pYK20COLB * in SF8300ex, producendo il trasformante SF8300ex (pYK20COLB*), ha comportato una resistenza di alto livello a ceftarolina e ceftobiprolo (MIC di 32 µg/ml a ciascuno) (Tabella 6). Diversi tentativi di trasformare SF8300ex con pYK208300T * non hanno avuto successo.