CPZ attenua la colite indipendentemente TRPV1
Per sfidare il meccanismo mediante il quale CPZ clisteri attenuare colite sperimentale, abbiamo indotto destrano solfato di sodio (DSS) colite in wild-type (WT) e TRPV1-deficient mice (ogni gruppo di n = 8). Sebbene esistano rapporti contrastanti, i topi con carenza di TRPV1 hanno sviluppato colite DSS e perdita di peso allo stesso livello dei topi congenici WT nel nostro laboratorio, che è conforme ai nostri risultati dal modello di colite TNBS che avevamo precedentemente pubblicato7,8,9,10,11,12. Per i trattamenti clisteri CPZ, abbiamo usato la stessa concentrazione di CPZ (531 µM) che è stata precedentemente segnalata per attenuare la colite DSS (5%) nei rats8. Il decorso della colite è stato monitorato quotidianamente mediante misurazioni del peso corporeo ed endoscopia. Le applicazioni due volte al giorno di clisteri CPZ (531 µM) hanno attenuato la colite DSS allo stesso grado sia nei topi WT che TRPV1−/−, che è stata riflessa da un punteggio endoscopico migliorato e da una riduzione della perdita di peso corporeo (Fig. 1 BIS-C). H&E macchie dal colon distale alla fine dell’esperimento DSS di 7 giorni hanno rivelato l’architettura del tessuto mucoso distrutto con numerose cellule immunitarie infiltranti nei due punti dei controlli. Ciò era in netto contrasto con una mucosa ampiamente intatta e l’assenza di una significativa infiltrazione delle cellule immunitarie nei due punti dei topi trattati con CPZ di entrambi i genotipi (Fig. 1D). In accordo con questi risultati, il punteggio istologico è stato fortemente ridotto nei topi trattati con CPZ di entrambi i genotipi (Fig. 1E).
CPZ attiva TRPA1
L’osservazione in vivo che i clisteri CPZ inibivano efficacemente la colite nei topi mutanti nulli TRPV1 imponeva la domanda sugli effetti neuronali indipendenti dalla TRPV1 della CPZ. Dal momento che TRPA1 aveva dimostrato di essere cruciale in vari modelli di infiammazione tra cui colitis6, 12, 14, abbiamo testato se CPZ agisce su TRPA1.
Correnti ioniche indotte da CPZ attraverso htrpa1
Gli esperimenti di patch clamp sono stati condotti in modalità tension clamp su celle HEK293t che esprimevano HTRPA1 ricombinante (celle hTRPA1-HEK293t). A un potenziale di tenuta di -60 mV, CPZ (10 µM) ha indotto una corrente verso l’interno che è stata quasi completamente inibita (inibizione del 93%, n = 5) dall’antagonista selettivo TRPA1 HC-030031 (HC, 10 µM) (Fig. 2 BIS). In tutte le cellule in cui è stata registrata una corrente interna indotta da CPZ, carvacrol (100 µM) un agonista TRPA1 stabilito, ha anche evocato grandi correnti interne allo stesso potenziale di tenuta, dimostrando l’espressione funzionale di hTRPA1. Queste celle hTRPA1-HEK293 sono state anche sottoposte a rampe di tensione da -100 a +100 mV di durata 400 ms ogni 4 s (Fig. 2 TER). La relazione corrente-tensione indotta da CPZ ha mostrato una rettifica leggermente verso l’esterno e un potenziale di inversione vicino a 0 mV (Fig. 2 QUATER). Le correnti evocate da CPZ (10 µM) sono state inibite da HC (10 µM). L’effetto è stato più pronunciato a potenziali negativi (89% ± 5% di inibizione a -80 mV, media ± SD, n = 7) che a potenziali positivi (80% ± 9% di inibizione a +80 mV).
La capsazepina (CPZ) attiva il TRPA1 umano espresso eterologicamente.
(A) CPZ (10 µM) evoca correnti mediate da hTRPA1 in cellule HEK293t trasfette. Si noti la completa inibizione delle correnti da parte dell’antagonista selettivo TRPA1 HC030031 (HC, 10 µM). (B) Correnti rappresentative rampa evocati in una cella HEK293 HTRPA1-transfected da 400 ms rampe di tensione da -100 a +100 MV applicata ogni 4 s. Ogni simbolo rappresenta l’ampiezza corrente a -80 mv (quadrati) e +80 MV (cerchi). La corrente indotta da CPZ è stata fortemente inibita da HC. (C) Esempi di singole correnti di rampa corrispondenti ai simboli e ai numeri riempiti in B. (D) CPZ (50 µM, 10 s) evoca grandi transienti di calcio nelle cellule hTRPA1-HEK293 (traccia nera, n = 128). HC (20 µM; traccia rossa, n = 209) e A-967079 (10 µM; traccia blu, n = 140) hanno completamente inibito la risposta a CPZ. I dati rappresentano mezzi (linee rette) ± SEMs (linee tratteggiate). E) L’attivazione di hTRPA1 da parte di CPZ (10 µM) dipende dalla concentrazione. Traccia nera: le cellule hTRPA1-HEK293 (n = 52) sono state stimolate aumentando le concentrazioni di CPZ per 20 s a intervalli di 3 min. Traccia grigia: le cellule HEK293 non trasformate (n = 101) sono state sottoposte alle stesse concentrazioni di CPZ. (F) L’attivazione di hTRPA1 da CPZ (1 µM) coinvolge tre cisteine critiche nel N-terminale del canale. Traccia nera: risposta di n = 123 cellule HEK293 che esprimono WT hTRPA1 alle successive applicazioni di CPZ (1 µM), carvacrolo (100 µM) e isotiocianato di allile (AITC, 50 µM). Traccia grigia: risposta di n = 165 cellule HEK293 che esprimono il mutante hTRPA1-3C alla stessa sequenza di stimoli. Si noti la sostanziale riduzione della risposta del mutante hTRPA1-3C a CPZ e AITC, ma non al carvacrolo. G) La differenza di sensibilità CPZ tra i genotipi è stata abolita a 100 µM CPZ. (H) L’attivazione di hTRPA1 da CPZ può essere impedita dallo scavenger N-acetil cisteina (NAC). Traccia nera: negli esperimenti di controllo le cellule hTRPA1-HEK293 sono state sfidate con CPZ (50 µM; 60 s; n = 74). Traccia rossa: in un esperimento separato le cellule sono state esposte per la prima volta per 30 s a una combinazione di CPZ (50 µM) e NAC (15 mM), immediatamente seguite da CPZ da solo per altri 30 s (n = 83).
L’afflusso di calcio indotto da CPZ attraverso hTRPA1
L’azione selettiva di CPZ su TRPA1 è stata confermata impiegando la tecnica della microfluorimetria del calcio. Le cellule hTRPA1-HEK293 sono state stimolate da due applicazioni di CPZ (50 µM) per 10 s a intervalli di 5 minuti (Fig. 2D). Gli antagonisti selettivi HC (20 µM) e A-967079 (10 µM) sono stati applicati per 1 min prima e durante la prima sfida CPZ. La risposta CPZ è stata completamente abolita da entrambi gli antagonisti. Vale la pena notare che la rimozione di HC ha portato ad un afflusso di calcio, probabilmente a causa dell’azione residua di CPZ, mentre questo effetto off era assente nel caso di A-967079 che potrebbe staccarsi più lentamente (Fig. 2D). Abbiamo quindi analizzato la concentrazione-dipendenza degli effetti CPZ. Concentrazioni crescenti di CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM e 50 µM) sono state applicate alle cellule hTRPA1-HEK293 per 20 s ciascuna a intervalli di 3 minuti. A partire da 100 nM, tutte le concentrazioni di CPZ evocavano transienti di calcio con ampiezze sempre più grandi (Fig. 2E). Carvacrol (100 µM) è stato applicato alla fine dell’esperimento per controllare l’espressione funzionale di TRPA1, ma la risposta di carvacrol dopo 50 µM CPZ era vistosamente piccola, suggerendo la desensibilizzazione incrociata. Le cellule HEK293 non trasformate sono state sottoposte alle stesse applicazioni CPZ e solo la concentrazione più alta testata (50 µM) ha indotto un aumento minimo del calcio. Ci aspettavamo che CPZ impegnasse i tre residui critici di cisteina nel dominio N-terminale del canale perché è un composto elettrofilo. Le cellule HEK293 che esprimono WT hTRPA1 e le cellule che esprimono la tripla cisteina mutante hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) sono state sottoposte all’applicazione CPZ (1 µM, 20 s) seguita dall’agonista non elettrofilo carvacrolo (100 µM, 20 s) e dall’AITC altamente elettrofilo (50 µM, 30 s). La ionomicina è stata applicata alla fine dell’esperimento come controllo positivo. L’ampiezza del transitorio di calcio evocato da 1 µM CPZ è stata sostanzialmente ridotta (>80%) nelle cellule che esprimono hTRPA1-3C rispetto alle cellule che esprimono WT hTRPA1 (Fig. 2F), mentre la differenza di sensibilità CPZ tra i genotipi è stata abolita a 100 µM di concentrazione CPZ (Fig. 2G). La risposta AITC è diminuita nelle cellule mutanti, mentre carvacrol ha evocato grandi transitori di ioni calcio sia nei mutanti WT che 3C. Nel loro insieme, queste risposte cellulari indicano che la potenza relativamente elevata di CPZ dipende dalle tre cisteine critiche. Tuttavia, quando la concentrazione di CPZ è 100 volte superiore, altri siti di legame assumono l’attivazione di hTRPA1. Questa alta concentrazione del CPZ lipofilo potrebbe anche interagire con la membrana lipidica cellulare, attivando indirettamente TRPA1, come precedentemente dimostrato per il componente lipidico A dei lipopolisaccaridi16. Inoltre, in presenza dello scavenger elettrofilo N-acetil cisteina (NAC) ad una concentrazione di saturazione (15 mm) 50 µM CPZ non è stato in grado di suscitare alcuna risposta. Dopo la rimozione di NAC, CPZ ha evocato grandi transitori di calcio nelle cellule HEK293t HTRPA1-transfected (Fig. 2H) che conferma che CPZ agisce come un agonista elettrofilo per hTRPA1.
CPZ attiva una sottopopolazione di neuroni del ganglio della radice dorsale sensibili AITC (DRG)
I neuroni DRG sono stati mantenuti in coltura primaria e studiati mediante microfluorimetria del calcio. Le cellule sono state stimolate da CPZ (50 µM, 20 s), seguite da AITC (100 µM, 30 s), capsaicina (CAP, 1 µM, 10 s) e KCl (60 mM, 30 s). La figura 3A illustra esempi di neuroni DRG che rispondono a tutti questi quattro stimoli. Una frazione tipica dei neuroni DRG è stata attivata da AITC (301 dei neuroni 906, 33%, n = 8 topi) indicando l’espressione funzionale di TRPA1. Una sottopopolazione di questi neuroni sensibili all’AITC è stata attivata anche da CPZ (185 dei neuroni 301, 61%). La sensibilità al CPZ era quasi completamente limitata ai neuroni sensibili all’AITC. Di complessivamente 200 neuroni sensibili al CPZ, 185 (93%) sono stati attivati anche da AITC, indicando una forte concordanza di sensibilità a CPZ e AITC (Fig. 3). Come nel caso delle cellule HEK293 che esprimono hTRPA1, i transitori di calcio evocati da CPZ nei neuroni DRG erano dipendenti dalla concentrazione con un valore EC50 stimato a 30 µM CPZ e la piccola risposta AITC dopo 100 µM CPZ suggeriva nuovamente la desensibilizzazione incrociata (Fig. 3 TER, lettera C). La figura 3D mostra la sovrapposizione di CPZ, CAP e AITC-reattività nei neuroni DRG WT a determinate concentrazioni: il 14% dei neuroni DRG ha risposto a AITC ma non a CAP (125/906), il 16% ha risposto a CAP ma non a AITC, mentre CPZ ha indotto transienti di calcio nel 78% dei neuroni che hanno risposto sia AITC che CAP (137 su 176). Per dimostrare la specificità degli effetti osservati, i neuroni TRPV1−/− e TRPA1−/− DRG sono stati esposti al protocollo di cui sopra. Circa il 90% dei neuroni DRG carenti di TRPV1 che erano sensibili AITC ha risposto anche a CPZ (509/572 cellule), mentre nessuno dei 448 neuroni DRG carenti di TRPA1 testati ha mostrato l’afflusso di calcio in risposta a CPZ (100 µM) come illustrato da esempi rappresentativi in Fig. 3E, F.
La capsazepina (CPZ) attiva la TRPA1 murina nei neuroni gangliari della radice dorsale.
(A) CPZ (50 µM) attiva una sottopopolazione di neuroni AITC (100 µM) sensibili al ganglio della radice dorsale del topo (DRG). Risposte individuali da tre diversi neuroni DRG sensibili AITC e capsaicina (CAP, 1 µM) attivati da CPZ. CPZ è stato applicato per 20 s, AITC per 30 s e CAP per 10 s ad intervalli di 4 min consentendo il recupero. KCl (60 mM) è stato applicato alla fine dell’esperimento per garantire la vitalità dei neuroni in coltura. (B) Risposta media di n = 135 neuroni sensibili AITC a tre diverse concentrazioni di CPZ (25, 50, 100 µM, 20 s ciascuno). Si noti la dipendenza dalla concentrazione dell’ampiezza dei transienti Ca2+. Le tracce diritte rappresentano la media e le tracce tratteggiate rappresentano SEMs. (C) Aumento dipendente dalla concentrazione di i indotto da CPZ in neuroni DRG sensibili AITC normalizzati a uno stimolo depolarizzante con KCl (60 mM). L’EC50 di ∼30 µM è stato calcolato adattandosi alla funzione Dose-risposta. I dati sono rappresentativi di due serie di esperimenti e mostrano mezzi ± SEM; per CPZ 1, 10, 25 µM: n = 169, per CPZ 25, 50, 100 µM: n = 138. (D) Illustrare le popolazioni di neuroni DRG CPZ-, AITC – e CAP-sensibili e la loro sovrapposizione. In un totale di 906 neuroni imaged (selezionati dalla loro risposta a KCl), 200 (22%) sono stati attivati da CPZ (50 µM), 301 (33%) da AITC (100 µM) e 323 (36%) da CAP (1 µM) (analisi dettagliata delle frazioni, vedere SI Figura Legenda 3). (E) CPZ (100 µM, 20 s) attiva i neuroni DRG sensibili AITC (100 µM, 20 s) da topi carenti di TRPV1. Risposte individuali da diversi neuroni sensibili AITC che sono stati attivati da CPZ. Circa il 90% (509/572 cellule) dei neuroni DRG carenti di TRPV1 che erano sensibili all’AITC rispondevano al CPZ. CAP (1 µM, 10 s) non ha indotto transitori Ca2+ nei neuroni TRPV1−/−. (F) Mancanza di afflusso Ca2+ indotto da CPZ (100 µM) nei neuroni DRG carenti di TRPA1. Risposte individuali da diversi neuroni DRG sensibili al CAP (1 µM) (su 448 neuroni testati) che non sono stati né attivati da CPZ né da AITC (10 µM).
La desensibilizzazione sistemica attraverso TRPA1 attenua il dolore
Dopo aver scoperto che CPZ è un potente agonista TRPA1, abbiamo capito perché i primi clisteri CPZ (due volte al giorno) erano ovviamente dolorosi nei topi WT. Abbiamo quindi quantificato il comportamento nocifensivo indotto da clistere CPZ (531 µM) in animali sani (ogni n = 6) contando le reazioni di contorcitura e registrando le risposte riflesse visceromotorie (VMRs) attraverso l’elettromiografia integrata (EMG) della parete muscolare addominale (Fig. 4 BIS, lettera B). Nel corso della ripetizione dei trattamenti CPZ due volte al giorno, abbiamo notato che i knockout TRPA1 non mostravano comportamenti correlati al dolore in qualsiasi momento. Inoltre, i topi WT hanno presentato una progressiva diminuzione delle risposte inizialmente forti al dolore con un forte declino intorno al giorno 3 che ha portato a una desensibilizzazione finalmente completa in entrambi i parametri nocifensivi. Questa perdita di percezione del dolore al colon in topi altrimenti normali ha sollevato l’aspettativa che i clisteri avrebbero potuto fornire CPZ una quantità farmacodinamica sufficiente a indurre ipoalgesia sistemica. Per testare questa ipotesi, abbiamo impiegato il test eye-wipe utilizzando AITC (100 µM) e CAP (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Entrambi i test hanno mostrato una netta attenuazione dei conteggi di eye-wipe nei topi WT che erano stati trattati con clisteri CPZ (fino a 12-16 h prima del test). Questi effetti sono stati probabilmente mediati dalla desensibilizzazione TRPA1 piuttosto che dal blocco TRPV1, poiché i topi carenti di TRPV1 erano insensibili all’instillazione di olio di senape (AITC, 100 µM) nell’occhio allo stesso grado dei topi WT (Fig. 4 QUATER). Viceversa, i clisteri CPZ erano inefficaci nei topi TRPA1−/−, quando questi topi erano sfidati dalle instillazioni del CAPPUCCIO nell’occhio (Fig. 4D).
I clisteri di capsazepina desensibilizzano le risposte al dolore locali e distanti.
(A) Reazioni acute di contorcimento in risposta a clisteri CPZ (531 µM) durante i primi 5 minuti dopo l’applicazione. Ripetuti clisteri CPZ (due volte al giorno) hanno portato ad una progressiva diminuzione delle risposte contorcenti. Una drastica riduzione del passo è stata osservata dopo 5 clisteri nei topi WT. Al contrario, i topi TRPA1−/− trattati con CPZ (531 µM) o topi WT trattati con clisteri del veicolo (PBS) hanno mostrato solo pochi contorcimenti che si sono verificati entro i primi 30 s (ciascuno n = 6). (B) Risposte visceromotorie (VMRs) ai clisteri CPZ. I clisteri CPZ due volte al giorno hanno portato a una diminuzione continua di VMRs nei topi WT, simile al corso delle reazioni di contrazione. Le VMR in risposta al veicolo non erano significativamente diverse da quelle dei clisteri CPZ in TRPA1 – / – (entrambi n = 6). (A,B) Gruppo CPZ WT rispetto al gruppo di veicoli. (C) I clisteri ripetuti di CPZ attenuano il comportamento del eye-wipe a AITC (100 µM). Sia i topi WT che TRPV1 – / – trattati con clisteri CPZ hanno mostrato una profonda riduzione dei conteggi degli occhi rispetto al veicolo (entrambi n = 6). I controlli erano topi WT senza clisteri che ricevevano gocce di veicolo (PBS) nell’occhio. (D) Clisteri CPZ attenuare eye-wipe comportamento al tappo (1 mM). WT topi trattati con veicolo e TRPA1 – / – topi trattati con clisteri CPZ due volte al giorno per 7 d ha mostrato numerose reazioni eye-wipe per CAP instillazione nell’occhio, testato 12 h dopo l’ultimo clistere CPZ (entrambi n = 6). I topi WT trattati con clisteri CPZ hanno mostrato una profonda riduzione dei conteggi degli occhi. (E) Soglie di prelievo termico e (F) meccanico di entrambi gli hindpaw durante il corso del farmaco orale CPZ (531 µM) o AITC (500 µM) tramite acqua potabile. (E) CPZ e AITC oltre 10 d rispetto al gruppo trattato con il veicolo hanno indotto un aumento progressivo durante 3-5 d nelle latenze di ritiro alla stimolazione del calore radiante, che si sono normalizzate entro 2 settimane dal lavaggio (ciascuna n = 6). F) Le soglie meccaniche alla stimolazione con un filamento elettrodinamico di von Frey non hanno mostrato alcuna tendenza sistematica per entrambi i composti (ciascuno n = 6). Tutte le misure ripetute ANOVA e Dunnett post-test, tranne in (C,D) Mann Whitney U-test.
Poiché i clisteri ripetuti sono una spiacevole via di somministrazione, abbiamo testato un possibile effetto anti-nocicettivo del CPZ orale (531 µM) nell’acqua potabile. Il regime di bere per 10 giorni è stato ben tollerato senza evidenti effetti avversi. Durante il corso della somministrazione orale continua di CPZ, la latenza di paw-withdrawal alla stimolazione del calore radiante (metodo Hargreaves) è aumentata progressivamente in entrambi gli hindpaw (Fig. 4 E). Il tempo di tolleranza è stato circa raddoppiato al giorno 7 ed è rimasto significativamente elevato dal giorno 2 a 10. Dopo 2 settimane di recupero con acqua potabile pura, le latenze di ritiro erano tornate al livello di base. La reattività meccanica alla stimolazione con la forza linearmente crescente di un filamento elettrodinamico di von Frey non è stata significativamente influenzata durante i dieci giorni di consumo di CPZ (Fig. 4 SEPTIES). Si è chiesto se l’ipoalgesia termica e chimica rappresentasse un effetto di classe degli agonisti desensibilizzanti TRPA1 o se fosse specifico per CPZ. Così abbiamo somministrato AITC in una concentrazione simile e ben tollerata (500 µM) attraverso l’acqua potabile. Lo stesso regime di dosaggio per AITC descritto per CPZ ha comportato un progressivo aumento della latenza di prelievo della zampa alla stimolazione del calore radiante che era significativamente più piccola di quella indotta da CPZ (Fig. 4 E). La reattività meccanica non è stata modificata sotto il regime di bere AITC (Fig. 4 SEPTIES).
CPZ provoca una desensibilizzazione sostenuta di TRPA1/TRPV1 che esprime i neuroni sensoriali peptidergici
Abbiamo quindi posto la domanda se la desensibilizzazione di interi animali da parte di CPZ potesse essere riprodotta a livello cellulare. A tal fine, abbiamo eseguito esperimenti di imaging del calcio con neuroni DRG isolati che erano stati ottenuti da topi di controllo e da animali trattati per 7 giorni due volte al giorno con clisteri CPZ. Questi neuroni sono stati necessariamente tenuti in coltura per 16 a 24 h, in presenza di NGF. Un totale di neuroni 399 da topi di controllo e neuroni 584 da topi trattati con clistere sono stati caricati con Fura-2 e transitori di calcio evocati da AITC, carvacrol, CAP e una soluzione ricca di KCl sono stati registrati. Le risposte a questi agonisti TRPA1 (AITC e carvacrolo) e TRPV1 (CAP) non erano significativamente diverse nei neuroni DRG dagli animali di controllo e dagli animali trattati con clistere (Fig. S1). Tuttavia, l’espressione di mRNA TRPA1 (qPCR) era circa due volte upregulated nel DRG lombosacrale preparato immediatamente dopo il clistere finale di CPZ (Fig. S2) mentre non è stato rilevato alcun cambiamento nell’espressione di TRPA1 quando sono trascorse 24 ore in vivo dopo il clistere finale. L’mRNA TRPV1 non è cambiato in entrambe le circostanze. Pertanto, la sovraregolazione trascrizionale dell’espressione genica TRPA1 aveva avuto luogo, a causa dei clisteri multipli CPZ, ma è stata rapidamente invertita quando la fornitura di CPZ è stata interrotta. In condizioni di coltura DRG, la stessa inversione epigenetica aveva probabilmente avuto luogo e tutto il CPZ residuo era probabilmente sbiadito, in modo che non ci si potesse effettivamente aspettare alcuna desensibilizzazione residua. Poiché i modelli cellulari non riflettevano la desensibilizzazione indotta da CPZ di interi animali in vivo, abbiamo cercato un altro forte indicatore del sorprendente effetto sistemico. La maggior parte dei neuroni nocicettivi è peptidergica, esprimendo prevalentemente peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e sostanza P (SP)15,17. Dopo la depolarizzazione, come da KCl e l’afflusso di calcio, a causa dell’attivazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti, questi neuropeptidi vengono rilasciati dalle fibre nervose in una funzione quasi-efferente (infiammazione neurogena). D’altra parte, i canali TRP attivati sono conduttori di calcio molto buoni da soli e non richiedono il supporto di alcun canale di sodio o di calcio voltaggio-gated per evocare l’esocitosi vescicolare di CGRP18. Pertanto, il rilascio stimolato di CGRP può servire come indice di attivazione del nocicettore (peptidergico). Allo stesso modo i neuropeptidi vasoattivi hanno vari effetti sul processo infiammatorio di per sé e l’esaurimento o la desensibilizzazione della popolazione neuronale sensoriale peptidergica ha dimostrato di attenuare la colite19,20,21. Per determinare se i clisteri CPZ (531 µM) desensibilizzano attraverso TRPA1, localmente e sistemicamente, abbiamo impiegato i preparati isolati del colon e della pelle del topo. Due punti di topi sani C57BL/6 (n = 8) sono stati esposti a CPZ (100 µM) che ha indotto un massiccio rilascio di CGRP (Fig. 5); applicazioni successive di AITC (100 µM) 5 min o 15 min dopo CPZ (Fig. 5A, B) non poteva più indurre il rilascio di CGRP, suggerendo una profonda desensibilizzazione incrociata funzionale acuta all’agonista TRPA1. Questo effetto non può essere dovuto alla deplezione, poiché la conseguente risposta KCl (60 mm) era normale. Due punti da topi che erano stati ripetutamente trattati con clisteri CPZ (531 µM) in vivo, due volte al giorno per 7 d sono stati isolati e testati 12-16 h dopo l’ultimo clistere. Né CPZ (100 µM) né AITC (100 µM) hanno indotto alcun rilascio di CGRP in questa condizione (Fig. 5C, D); in particolare, il rilascio di CGRP indotto da CAP (30 nM) è stato fortemente ridotto ma non abolito (Fig. 5 E). Al contrario, il rilascio di CGRP indotto da KCl (60 mm) mediante depolarizzazione aspecifica non è stato solo non ridotto ma effettivamente migliorato dopo i clisteri CPZ. Ciò ha indicato che le fibre nervose del colon non erano esaurite di CGRP ma piuttosto riempite eccessivamente, ma essenzialmente desensibilizzate in modo sostenuto all’attivazione chimica attraverso TRPA1 e TRPV1 (n = 6). Infine, anche la preparazione della pelle, isolata 12-16 h dopo l’ultimo clistere CPZ, ha mostrato che il rilascio di CGRP indotto da AITC (100 µM) e CAP (1 µM) era fortemente ridotto in accordo con la desensibilizzazione a livello del corpo osservata nei test comportamentali (Fig. 5F, G, vedi Fig. 4A-F) (n = 6).
Desensibilizzazione locale e sistemica dei nervi sensoriali peptidergici da parte della capsazepina (CPZ) indicata dal rilascio alterato di calcitonina gene-related peptide (CGRP).
(A) Rilascio acuto di CGRP da preparazioni isolate del colon di topi WT indotte da CPZ (100 µM); le successive esposizioni di olio di senape (AITC, 100 µM) non riescono a indurre il rilascio di CGRP, mentre la depolarizzazione aspecifica da KCl (60 mM) è efficace come normale. I dati sono mezzi + SEMs (n = 8). (B – D) Il rilascio di CGRP del colon indotto da CPZ (100 µM) e AITC (100 µM) è stato abolito nei topi pretrattati con clisteri CPZ due volte al giorno per 7 d fino al giorno prima dell’esperimento di rilascio, mentre il rilascio di CGRP del colon indotto da CAP (1 µM) è stato fortemente ridotto ma non abolito in questi topi rispetto ai controlli. (**P <0.01, ***P< 0.001, Mann Whitney U-test, ogni n = 6). (E) Allo stesso modo, il rilascio di CGRP indotto da AITC (100 µM) è stato abolito in preparati cutanei isolati dagli hindpaw di topi pretrattati con clisteri CPZ. (F) Al contrario, il rilascio di CGRP indotto da CAP (1 µM) è stato fortemente ridotto dalla pelle di questi topi rispetto ai controlli. (**P <0.01, ***P< 0.001, Mann Whitney U-test, ogni n = 6). Nota che tutti KCl (60 mM) risposte desensibilizzati CPZ e AITC risposte erano normali (B,C,E), mentre il KCl risposte non completamente insensibili CAP-stimolato, il neurone popolazione (D,F), hanno ridotto come in tutti gli esperimenti di controllo, suggerendo che il CGRP negozio di esaurimento che è impedito da efficace desensibilizzazione del CPZ/AITC sensibili sottopopolazione di neuroni.
