Preparazione di componenti proteici per la ricostituzione

I componenti dell’apparato di traduzione di E. coli, inclusi fattori di traduzione e aaRS, sono stati preparati come precedentemente descritto46. Preparazione di componenti RNaseP, M1 RNA e proteina C5 sono stati anche preparati come descritto in precedenza29. Abbiamo modificato il protocollo per la proteina C5 precipitandola con solfato di ammonio saturo all ‘ 80% e sciogliendola dializzandola contro il tampone A (50 mm di sodio acetato pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl e 7 mM 2-mercaptoetanolo). Il precipitato risultante è stato recuperato mediante centrifugazione e disciolto mediante dialisi contro tampone B comprendente 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M urea e 10 mm ditiotreitolo (DTT). Sciolto le proteine sono state applicate su un 5 mL HiTrap SP HP colonna (#17115101, GE Healthcare, USA), lavate con tampone B con 7 mM 2-mercaptoetanolo come un sostituto per 10 mM DTT, e eluita con un gradiente lineare da 100 mM a 2 M di NH4Cl in tampone B. Frazioni, contenenti C5 proteine sono stati analizzati mediante SDS-PAGE, di recupero, dialyzed contro i buffer D (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 M urea, 7 mM 2-mercaptoetanolo)quindi ulteriormente dialyzed contro i buffer D senza urea. Le soluzioni risultanti sono state concentrate utilizzando un Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) e dializzate contro buffer D senza urea contenente il 50% di glicerolo. La proteina C5 purificata è stata conservata a -30 °C. Notiamo che possiamo condividere tutti i plasmidi su richiesta.

Preparazione di enzimi di modificazione per IVTTRNA

Gli enzimi di modificazione per IVTTRNA sono stati preparati come segue. I geni di E. coli di TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE e GidA sono stati amplificati dal genoma di E. coli A19 utilizzando primer appropriati (Dati supplementari 5). I geni amplificati per TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE e GidA sono stati clonati in pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) come piccole proteine di fusione proteica modificatore ubiquitina-like (SUMO) in cui gli enzimi His-tag, SUMO protein e modificazione sono stati disposti in modo tandem. I geni per TsaB e TrmD sono stati clonati in pET15b come proteina di fusione His-tag. Tutti i geni sono stati clonati con la tecnica di assemblaggio Gibson (#E2611, New England Biolabs, USA). I plasmidi risultanti sono stati trasformati in un ceppo di E. coli BL21 (DE3) e coltivati in un mezzo da 1 L LB fino a un OD660 di 0,6 – 1,0 a 37 °C. La sovraespressione è stata indotta dall’aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM per TsaB, TsaC, TsaD, TsaE e TrmD, o 0,1 mM per GlyA, MnmC, MnmE e GidA. Dopo 3 ore di coltivazione a 37°C, le cellule sono state raccolte. Le cellule di TSAB, TsaC, TsaE, TrmD e MNME-sovraespresse sono state risospese in 40 ml di tampone di lisi (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mm MgCl2 e 7 mM 2-mercaptoetanolo) e interrotte dalla sonicazione. Il lisato risultante è stato centrifugato e il surnatante è stato recuperato e miscelato con 5 ml di resina completa di purificazione His-tag (#05893801001, Roche, Svizzera) per 1 ora con rotatore. La resina è stata lavata con 100 ml di tampone di lisi e quindi la proteina è stata elutata con 25 ml di tampone di eluizione (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mm MgCl2, 400 mm imidazolo e 7 mM 2-mercaptoetanolo). TsaB e TrmD sono stati concentrati da Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) e poi dializzati contro buffer di riserva (50 mm Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mm KCl, 10 mm MgCl2, 7 mM 2-mercaptoetanolo e 30% glicerolo). Sono stati congelati con azoto liquido e conservati a -80°C. Per TsaC, TsaE e MnmE, Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) è stato aggiunto alle frazioni recuperate ad una concentrazione finale di 23 µg/ml per rimuovere la proteina SUMO con tag His. Le frazioni sono state dializzate contro buffer di scissione (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mm KCl e 7 mM 2-mercaptoetanolo) durante la notte mentre il buffer di scissione conteneva 500 mm KCl per la preparazione MnmE. I campioni dializzati sono stati nuovamente miscelati con 5 ml di resina completa di purificazione His-tag con rotatore. Quindi sono state raccolte le frazioni fluide che contengono enzimi di modifica. I campioni recuperati sono stati concentrati da Amicon Ultra 3 kDa per TsaE o Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) per TsaC e MnmE. Sono stati dializzati contro il buffer di riserva, congelati con azoto liquido e conservati a -80 °C. Per la preparazione di GlyA, tutti i buffer contenevano il 10% di glicerolo e le altre procedure erano uguali alla preparazione MnmE. TsaD è stato trovato per essere insolubile dopo sonicazione. Pertanto, la proteina è stata pellettata mediante centrifugazione a 20.400 × g a 4 °C per 45 min ed è stata risospesa in tampone di lisi integrato con 4% Triton X-100. La sospensione è stata nuovamente pellettata mediante centrifugazione a 20.400 × g per 45 min. Il pellet è stato sciolto con tampone di lisi integrato con 6 M di urea. L’altra procedura era uguale alla preparazione MnmE, tranne che tutti i tamponi contenevano 2 M di urea. Per la preparazione MnmC, tutti i passaggi fino alla rimozione della proteina SUMO His-tagged erano uguali alla preparazione GlyA. Poiché MnmC non è specificatamente legato alla resina di purificazione His-tag, è stata selezionata la purificazione con cromatografia a scambio anionico. La soluzione dopo il trattamento con Ulp1 è stata dializzata contro tampone IEX (50 mm Hepes-KOH, pH 7.6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 7 mM 2-mercaptoetanolo) e quindi applicata su una colonna HiTrap Q HP da 5 ml (#17115401, GE Healthcare, USA). La colonna è stata lavata con 25 ml di buffer IEX e quindi MnmC è stato eluito con un gradiente di liner da 100 mM a 1 M KCl in buffer IEX. Le frazioni contenenti MnmC sono state concentrate da Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dializzate contro buffer di riserva, congelate con azoto liquido e conservate a -80°C. Notiamo che possiamo condividere tutti i plasmidi su richiesta.

Preparazione di geni iVTtRNA

per ogni iVTtRNA (Dati supplementari 1) sono stati clonati nel vettore pGEMEX-1 (#P2211, Promega, USA) tra siti di restrizione XbaI e BamHI. Utilizzando i plasmidi risultanti come modelli, i modelli di DNA per la trascrizione in vitro sono stati amplificati mediante PCR utilizzando un primer promotore T7 come primer forward e primer reverse appropriati per ciascun iVTtRNA (Dati supplementari 1). Ogni primer inverso conteneva una modifica di 2 ‘- metossi al secondo nucleotide dal 5 ‘ – terminale per impedire l’aggiunta indipendente dal modello di un nucleotide extra 28. I prodotti sono stati purificati da fenolo/cloroformio / alcool isoamilico (25: 24: 1) estrazione, seguita da precipitazione etanolo, e precipitanti sono stati sciolti in acqua. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). I componenti della RNasi P composti da proteina C5 e RNA M1 sono stati successivamente aggiunti alle miscele di reazione a 150 nM per la rimozione dei 27 nucleotidi extra e le reazioni sono state incubate per 1 h a 37 °C. Gli IVTTRNA trascritti sono stati quindi elaborati con estrazione di fenolo acido seguita da estrazione di cloroformio/alcool isoamilico (10:1), quindi purificazione mediante cromatografia a scambio anionico. I campioni contenenti IVTTRNA sono stati caricati su colonne HiTrap Q HP da 10 ml (#17115401, GE Healthcare, USA) e lavati con tampone Q (20 mm HEPES-KOH pH 7.6 e 200 mm KCl). iVTtRNAs sono stati eluiti con un gradiente lineare da 200 mM a 1 M KCl in Q buffer. Le frazioni contenenti IVTTRNA bersaglio, determinate mediante urea-PAGE, sono state recuperate mediante precipitazione di isopropanolo e gli IVTTRNA precipitati sono stati sciolti in acqua e conservati a -80°C fino all’uso. Notiamo che possiamo condividere tutti i plasmidi su richiesta.

Modifica di iVTtRNA

T6A37 modifica è stata eseguita nella miscela di reazione contenente 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM piridossal-5 ‘ – fosfato, 1 mM Ser, 1 mm Gly, 36,4 µM SAM, 0,1 unità/µL inibitore ricombinante della RNasi (#2313 A, TaKaRa, Giappone), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2,5 µM MnmC, 6 A260 unità/mL tRNAGluUUC o tRNAGluCUC. Dopo incubazione a 37°C per 2 ore per la modificazione t6A37 e m1G37 o 4 ore per la modificazione mnm5U34, i TRNA sono stati trattati con estrazione di fenolo acido seguita da estrazione di cloroformio/alcool isoamilico (10:1) e recuperati mediante precipitazione di isopropanolo. I TRNA precipitati sono stati sciolti in acqua e conservati a -80 °C. Per la modifica mnm5U34, la reazione è stata nuovamente eseguita con TRNA recuperati. Sono stati trattati con estrazione di fenolo acido seguita da estrazione di cloroformio/alcool isoamilico (10:1), dissalati dalle colonne MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, USA) e recuperati dalla precipitazione di isopropanolo. I TRNA precipitati sono stati disciolti in acqua e conservati a -80 °C. Per quantificare l’efficienza di modifica, è stato utilizzato 57,1 µM Thr invece di 1 mm Thr e la miscela senza TsaD è stata utilizzata come controllo per la modifica t6A37. 36.4 µM S–adenosil-metionina è stata utilizzata e la miscela senza TrmD è stata utilizzata come controllo per la modifica di m1G e senza GidA è stata utilizzata come controllo per la modifica di mnm5U34. Dopo l’incubazione a 37 °C, le aliquote (10 µL) sono state ritirate e individuate sui dischi filtranti Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). I dischi filtranti sono stati lavati due volte con TCA al 10%, quindi etanolo, seguito dalla misurazione della radioattività da parte di un contatore di scintillazione liquido. Per la quantificazione della modifica mnm5U, i TRNA sono stati purificati come sopra e quindi l’unità 0.02 A260 è stata individuata sui dischi del filtro.

Aminoacilazione

Gli esperimenti di aminoacilazione sono stati eseguiti secondo una precedente relazione47. Le miscele di reazione (10 µL) contenevano 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mm MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 unità/µL inibitore ricombinante della RNasi (#2313 A, TaKaRa, Giappone), 50 nM o 1,5 µM aaRS corrispondenti a ciascun amminoacido, 20 µM-aminoacido o 68 µM Asn per l’aminoacilazione dell’asparagina e 2 A260 unità/mL tRNA. Per misurare la metilazione, è stata invece utilizzata una miscela di 0,6 µM Met e 3,4 µM di L-metionina fredda. Cys è stato ottenuto riducendo-cistina con 50 mM DTT a 37 °C per 15 min. Per misurare la cisteinilazione, la concentrazione di DTT era di 5 mm. Quando sono state utilizzate miscele di tRNA native, sono state aggiunte invece 40 miscele di tRNA A260 unità/mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Dopo l’incubazione a 37°C per 30 min, le aliquote (8 µL) sono state ritirate e individuate sui dischi filtranti Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). I dischi filtranti sono stati lavati due volte con TCA al 10%, quindi con etanolo, seguito dalla misurazione della radioattività da parte di un contatore di scintillazione liquido.

La sintesi di ottapeptidi con il sistema PURO

I modelli di DNA che codificano gli ottapeptidi sono stati amplificati mediante PCR con primer appropriati (Dati supplementari 2) utilizzando il vettore pURE1 (#PUREV001, BioComber, Giappone) contenente una sequenza di promotori T7 e il sito di legame del ribosoma (sequenza Shine-Dalgarno) come modello. I modelli di DNA amplificati sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione PCR QIAquick (#28104, QIAGEN, Germania). Le reazioni di sintesi di octapeptide contenevano 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM di potassio glutammato, 13 mM acetato di magnesio, 2 mM spermidina, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM di creatina fosfato, 10 µg/mL 10-formil-5,6,7,8-acido tetraidrofolico, 0,2 µM ribosoma, 4 nM modello di DNA, proteica PURA componenti del sistema, compresi i fattori di conversione e di enzimi, aminoacidi, e trna. Le concentrazioni dei componenti proteici del sistema PURO erano quelle descritte in un protocollo precedente46. Notiamo che tutti i 20 AARS sono stati inclusi in questo esperimento, indipendentemente dai modelli di DNA e dai codoni di test. La composizione e la concentrazione degli amminoacidi, che dipendono dai codoni di prova, sono elencate nei dati supplementari 2. La composizione degli IVTTRNA dipende dal modello e le reazioni sono state eseguite utilizzando IVTTRNA basali (Dati supplementari 2) in presenza o assenza di IVTTRNA test (Dati supplementari 2). La concentrazione di ciascun iVTtRNA è stata fissata a 6 µM. Quando sono state utilizzate miscele di tRNA native, sono state aggiunte 56 miscele di tRNA A260 unit/mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Le reazioni sono state eseguite per 60 min a 37 °C e le aliquote sono state ritirate, macchiate su carte filtranti Whatman 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, USA), bollite in 10% TCA a 90 °C per 30 min per deacilare aminoacil-RNA. La radioattività nella frazione insolubile al 10% di TCA è stata misurata con un contatore di scintillazione liquido.

Sintesi proteica con il sistema PURO

Gli esperimenti di sintesi proteica sono stati eseguiti con un kit PUREfrex 2.0 (#PF201, GeneFrontier Corporation, Giappone) senza miscele di tRNA in Soluzione I (Buffer mix). Abbiamo inoltre aggiunto 0.2 µM Met, 4 nM PCR-amplified DNA template per DHFR o sfGFP espressione (Dati supplementari 3), e una quantità specificata di iVTtRNA miscela o nativo tRNA miscela. Le reazioni sono state eseguite a 30 o 37 °C per 12 h e sono state analizzate le proteine sintetizzate.

Analisi di proteine sintetizzate

DHFR sintetizzato e sfGFP contenenti Met radioattivo sono stati analizzati da 15% SDS-PAGE e l’immagine del gel è stata visualizzata utilizzando un analizzatore di bio-imaging BAS-5000 (GE Healthcare, USA). L’analisi del corso temporale dell’espressione sfGFP è stata eseguita misurando la fluorescenza sfGFP ogni 3 minuti utilizzando un sistema StepOne qRT-PCR (#4376373, Applied Biosystems, USA). Le immagini di fluorescenza di sfGFP sintetizzato in miscele di reazione sono state ottenute utilizzando uno strumento LAS-4000 (GE Healthcare, USA). L’attività del DHFR sintetizzato è stata misurata come descritto in precedenza44. Le miscele di reazione (2 mL) contenevano 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mm etanolammina, 100 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoetanolo, 0.1 mM EDTA, 100 µM di acido diidrofolico e un’aliquota di 10 µL della miscela di reazione PURA e sono stati incubati a 37 ° C per 15 min. Successivamente, 20 mm NADPH è stato aggiunto a una concentrazione finale di 200 µM e la diminuzione dell’assorbanza a 340 nm è stata misurata in un periodo di 10 min con uno spettrofotometro V-550 (Jasco, Giappone). Un’unità di DHFR è stata definita come la quantità di enzima necessaria per elaborare 1 µmol di acido diidrofolico in 1 min a 37 °C.

LC-MS analisi di proteine sintetizzate

DHFR con sequenza FLAG al suo terminale (Dati supplementari 3) è stata sintetizzata con un PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Giappone) senza miscele tRNA in Soluzione I (Buffer mix). Abbiamo inoltre aggiunto 4 nM PCR-amplificato modello di DNA per DHFR etichettato con sequenza BANDIERA al suo C-terminale (Dati supplementari 3) e una quantità specificata di miscela iVTtRNA o miscela tRNA nativo. Le reazioni sono state eseguite a 30 ° C per 12 h. Il DHFR sintetizzato è stato purificato con perline magnetiche M2 anti-BANDIERA (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Aliquote (55 µL) delle miscele di reazione sono state mescolate con 245 µL del tampone FLAG wash (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mm NaCl, 20 mm Mg(OAc)2), e successivamente miscelati con perline 30 µL per 1 h. Le perle sono state lavate con 210 µL del tampone di lavaggio FLAG seguito dal lavaggio con il tampone senza Mg(OAC)2 due volte (210 µL e 180 µL). Quindi, DHFR è stato eluito con 50 µL del FLAG wash buffer senza Mg(OAC) 2 ma integrato con 100 µg/mL 3xflag peptide (#F4799, Sigma-aldrich, USA) dopo aver mescolato delicatamente per 1 h. La preparazione dei campioni per l’analisi LC-MS è stata eseguita secondo un protocollo di tensioattivo a trasferimento di fase (PTS) 48. I 4 µL di un tampone PTS denso (100 mm di sodio desossicolato, 100 mm di sodio N-lauroilsarcosinato e 500 mm di NH4HCO3) sono stati aggiunti a 40 µl dei campioni eluiti. Sono stati ridotti con TCEP 10 mM a 37 °C per 30 min, alchilati con iodoacetamide 20 mM a 37 °C per 30 min e temprati con Cys 20 mm. Ogni soluzione di reazione è stata divisa in due parti. Uno è stato digerito da 10 ng / µl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) e 10 ng/µl tripsina (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) a 37 °C durante la notte. L’altro è stato digerito da 10 ng/µl Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) a 37 °C durante la notte. Dopo la digestione, l’acido trifluoroacetico 10% (TFA) è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 1% e le soluzioni di reazione sono state centrifugate a 15.000 × g per 5 min per precipitare i detergenti. I supernatanti sono stati dissalati utilizzando punte di fase auto-preparate49 e asciugati con SpeedVac. L’analisi LC-MS è stata eseguita utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) dotato di una sorgente di ioni nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) e un sistema nano-LC (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). Le miscele peptidiche essiccate sono state sciolte in una soluzione contenente 5% acetonitrile e 0,1% TFA e ciascun campione è stato applicato al sistema nano-LC. I peptidi sono stati concentrati utilizzando una colonna trappola (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Consensi PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) e quindi separato utilizzando un nano colonna capillare (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Giappone), utilizzando due fasi mobili A (0.1% di acido formico) e B (acetonitrile e 0,1% di acido formico), con pendenza (5% B per 5 min, 5-45% B in 45 min, 45-90% B in 1 min, e il 90% di B in 4 min) con una portata di 500 nL/min. L’eluizione è stata direttamente elettrospray (2,2 kV)nel MS (modalità positiva, intervallo di scansione di 200-1500 m/z, risoluzione 60.000 FWHM) 50.