3.8 CARD11 carenza
dominio di reclutamento di Caspase 11 (CARD11), noto anche come dominio di reclutamento di caspase associata di membrana guanilato chinasi di proteina 1 (CARMA1) è un membro di una famiglia di membrana associati guanilato chinasi, e agisce come una proteina dell’impalcatura che facilita la formazione di complessi macromolecolari che integrano TCR – e BCR-mediata segnalazione e promuovere l’attivazione della canonica di NF-kB signaling pathway (Bertin et al., 2001). È prevalentemente espresso nei tessuti ematopoietici e linfoidi, come milza, timo e leucociti periferici (Bertin et al., 2001). Dopo l’impegno antigene-recettore e l’attivazione di PLC-γ, il fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2) viene convertito in inositolo 1,4,5-trisfosfato (InsP3) e diacilglicerolo (DAG). Quest’ultimo attiva la proteina chinasi C (PKC)-β nei linfociti B e PKC-θ nei linfociti T. PKC fosforila la regione linker di CARD11 (Matsumoto et al., 2005; Sommer et al., 2005), inducendo cambiamenti conformazionali che consentono a CARD11 di associarsi al linfoma a cellule B 10 (BCL10) e alla proteina di traslocazione del linfoma del tessuto linfoide associato alla mucosa 1 (MALT1) (McCully & Pomerantz, 2008). Il complesso CARD11-BCL10-MALT1 (CBM) recluta la proteina fattore 6 (TRAF6) associata al recettore del fattore di necrosi tumorale, che attiva il complesso della chinasi IkB (IKK) che fosforila l’inibitore IkBa, determinando la sua fosforilazione e ubiquitinazione. Questo rilascia subunità di NF-kB da IkBa. I dimeri NF-kB possono quindi traslocare al nucleo e legarsi a sequenze di consenso di geni bersaglio mediando così la loro trascrizione (Fig. 4.2). In particolare, CARD11 si lega alla subunità regolatrice IKK-γ (nota anche come modulatore essenziale NF-kB, NEMO) (Stilo et al., 2004) e modula la sua poliubiquitinazione in seguito alla stimolazione del recettore dell’antigene (Shambharkar et al., 2007). Questa modifica è essenziale per l’attività della chinasi IKK (Shambharkar et al., 2007).
Un ruolo per il complesso CBM nella funzione immunitaria e nell’omeostasi è stato ulteriormente dimostrato quando sono state identificate mutazioni somatiche del guadagno di funzione di CARD11 e traslocazioni cromosomiche che coinvolgono BCL10 e MALT1 in pazienti con linfoma diffuso a grandi cellule B e linfoma del MALTO (Shaffer, Young,& Staudt, 2012). È interessante notare che l’introduzione di mutazioni puntiformi CARD11 trovate nel linfoma in linfociti B maturi attivati dall’antigene nei topi ha determinato un passaggio dalla morte delle cellule B indotta da auto-antigene alla proliferazione indipendente dalle cellule T, indicando che CARD11 agisce anche come modulatore della tolleranza delle cellule B (Jeelall et al., 2012).
Più recentemente, mutazioni bialleliche di perdita di funzione di CARD11 sono state identificate in pazienti con immunodeficienza combinata. Stepensky et al. hanno descritto un bambino di 13 mesi, nato da genitori consanguinei, che ha presentato infezioni ricorrenti, tra cui P. polmonite di jiroveci e panhypogammaglobulinemia progressiva (Stepensky et al., 2013). Allo stesso modo, Greil et al. riportato il caso di una femmina di 6 mesi nata da genitori consanguinei, che ha presentato polmonite da P. jiroveci e agammaglobulinemia (Greil et al., 2013). Entrambi i pazienti avevano un numero normale di linfociti T e B nella periferia, con un repertorio policlonale di TCR e livelli conservati di TREC e di circoli di escissione del recettore kappa, indicando che la generazione di linfociti T e B non era influenzata. Tuttavia, le cellule B erano immature, con un aumento della percentuale di linfociti B di transizione (Greil et al., 2013; Stepensky et al., 2013). Inoltre, sia i linfociti B naïve che quelli transitori hanno espresso quantità inferiori di recettore del fattore attivante delle cellule B (BAFF-R) (Stepensky et al., 2013). In entrambi i casi, sono state identificate anomalie significative nel compartimento delle cellule T. In particolare, entrambi i bambini avevano un numero marcatamente ridotto di cellule Treg circolanti. La proliferazione in vitro dei linfociti T in anti-CD3 solubile è stata abolita. La stimolazione dei linfociti T e B con PMA e ionomicina ha determinato una degradazione difettosa dell’IkBa, una riduzione della fosforilazione p65 e della traslocazione nucleare e una riduzione della produzione di citochine rispetto a quanto osservato nei controlli sani. Inoltre, i linfociti T attivati in vitro con PMA e ionomicina, o con anti-CD3/CD28 solubile, hanno prodotto quantità ridotte di IL-2 e non sono riusciti a sovraregolare l’espressione di ICOS, CD25 e OX40. Allo stesso modo, la stimolazione dei linfociti B con anti-IgM ha portato a una ridotta espressione di CD25 e ICAM-1 rispetto ai controlli (Greil et al., 2013; Stepensky et al., 2013). Questi dati erano fortemente indicativi di attivazione NF-kB difettosa. WES ha rivelato mutazioni bialleliche della CARD11 in entrambi i pazienti, in particolare una mutazione nonsense (Q945*) (Greil et al., 2013), e una cancellazione dell’esone 21 (Stepensky et al., 2013). L’introduzione della mutazione Q945 * nella linea cellulare JPM50.6 Jurkat T carente di CARD11 ha comportato l’incapacità di attivare NF-kB e la produzione di IL-2 marcatamente difettosa (Greil et al., 2013). I topi Card11 – / – e i topi non modulati (portatori di una mutazione Card11 ipomorfa), mostrano un fenotipo simile, con difetto selettivo nell’attivazione di NF-kB, diminuzione della proliferazione e ridotta produzione di citochine in risposta alla stimolazione TCR/BCR, ipogammaglobulinemia e scarse risposte anticorpali agli antigeni T-dipendenti e T-indipendenti (Hara et al., 2003; Jun et al., 2003). Nel complesso, queste osservazioni identificano mutazioni germinali di perdita di funzione di CARD11 come una nuova causa di immunodeficienza combinata con linfociti T e B disfunzionali.
È interessante notare che le mutazioni eterozigoti del guadagno della funzione germinale in CARD11 hanno anche dimostrato di causare anomalie delle cellule T e B. In particolare, Snow et al. ha riferito quattro pazienti da due famiglie, che hanno presentato con splenomegalia e linfocitosi delle cellule B. Le indagini immunologiche hanno rivelato un aumento del numero di cellule B policlonali tardive di transizione nella periferia, una maggiore proliferazione delle cellule B in vitro in risposta alla stimolazione IgM e una maggiore traslocazione nucleare della proteina p65 nei linfociti B e T circolanti (Snow et al., 2012). L’accumulo di cellule B tardive di transizione nella periferia non rifletteva una maggiore proliferazione o una maggiore sopravvivenza ed era probabilmente dovuto a un’elevata produzione dal midollo osseo. L’esame istologico dei tessuti linfoidi ha mostrato follicoli primari prominenti, con centri germinali atrofici. I pazienti hanno avuto un numero ridotto di cellule B circolanti di memoria e non sono riusciti a montare le risposte anticorpali agli antigeni polisaccaridici. Inoltre, la differenziazione dei linfociti B dei pazienti in plasmablasti in vitro è stata compromessa.
L’uso del sequenziamento massivo parallelo dell’mRNA ha permesso l’identificazione di una mutazione eterozigote E127G di CARD11 in pazienti affetti dalla prima famiglia. L’introduzione di questo mutante nelle cellule T JPM50.6 carenti di CARD11 ha portato all’attivazione costitutiva di NF-kB. Il paziente affetto dalla seconda famiglia è stato trovato per portare una mutazione eterozigote G116S CARD11, che era stato precedentemente segnalato per essere un mutante somatico gain-of-function in un tumore DLBCL (Lenz et al., 2008). Nonostante la natura attivante delle mutazioni CARD11, i linfociti T dei pazienti hanno mostrato proliferazione difettosa, ridotta espressione di CD25 e CD69 e ridotta produzione di IL-2 in risposta alla stimolazione con anti-CD3/CD28 solubile. L’introduzione del mutante E127G nelle cellule T normali ha portato ad un aumento dell’espressione di CD69 e della produzione di IL-2; tuttavia, quando le cellule sono state stimolate tramite CD3/CD28, hanno prodotto significativamente meno IL-2 e hanno mostrato una proliferazione ridotta rispetto ai transfettori di controllo (Snow et al., 2012). Questi dati indicano che le mutazioni di gain-of-function CARD11 eterozigoti germinali causano la segnalazione costitutiva di NF-kB che promuove l’aumento del rilascio di cellule B transitorie dal midollo osseo, l’espansione selettiva di cellule B periferiche transitorie e naïve, associata all’incapacità di mantenere un pool di cellule B di memoria e l’induzione di anergia delle cellule T. Questa condizione è stata indicata anche come” Espansione delle cellule B con sindrome NF-kB e anergia delle cellule T ” (Snow et al., 2012). Complessivamente, questi dati dimostrano che entrambe le mutazioni di perdita di funzione e guadagno di funzione di CARD11 interferiscono con la funzione delle cellule T.
