2. Regolazione dell’attività delle catepsine della cisteina

L’attivazione dello Zymogen è uno dei principali mezzi di regolazione dell’attività della catepsina. Tutte le catepsine sono cioè sintetizzate come zimogeni inattivi e attivate nell’ambiente acido delle vescicole endolisosomiali. Il meccanismo molecolare della loro attivazione è stato sconcertante per molto tempo. Le informazioni critiche è venuto dalla combinazione di studi strutturali di procathepsins B, K e L, che ha mostrato che il propeptide viene eseguito attraverso il sito attivo delle catepsine in direzione opposta a quella del substrato, escludendo in tal modo la scissione del propeptide nella molecola senza enormi ed energeticamente sfavorevole movimenti strutturali del propeptide , eliminando in questo modo la unimolecolare meccanismo inizialmente suggerito, e dettagliati studi cinetici, che ha chiaramente dimostrato che l’attivazione della catepsina B è un processo bimolecolare . Il modello attuale, che si basa principalmente sugli studi sulla catepsina B, suggerisce che il propeptide nella catepsina zymogen commuta tra due conformazioni, la cosiddetta “chiusa” e “aperta”.”Nella conformazione “chiusa”, favorita a pH neutro o leggermente acido, il propeptide blocca il sito attivo e impedisce l’idrolisi del substrato, mentre, nella forma” aperta”, favorita a pH acido inferiore a pH 5.0, il propeptide viene rimosso dalla fessura del lato attivo, con conseguente bassa attività catalitica dello zimogeno. Questa attività è sufficiente per attivare un’altra catepsina zymogen in uno o più passaggi, iniziando così la reazione a catena, dove tale catepsina matura completamente attiva B elabora la maggior parte delle molecole di zymogen .

Gli altri principali regolatori delle catepsine della cisteina sono inibitori macromolecolari che si legano nel sito attivo e quindi impediscono l’associazione della peptidasi con il suo substrato. Appartengono a diverse famiglie distinte tra cui le cistatine, le tiropine e le serpine che possono, oltre alle proteasi della serina, inibire anche diverse catepsine .

3. I glicosaminoglicani come principali regolatori dell’attività della catepsina della cisteina

I glicosaminoglicani (GAG) sono eteropolisaccaridi composti da unità disaccaridiche ripetute con un’alta carica negativa. Ciò è il risultato della presenza di più gruppi carbossilici e sostituzioni di solfato. La maggior parte delle GAG sono solfati, tra cui condroitin solfati (CS), keratan solfato (KS), dermatan solfato (DS), eparan solfato (HS), ed eparina, mentre ialuronano (HA) è l’unico GAG non solfati. Negli ultimi anni le GAG stanno emergendo come importanti regolatori delle catepsine della cisteina con diversi effetti sui loro obiettivi. Tradizionalmente, le catepsine della cisteina erano state viste come proteasi lisosomiali e, come altri enzimi lisosomiali, erano note per essere inibite da GAG intralisosomiali nel lisosoma a riposo . Oggi, tuttavia, le catepsine della cisteina sono stabilite come attori principali nella proteolisi extracellulare . La loro azione nell’ambiente extracellulare ricco di glicosaminoglicani ha sollevato domande sull’interazione tra catepsine di cisteina e GAG al di fuori del lisosoma. I due gruppi di catepsine umane endogene della cisteina più comunemente associati con proteolisi extracellulare sono proteasi del tipo di catepsina L (catepsine K, L, S e V in esseri umani) e catepsina B . I dati accumulati negli ultimi due decenni mostrano che l’interazione tra queste peptidasi e GAG va in entrambe le direzioni; le catepsine di cisteina sono in grado di scindere le proteine del nucleo proteoglicano e quindi rilasciare GAG dal loro supporto, mentre le GAG a loro volta influenzano sia l’attività che la stabilità delle catepsine di cisteina nello spazio extracellulare.

La regolazione della cisteina peptidasi simile alla papaina da parte di GAG è stata descritta per la prima volta per la catepsina L . In questi primi lavori è stato riscontrato che GAG e varie superfici caricate negativamente accelerano sostanzialmente l’attivazione della catepsina L zymogen nella forma matura, anche a pH vicino al neutro, come si trova anche nell’ambiente extracellulare in varie condizioni di malattia. Questo è stato confermato per molte altre catepsine, le più importanti sono le catepsine B e S, e anche per a T. congolense parasite homologue congopain, suggerendo che GAG e altre superfici caricate negativamente possono svolgere un ruolo importante nell’attivazione extracellulare della catepsina nella malattia. Tuttavia, recenti scoperte con catepsina S ad alta concentrazione di GAG suggeriscono che questo enzima può comportarsi in modo leggermente diverso in tali condizioni con condroitina-4-solfato (C4S) anche esibendo un effetto decelerante . Tuttavia, facilitando l’attivazione autocatalitica delle catepsine dal polisaccaride caricato negativamente dextran solfato è diventato anche un metodo di routine in preparazione delle catepsine ricombinanti .

La maggior parte delle informazioni sul meccanismo molecolare dell’attivazione della catepsina assistita da GAG proviene da uno studio di Caglič et al. utilizzando catepsina umana B come modello . Come mostrato, le GAG sembrano contribuire all’elaborazione in due modi. In primo luogo, al momento del legame sembrano convertire la catepsina zymogen in un substrato migliore. In secondo luogo, il legame di GAG apparentemente favorisce la conformazione aperta dello zimogeno, promuovendo così l’attivazione non solo a pH acido ma anche a valori di pH più vicini al neutro. Questo sembra essere il caso per la maggior parte delle GAG e non dipende criticamente dalla densità di carica delle GAG, poiché anche HA è stato in grado di accelerare l’attivazione, anche se in misura inferiore, il che è insolito per un’interazione proteina-GAG. Inoltre, già un tetrasaccaride era sufficiente per un’accelerazione prominente dell’autoattivazione della catepsina B, che è sostanzialmente più piccola di quella trovata per un certo numero di altre reazioni mediate dal GAG . L’interazione è mediata da interazioni ioniche; tuttavia, non sembra esserci alcuna superficie di legame GAG conservata sugli zimogeni poiché sono stati trovati residui completamente indipendenti nelle procatepsine L e B, che erano in gran parte localizzate sui prodomains, che governano l’interazione .

L’altro ruolo importante delle GAG nella regolazione dell’attività della catepsina è venuto dagli studi sulla papaina, il rappresentante archetipo della famiglia . Questa modalità di regolazione ha rapidamente ricevuto più attenzione con la scoperta che il condroitina-solfato dalla cartilagine ha aumentato in modo prominente l’attività collagenolitica della catepsina K . Questa particolare peptidasi era stata scoperta alcuni anni prima come l’unica proteasi responsabile della degradazione del collagene nel rimodellamento osseo e immediatamente riconosciuta come potenziale candidato al farmaco per il trattamento delle malattie metaboliche delle ossa, come l’osteoporosi . L’interazione della catepsina K con condroitina-solfato e altri glicosaminoglicani è stata successivamente esaminata in dettaglio da entrambe le prospettive strutturali e funzionali e i glicosaminoglicani sono stati riconosciuti come i primi regolatori allosterici noti di una cisteina catepsina peptidasi , come descritto in dettaglio nelle sezioni seguenti. In parallelo, sono state documentate interazioni funzionalmente rilevanti con i glicosaminoglicani anche per altri membri della famiglia della cisteina catepsina. Presi insieme, i glicosaminoglicani sono stati trovati per colpire sia l’attività che la stabilità delle catepsine della cisteina. I profili cinetici sono generalmente coerenti con meccanismi iperbolici, indicando interazioni con enzimi al di fuori del sito attivo, possibilmente attraverso meccanismi allosterici. L’effetto stabilizzante è importante soprattutto a causa della relativa instabilità delle catepsine cisteina a pH neutro trovato nella matrice extracellulare.

4. Regolazione dell’attività e della stabilità della catepsina K

Di tutte le peptidasi simili alla papaina, la catepsina K è stata stabilita come la catepsina più strettamente legata ai glicosaminoglicani. È stato originariamente identificato come una proteasi espressa prevalentemente negli osteoclasti e la sua attività compromessa ha dimostrato di provocare gravi disturbi ossei . La catepsina K è una collagenasi con attività unica tra le peptidasi dei mammiferi, che è specificamente modulata dai glicosaminoglicani attraverso meccanismi allosterici . A causa del suo ruolo centrale nel turnover osseo, la catepsina K è attualmente considerata uno degli obiettivi più promettenti per il trattamento dell’osteoporosi . Oltre al rimodellamento osseo, la catepsina K è coinvolta in diversi processi fisiologici e patologici (per una recente revisione vedere ). Può fendere un certo numero di substrati extracellulari, compresi i proteoglicani, per rilasciare glicosaminoglicani attivi , che a loro volta modulano la sua attività. Nella cartilagine, la catepsina K degrada sia i collageni di tipo I che di tipo II e quindi contribuisce allo sviluppo di varie malattie infiammatorie articolari . Inoltre, la catepsina K è stata associata a malattie cardiovascolari, obesità, schizofrenia e cancro .

L’interazione della catepsina K con diversi glicosaminoglicani è stata oggetto di indagini approfondite. Sebbene diversi aspetti di queste interazioni rimangano elusivi, i dati accumulati suggeriscono che le interazioni sono eterogenee e diverse e probabilmente coinvolgono più siti di legame sull’enzima. Condroitin-4-solfato (C4S) è stato inizialmente identificato come il GAG con l’effetto più drammatico sulla catepsina K mentre gli effetti di condroitin-6-solfato (C6S), dermatan solfato (DS) e ialuronano (HA) erano più deboli. Tutti i GAG testati hanno aumentato la stabilità della catepsina K su un ampio intervallo di pH. C4S ha avuto l’effetto più importante sulla degradazione dei collageni di tipo I e II da parte della catepsina K , mentre il suo effetto sull’idrolisi di un substrato sintetico era praticamente identico a quello di C6S e DS e ha comportato un duplice aumento dei valori della costante di specificità . In uno studio successivo, keratan sulfate (KS) e C6S sono stati trovati per avere un effetto stimolante sulla catepsina K simile a quello di C4S, mentre eparina e HS hanno avuto un effetto limitato sull’attività collagenolitica della catepsina K. I primi esperimenti hanno anche suggerito che la formazione complessa con CS è necessaria per l’attività collagenolitica della catepsina K ; tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il collagene di tipo I può anche essere degradato in modo efficiente in assenza di glicosaminoglicani . Tuttavia, è stato dimostrato che i GAG residenti nell’osso potenziano l’attività collagenolitica della catepsina K e che le concentrazioni endogene di GAG nell’osso sono state sufficienti per un effetto massimo sull’attività della catepsina K.

Il meccanismo cinetico dell’effetto di CS, DS ed eparina (HP) sulla catepsina K è stato anche studiato in dettaglio a pH plasmatico fisiologico di 7,4. In queste condizioni, CS e DS sono stati caratterizzati come attivatori non essenziali con un effetto predominante sull’affinità per il substrato . DS era più efficace di CS, che è stato attribuito alla sua maggiore flessibilità a causa di un minor numero di legami idrogeno intramolecolari . La fluorescenza intrinseca ha indicato che il legame di GAG influenza la conformazione della catepsina K. In contrasto con gli esperimenti eseguiti a pH 5,5, CS e DS hanno agito come inibitori della degradazione del collagene a pH plasmatico fisiologico. Al contrario, il meccanismo cinetico dell’eparina era bifasico, indicando l’interazione con due siti distinti sull’enzima. Complessivamente, l’eparina era un forte attivatore della catepsina K a pH fisiologico del plasma, aumentando sia le sue attività collagenolitiche che elastinolitiche. Inoltre, l’eparina ha avuto un forte effetto stabilizzante sulla catepsina K in queste condizioni, con un conseguente aumento di oltre 5 volte dell’emivita dell’enzima .

5. Base strutturale per l’interazione tra catepsina K e GAG

La struttura cristallina della catepsina K e C4S ha rivelato la base strutturale per l’interazione . Il sito di legame si trova sul retro della catepsina K e interagisce con tre unità disaccaridiche di CS nella struttura cristallina(Figura 2 (a)). Come al solito, l’interazione glicosaminoglicano/proteina è mediata principalmente da interazioni elettrostatiche tra la catena GAG caricata negativamente e i residui caricati positivamente sull’enzima. Il legame del condroitina-solfato non causa cambiamenti conformazionali significativi nella catepsina K rispetto alla catepsina K senza CS. Viceversa, la catena CS è piegata al legame con la catepsina K(Figura 2 (b)). La maggior parte del cambiamento conformazionale può essere attribuita all’interazione con una breve regione elicoidale Arg8-Lys9-Lys10 che interagisce con quattro gruppi caricati negativamente su CS (Figura 2(c)). Ulteriori contatti stretti includono Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 e Leu195 e alcuni contatti aggiuntivi mediati dall’acqua .

(a)

(b)

(c)

(d)

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(d)

Figure 2

Interactions between human cathepsin K and GAGs. (a) Crystal structure of the cathepsin K/chondroitin-4-sulfate (C4S) complex. La proteina è mostrata nella rappresentazione dei cartoni animati e C4S è mostrato come bastoni. (b) Cambiamento conformazionale in C4S al legame con la catepsina K. (c) Rappresentazione dettagliata dell’interazione nel pannello (a). C4S è mostrato come bastoni. La spina dorsale della catepsina K è mostrata come nastri e i residui che interagiscono con C4 sono mostrati come bastoncini. d) Posizione del secondo sito di legame previsto con l’eparina nella catepsina K. I residui caricati positivamente proposti per interagire con l’eparina sono mostrati come bastoncini blu. Per l’orientamento, C4S legato al primo sito di rilegatura è mostrato come bastoni. La posizione della fessura del sito attivo è contrassegnata da una freccia. Le coordinate del complesso di catepsina K / C4S sono state recuperate dalla Banca dati delle proteine con il codice di adesione 3C9E. La struttura della soluzione di C4S è stata modellata utilizzando i dati di . Tutte le immagini sono state create con PyMOL.

Il comportamento cinetico di DS era analogo a quello di CS: è stato quindi proposto che interagisca con la catepsina K nello stesso modo di CS . L’eparina, d’altra parte, è stata proposta per legarsi a due siti sulla catepsina K secondo il suo profilo cinetico. Mentre il primo sito di legame è stato proposto per essere identico a quello per CS / DS, il secondo sito di legame è stato previsto sul fondo della molecola mediante esperimenti di cross-linking chimico e modellazione computazionale . Dal punto di vista strutturale, il sito di legame previsto è una continuazione del sito di legame CD/DS e consiste di diversi residui di base (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 e Lys214) organizzati in una struttura a forma di anello(Figura 2 (d)). Gli esperimenti cinetici hanno confermato che l’eparina può essere legata a entrambi i siti contemporaneamente . Tuttavia, resta da determinare se ciò richiede una catena HP che interagisca con entrambi i siti contemporaneamente o due catene HP separate. Questo non è né chiaro per l’interazione di altre GAG con il secondo sito HP-binding.

6. Interazioni di GAG con catepsine S e B

Oltre alla catepsina K, altre due peptidasi umane simili alla papaina, le catepsine S e B, hanno dimostrato di essere regolate dai glicosaminoglicani nelle loro forme mature . La catepsina S, il parente più prossimo della catepsina K, è insolita tra le catepsine della cisteina per essere stabile a pH neutro . La catepsina S ha importanti ruoli fisiologici nelle cellule che presentano l’antigene come la proteasi più importante nell’elaborazione dell’antigene ed è stata recentemente trovata regolata da C4S . In contrasto con l’effetto di attivazione osservato con la catepsina K, C4S ha agito come inibitore della degradazione del collagene di tipo IV da parte della catepsina S. L’inibizione è stata osservata anche con HS, mentre HP, DS, C6S e HA hanno leggermente aumentato l’attività proteolitica della catepsina S usando il collagene di tipo IV come substrato. C4S, C6S e HS hanno anche inibito l’idrolisi di Z-Phe-Arg-AMC tramite un meccanismo parziale e misto. Simile alla catepsina K, sottili cambiamenti conformazionali nella catepsina S sono stati osservati sul legame C4S mediante spettroscopia di fluorescenza intrinseca. Tre siti di legame per C4S sono stati previsti sulla catepsina S mediante docking molecolare(Figura 3 (a)). Uno dei siti proposti è il sito attivo, che, tuttavia, non è in accordo con il profilo di inibizione mista osservato di C4S; il secondo si trova sul lato inferiore destro della molecola e corrisponde al sito allosterico recentemente identificato nella catepsina K, mentre il terzo si trova nella parte inferiore della molecola e corrisponde approssimativamente al sito secondario di legame con eparina identificato nella catepsina K .

(a)

(b)

(c)

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(b)
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Figure 3

Predicted GAG-binding sites in papain-like peptidases. (a) Three predicted CS-binding sites in cathepsin S. (b) Two predicted HS/HP-binding sites in cathepsin B. (c) The conserved GAG-binding motif in papain. I siti previsti sono mostrati in cerchi e i residui caricati positivamente in ogni sito sono mostrati come bastoncini blu ed etichettati. La posizione della fessura del sito attivo è contrassegnata da una freccia. Tutte le coordinate sono state ottenute dalla Banca dati delle proteine (codici di adesione: 1NQC per la catepsina S, 3AI8 per la catepsina B e 1PPN per la papaina, resp.). Tutte le immagini sono state create con PyMOL.

La catepsina B è unica tra le catepsine della cisteina per essere sia un’endopeptidasi che una peptidil dipeptidasi, a seconda della conformazione del ciclo occlusivo, una struttura specifica della catepsina B che fornisce un interruttore specifico del pH tra entrambe le attività . Nel lisosoma, il pH basso limita la proteasi ad una conformazione chiusa, esopeptidasi, mentre il pH quasi neutro dell’ambiente extracellulare promuove l’attività endopeptidasi della catepsina B . La catepsina extracellulare B è più comunemente associata a cancro e vari tipi di artrite . La proteasi si è localizzata sulla superficie cellulare in diversi studi ed è stata trovata coinvolta nella migrazione cellulare in condizioni sia fisiologiche che patologiche . A livello molecolare, è stato dimostrato di fendere un certo numero di substrati extracellulari, tra cui laminina, collagene di tipo IV e fibronectina . Recentemente, la catepsina B è stata anche suggerita come una β-secretasi che produce peptidi β amiloidi nelle vescicole secretorie delle cellule cromaffine neuronali . Tuttavia, è stato anche dimostrato di degradare i depositi di amiloide in un modello animale e il risultato complessivo è stato suggerito per essere determinato dall’equilibrio tra catepsina B e il suo inibitore endogeno cistatina C.

Il legame di HP o HS ha dimostrato di aumentare la stabilità dell’enzima altrimenti instabile a pH alcalino (8,0), riducendo leggermente l’attività dell’enzima lungo l’intero profilo pH dell’enzima . Le simulazioni computazionali hanno predetto che l’eparina stabilizza la conformazione della molecola in queste condizioni e hanno predetto due siti putativi di legame GAG(Figura 3 (b)), uno su ciascun lato dell’enzima . Il sito di legame putativo nel dominio L è costituito da cinque residui di base (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 e Lys144), mentre quello nel dominio R ne contiene solo due (Lys158 e Arg235). Gli autori hanno suggerito che il sito di legame nel dominio R ha una maggiore affinità per frammenti di GAG più brevi, come il disaccaride di eparina usato nelle loro simulazioni di attracco, mentre quello nel dominio L è probabilmente più rilevante per il legame di frammenti di GAG più lunghi .

7. Interazioni di GAG con altre peptidasi simili alla papaina

È interessante notare che la papaina ha anche dimostrato di interagire con GAG. Pur non avendo alcuna rilevanza fisiologica, queste interazioni indicano meccanismi di regolazione evolutivamente conservati all’interno della famiglia. HP inibito papaina da un meccanismo misto iperbolico e influenzato la sua conformazione . Una classica sequenza di consenso legata all’eparina è stata identificata nella papaina, sotto forma della sequenza 187 -le-Arg -le-Lys-Arg-Gly-192. Strutturalmente, questa sequenza si trova sul lato destro della molecola(Figura 3 (c)) in una regione che si trova tra entrambi i siti allosterici noti nella catepsina K.

Inoltre, sono stati descritti alcuni esempi di proteasi da parassiti protozoi che interagiscono con GAG, suggerendo la possibilità della loro influenza sulle interazioni ospite-parassita. La catepsina L omologo brucipaina, un fattore di virulenza cruciale del parassita protozoo Trypanosoma brucei, è stato trovato per essere allostericamente modulata da HS. L’effetto dell’HS in questo studio è stato sottile e ha avuto la capacità di invertire l’inibizione del substrato da parte di un piccolo substrato dipeptidico (Z-Phe-Arg-AMC) . Un effetto più forte di HS è stato osservato per cruzipain dal parassita correlato Trypanosoma cruzi. In questo caso, HS era un attivatore della peptidasi che causava un aumento significativo (fino a 6 volte) dell’attività della peptidasi misurata con un substrato sintetico. Inoltre, HS ha aumentato il rilascio di chinina da chininogeno ad alto peso molecolare da cruzipain in vitro e da tripomastigoti viventi e ha ridotto le proprietà inibitorie del chininogeno verso cruzipain . Allo stesso modo, HP è stato recentemente dimostrato di modulare l’attività della peptidasi catepsina L-like rCPB2.8 da Leishmania mexicana . In questo caso, HP e HS, ma non CS o DS, inibivano l’idrolisi di Z-Phe-Arg-AMC da un meccanismo misto iperbolico e influenzavano la conformazione della proteina . Complessivamente questi esempi mostrano che le interazioni con GAG non sono limitate alle catepsine endogene di cisteina, ma possono anche svolgere diversi ruoli nelle interazioni ospite-patogeno e possono agire sia come parte della difesa del corpo contro gli agenti patogeni invasori o come fattori che contribuiscono ai meccanismi invasivi del patogeno.

8. Targeting farmacologico

La catepsina K rappresenta attualmente il bersaglio farmacologico più attraente tra le catepsine, sebbene la catepsina S sia anche un bersaglio rilevante nelle malattie associate a una risposta immunitaria elevata, come l’asma bronchiale e la psoriasi . Diversi inibitori della catepsina K sono attualmente in fase di sviluppo, che mirano al sito attivo dell’enzima (raccolto in ). Al momento, l’inibitore più promettente è odanacatib (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), un inibitore contenente testate di nitrile, altamente selettivo per la catepsina K . Gli studi clinici di fase III per odanacatib sono stati conclusi con successo e le domande di approvazione dovrebbero essere presentate presto. Se approvato, il farmaco si posizionerà sul mercato contro altri farmaci di nuova generazione, come l’anticorpo anti-ligando denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) e il teriparatide, una forma ricombinante di ormone paratiroideo (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA), così come i bifosfonati ben consolidati . Il targeting dell’interazione catepsina K/condroitina-solfato rappresenterebbe un’alternativa a questi trattamenti. Il condroitina-solfato endogeno è sufficiente per esibire un massimo effetto di attivazione sulla catepsina K e la sua digestione riduce l’attività della catepsina K del 40% . Una riduzione del turnover osseo di questa entità sarebbe probabilmente sufficiente per il trattamento di pazienti con riduzione della densità ossea meno grave. Un ulteriore vantaggio sarebbe che l’attività della catepsina K di per sé, nonché la vitalità e il numero di cellule di osteoclasti e osteoblasti rimarrebbero indisturbati.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Riconoscimento

Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’Agenzia slovena di ricerca (P1-0140 e J1-3602) a Boris Turk.