Abstract
La trascrizione dell’HIV-1 è regolata da CDK9/ciclina T1, che, a differenza di una tipica chinasi dipendente dal ciclo cellulare, è regolata associandosi al complesso proteico ribonucleare nucleare 7SK small nuclear (snRNP). Mentre i componenti proteici di questo complesso sono ben studiati, il meccanismo della formazione complessa non è ancora completamente compreso. L’associazione di CDK9 / ciclina T1 con 7SK snRNP è, in parte, regolata da una fosforilazione CDK9 reversibile. Qui, presentiamo una revisione completa delle chinasi e delle fosfatasi coinvolte nella fosforilazione CDK9 e discutiamo il loro ruolo nella regolazione della replicazione dell’HIV-1 e il potenziale per essere mirati allo sviluppo di farmaci. Proponiamo un nuovo percorso di regolazione della trascrizione dell’HIV-1 tramite fosforilazione CDK9 Ser – 90 da CDK2 e defosforilazione CDK9 Ser-175 da parte della proteina fosfatasi-1.
1. Introduzione
L’eradicazione completa dell’infezione da HIV-1 richiede nuovi approcci per indurre il provirus integrato dell’HIV-1 che non è influenzato dai farmaci antiretrovirali esistenti e che è rebound al termine della terapia antiretrovirale . La latenza dell’HIV-1 può essere il risultato di diversi fattori come la carenza di proteina attivatore trascrizionale dell’HIV-1 (Tat) o attivatori trascrizionali cellulari, interferenza trascrizionale con i promotori cellulari, sito di integrazione sfavorevole, epigenetica e probabilmente altri fattori . Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi di attivazione della trascrizione dell’HIV-1 è importante per la progettazione di nuove terapie volte all’induzione e all’inibizione della trascrizione dell’HIV-1. Qui, esaminiamo le chinasi e le fosfatasi coinvolte nell’attivazione di CDK9/ciclina T1 e discutiamo di come questi enzimi possono essere potenzialmente utilizzati per inibire o attivare l’HIV-1 per lo sviluppo di futuri interventi terapeutici per il trattamento delle infezioni da HIV-1.
2. Attivazione della trascrizione dell’HIV-1 da parte di P-TEFb
La trascrizione dell’HIV-1 è attivata dalla proteina Tat dell’HIV-1 che si lega al rigonfiamento dell’RNA di CATRAME, una struttura a tornante situata all’estremità 5’di tutti i trascritti nascenti dell’HIV-1, e recluta CDK9/ciclina T1, un componente del fattore di allungamento positivo della trascrizione b (P-TEFb) al promotore dell’HIV-1 (esaminato in dettaglio in ; vedi anche illustrazione in Figura 1). Durante l’inizio della trascrizione, TFIIH-associato CDK7/ciclina H fosforilati Ser-5 all’interno 1YSPTSPS7 sequenza eptapeptide ripetuto 52 volte nel dominio C-terminale (CTD) di RNAPII . Il RNAPII fosforilato Ser-5 si accumula a 20-40 nucleotidi (nt) a valle del sito di inizio della trascrizione, in parte a causa delle azioni del complesso del fattore di allungamento ad azione negativa, NELF, e del complesso di induzione della sensibilità DRB, DSIF . Recentemente TFIIH-associato CDK7 è stato dimostrato di fosforilare anche CTD residui Ser-7, che può innescare Ser-2 fosforilazione da P-TEFb . Il reclutamento di P-TEFb al promotore dell’HIV-1 situato all’interno della regione U3-R-U5 del 5′ LTR è facilitato dal Tat che mira a CDK9/ciclina T1 all’RNA di CATRAME dove la ciclina T1 si lega al ciclo ricco di G dell’RNA di CATRAME . Il reclutamento di CDK9 / cyclin T1 promuove l’allungamento della trascrizione da RNA polimerasi II (RNAPII) che altrimenti è messo in pausa dopo la sintesi di RNA del CATRAME . Rilascio di RNAPII dalla pausa dal complesso P-TEFb è accompagnato da mRNA tappatura e perdita di NELF . P-TEFb innesca l’allungamento della trascrizione della RNA polimerasi II (RNAPII) fosforilando il fattore di allungamento negativo (NELF) e il complesso di induzione della sensibilità DRB (DSIF/Spt4/Spt5), promuovendo così il rilascio di NELF e anche fosforilando i residui di Ser-2 in RNAPII CTD (rivisto in ). Dopo la dissociazione di NELF, DSIF diventa un fattore di allungamento positivo e aumenta la processività RNAPII . Sebbene P-TEFb viaggi con il complesso di allungamento, la sua attività chinasica CTD non è più necessaria una volta che il complesso viene rilasciato dalla pausa .
A causa dell’importanza di P-TEFb, la regolazione deve essere mantenuta per assicurare il corretto funzionamento. La fosforilazione e la defosforilazione di siti specifici su CDK9 devono avvenire durante tutto il processo di trascrizione e devono essere strettamente controllate. Questa revisione si concentra sulla regolazione di CDK9 attraverso modifiche di fosforilazione.
3. Composizione di P-TEFb e il suo ruolo nell’attivazione della trascrizione dell’HIV-1
P-TEFb è un eterodimero costituito da chinasi 9 dipendente dalla ciclina (CDK9) e una delle cicline di tipo C T1, T2a o T2b di cui la ciclina T1 è il partner più abbondante . La ciclina K che originariamente si pensava fosse una ciclina minore di CDK9 è ora riconosciuta come un partner ciclina per CDK12 e CDK13 . Solo la proteina T1 della ciclina forma efficientemente un complesso con HIV-1 Tat legato all’RNA del CATRAME . Ciò è dovuto alla presenza di un residuo di cisteina nella ciclina T1 nella posizione 261 piuttosto che di un’asparagina trovata nelle proteine della ciclina T2a e T2b. La ciclina T1 con Cys-261 mutato si lega a Tat ma non è in grado di reclutare Tat in RNA CATRAME. L’interazione di Tat con il RNA del CATRAME e la ciclina T1 dipende dagli ioni dello zinco che ancora una volta richiede la presenza di Cys-261 .
Ci sono due isoforme funzionali di CDK9: una forma di 42 kDa prevalentemente espressa in milza, timo e testicolo e una forma di 55 kDa che è espressa in vari tessuti ma a livelli significativamente più bassi che è l’isoforma di 42 Kd . Tutte le cicline si associano ad entrambe le isoforme di CDK9 e mostrano attività chinasica verso CTD in RNAPII . Circa la metà di P-TEFb è in un grande complesso inattivo legato da 7SK snRNA e diverse proteine aggiuntive tra cui esametilene bisacetamide-inducibile proteina 1 (HEXIM1) , La-related LARP7 proteina , e metilfosfatasi tappatura enzima MePCE . La forma a peso molecolare inferiore di P-TEFb è costituita da CDK9 e ciclina T1 ed è enzimaticamente attiva . L’alto peso molecolare P-TEFb è inattivo a causa dell’HEXIM1 che introduce la sua sequenza inibitoria di PYNT nel sito attivo di CDK9 .
Il complesso P-TEFb ad alto peso molecolare serve come fonte di CDK9 / ciclina T1 per il reclutamento da HIV-1 Tat . Nelle cellule indotte dallo stress, il complesso CDK9 / ciclina T1 si dissocia dalla proteina 7 SK RNA / HEXIM1 e quindi lega BRD4 e forma un piccolo complesso trascrizionalmente attivo che viene reclutato in vari promotori cellulari . Nonostante l’inattività del grande complesso P-TEFb in vitro, il grande complesso, e non il piccolo complesso, è importante per l’attivazione della trascrizione dell’HIV-1 come HIV-1. Tat compete con HEXIM1 per legarsi alla ciclina T1 promuovendo la dissociazione di P-TEFb dal grande complesso . È stato anche dimostrato che la proteina Tat HIV-1 recluta un grande complesso P-TEFb al promotore HIV-1 in cui l’RNA di CATRAME è stato in grado di spostare 7 RNA SK e attivare P-TEFb .
Tat facilita anche la formazione di super elongation complex (SEC) contenente P-TEFb attivo e ulteriori fattori di allungamento e coattivatori di trascrizione . Questi fattori includono AFF4, ENL, AF9 e fattore di allungamento ELL2 . La proteina AFF4 emerge come lo scaffold centrale che recluta altri fattori attraverso interazioni dirette. AFF4 lega la ciclina T1, ELL2 e ENL o AF9 che agiscono come un ponte che collega questo complesso a P-TEFb . Attraverso le funzioni di ponte di Tat e AFF4, P-TEFb e ELL2 si combinano per formare un complesso di allungamento bifunzionale che attiva notevolmente la trascrizione dell’HIV-1 . Senza Tat, AFF4 può mediare l’interazione ELL2-P-TEFb, anche se in modo inefficiente. Tat supera questa limitazione portando più ELL2 a P-TEFb e stabilizzando ELL2 in un processo che richiede P-TEFb attivo .
4. Fosforilazione CDK9
L’attività di P-TEFb dipende dalla fosforilazione di diversi residui di serina e treonina e ne discuteremo di seguito e che sono mostrati nel modello CDK9 / cyclin T1 / Tat in Figura 2.
4.1. Fosforilazione del C-terminale CDK9
Un gruppo di residui del C-terminale di CDK9 (Ser-347, Ser-353 e Ser-357; Thr-350 e Thr-354) è autofosforilato e questa fosforilazione è importante per il legame di CDK9/ciclina T1 all’RNA del CATRAME . Ciò è stato evidenziato dall’incapacità di CDK9 C-terminale troncato enzimaticamente attivo di legare l’RNA di CATRAME . Il ricombinante CDK9 / ciclina T1 che è stato autofosforilato in vitro è stato efficientemente dephoshorylated dalla proteina fosfatasi 2A (PP2A) ma non dalla proteina fosfatasi-1 (PP1) . Anche il trattamento con PP2A ha impedito il legame di CDK9/ciclina T1 a Tat e TAR RNA in vitro . Queste osservazioni hanno suggerito che PP2A può indirizzare il C-terminale di CDK9 e potenzialmente controllare l’interazione di P-TEFb con RNA del CATRAME. L’autofosforilazione di CDK9 associata al complesso di preiniziazione in vitro è stata inibita da TFIIH . PP2A è stato poi trovato per essere essenziale per la trascrizione basale di HIV-1 in vitro, come deplezione di PP2A inibito trascrizione basale di HIV-1 e l’add-back di PP2A agli estratti impoveriti ripristinato la trascrizione . Il target PP2A è stato pensato per essere Thr-29 (vedi sotto), ma questo non è stato dimostrato con certezza e l’effetto non è stato riprodotto in vivo. In uno studio iniziale, abbiamo osservato una lieve induzione della trascrizione HIV-1 basale ma non indotta da Tat da basse concentrazioni di acido okadaico inibitorie PP2A . Abbiamo anche osservato l’induzione della trascrizione basale e non della trascrizione HIV-1 attivata da Tat con la sovraespressione della proteina LIS1 che abbiamo trovato per legare e inibire PP2A in vitro e interagire con la proteina Tat HIV-1 . Collettivamente, questi studi indicano che PP2A può regolare la trascrizione basale dell’HIV-1 e anche controllare l’interazione di P-TEFb con l’RNA di CATRAME mediante defosforilazione del C-terminale di CDK9.
4.2. N-Terminale Thr-29 Fosforilazione
La fosforilazione del Thr-29 di CDK9 è stata indicata per essere indotta dalla proteina fiscale HTLV-1 . CDK9 / ciclina T1 è reclutato per cromatinizzato HIV-1 LTR e altri promotori da BRD4 . Questo reclutamento di BRD4 è stato collegato alla fosforilazione di CDK9 Thr-29 e al requisito per la defosforilazione di PP2A da parte del gruppo di John Brady . Tuttavia, il gruppo di Qiang Zhou ha riferito che CDK9 è necessario per essere fosforilato su Ser-175 per legarsi a BRD4, che è stato recentemente confermato dal gruppo di Jonathan Karn (vedi discussione dettagliata sotto). Il Thr-29 di CDK9 è omologo a Thr-15 su CDK2, in cui la fosforilazione inibisce l’attività CDK2 . Infatti la fosforilazione di Thr-29 ha dimostrato di inibire l’attività CDK9 e la trascrizione dell’HIV-1 . Tuttavia, non siamo riusciti a rilevare la fosforilazione CDK9 Thr-29 in cellule trattate con acido okadaico che inibiva sia PP2A che PP1 utilizzando una combinazione di elettroforesi a strato sottile Hunter 2D e spettrometria di massa ad alta risoluzione che mostrava solo la fosforilazione del cluster C-terminale Ser/Thr e Ser-175 di cui solo la fosforilazione Ser-175 Pertanto, la fosforilazione CDK9 Thr-29 potrebbe non essere controllata da PP2A e deve essere ulteriormente convalidata per chiarire il suo ruolo durante la trascrizione dell’HIV-1.
4.3. T-Loop di CDK9 Thr-186 Fosforilazione
CDK9 T loop contiene diversi siti di fosforilazione, tra cui Ser-175 e Thr-186 (Figura 2). La fosforilazione del Thr-186 conservato è necessaria per l’attività enzimatica di CDK9 . Anche l’associazione di CDK9 / ciclina T1 con 7SK RNA snRNP richiede la fosforilazione Thr-186 di CDK9 . Nei CDK, la fosforilazione del T-loop innesca importanti cambiamenti conformazionali che aprono la tasca di legame ATP e un sito di legame del substrato rendendo i CDK pienamente attivi come chinasi .
Recentemente, l’analisi chimico-genetica che utilizza l’inibizione chimica selettiva di CDK7 ha dimostrato che è l’unico responsabile della fosforilazione di CDK9 Thr-186 e della fosforilazione CTD Ser-2 dipendente da P-TEFb e dell’ubiquitilazione dell’istone H2B in vivo . Così, CDK7 / ciclina H che è stato precedentemente identificato come CDK-attivazione chinasi (CAK) per i CDK coinvolti nel ciclo cellulare come CDK1, 2, e 4 funziona anche come CAK per CDK coinvolti nella regolazione della trascrizione che includono CDK8, 9, 12, e 13 (rivisto in). Analisi globale delle chinasi che possono fosforilare CDK9 T-loop utilizzando siRNA identificato Ca (2+)/calmodulina-dipendente chinasi 1D (CaMK1D) abbattere da siRNA diminuita fosforilazione Thr-186 . Di conseguenza, l’inibizione della piccola molecola della via di segnalazione Ca(2+) ha ridotto la fosforilazione Thr-186 e ha inibito la trascrizione indotta da Tat HIV-1 ma non la trascrizione HTLV-1 mediata dalle tasse . Poiché la trascrizione mediata dalle tasse è guidata da P-TEFb, resta da indagare ulteriormente perché solo la trascrizione dell’HIV-1 è stata influenzata.
La fosforilazione CDK9 Thr-186 può anche essere controllata dalle fosfatasi cellulari. I nostri studi negli ultimi dieci anni si sono concentrati su PP1 che inizialmente abbiamo osservato per stimolare la trascrizione dell’HIV-1 Tat-dipendente in vitro . Quando abbiamo sovraespresso una delle principali subunità regolatorie nucleari di PP1, NIPP1 (inibitore nucleare di PP1), abbiamo osservato l’inibizione specifica di PP1 della trascrizione dell’HIV-1 e della replicazione virale . Abbiamo notato che Tat contiene una sequenza simile a un motivo RVXF di legame PP1 conservato e ha dimostrato che questo motivo media il legame Tat a PP1 in vitro e in vivo e che la mutazione dei residui nel motivo di legame PP1 (V36A e F38A) ha impedito a Tat di indurre la trascrizione dell’HIV-1 . CDK9 che è stato fosforilato in cellule coltivate a spillo con (32P) ortofosfato e trattato con acido okadaico è stato efficientemente defosforilato in vitro da PP1 ma non da PP2A in contrasto con il CDK9 autofosforilato in vitro che è stato defosforilato da PP2A e non da PP1 . Questi risultati hanno suggerito che PP1 può controllare la fosforilazione CDK9 durante la trascrizione dell’HIV-1. In effetti, la subunità catalitica alfa di PP1, PP1a, ha dimostrato di agire in modo cooperativo e sequenziale con (Ca2+)-calmodulina-proteina fosfatasi 2B (PP2B) in cellule irradiate UV o esametilene bisacetamide (HMBA)-trattate in cui P-TEFb viene rilasciato dal complesso 7SK snRNP . Mentre PP2B induce un cambiamento conformazionale in 7SK snRNP, PP1a defosforila CDK9 Thr-186 e facilita i rilasci di P-TEFb da 7SK snRNP . CDK9 è rimasto defosforilato mentre associato a BRD4 e reclutato nel complesso di preiniziazione, dove può essere riattivato da CDK7 associato a TFIIH. In accordo con questo studio, abbiamo osservato un aumento della fosforilazione CDK9 Thr-186 nelle cellule che esprimevano stabilmente un peptide inibitorio PP1, il dominio centrale di NIPP1, e abbiamo anche osservato una maggiore associazione di CDK9/ciclina T1 con 7SK RNA . L’espressione stabile di cdNIPP1 ha interrotto l’interazione tra Tat e PP1 e ha inibito la trascrizione dell’HIV-1 , suggerendo che è necessario mantenere un equilibrio tra fosforilazione e defosforilazione di CDK9 Thr-186 e che spostare questo equilibrio verso la fosforilazione è inibitorio per la trascrizione dell’HIV-1. Espressione di cdNIPP1 in modo fisiologicamente rilevante come parte del genoma dell’HIV-1 al posto della replicazione dell’HIV-1 potentemente inibita da nef , suggerendo inoltre che gli inibitori mirati a PP1 possono essere utili come potenziali terapie anti-HIV-1. Mentre PP1 è un candidato per la defosforilazione di Thr-186, abbiamo anche scoperto che defosforila CDK9 Ser-175 (vedi sotto). Un’ulteriore fosfatasi CDK9 Thr-186, fosfatasi proteica magnesio-dipendente 1A (precedentemente 2C) (PPM1A) è stata identificata utilizzando una libreria di espressione della fosfatasi e anticorpi Thr-186-fosfospecifici . La sovraespressione di PPM1A ha diminuito la fosforilazione di Thr-186 e la deplezione mediata da siRNA l’ha aumentata, e P-TEFb e PPM1A hanno anche coprecipitato insieme suggerendo che CDK9 può essere un substrato fisiologico per PPM1A . Uno studio più recente ha mostrato che la fosforilazione Thr-186 di CDK9 è diminuita nelle cellule T CD4(+) a riposo che non sono permissive per la replicazione dell’HIV-1 e che questa diminuzione è correlata con l’abbondanza di PPM1A e il reclutamento limitato di CDK9 al grande complesso P-TEFb . Questa scoperta supporta ulteriormente la necessità del grande complesso per la trascrizione dell’HIV-1 e il ruolo critico di PPM1A nella soppressione dell’HIV-1 nelle cellule T a riposo. Poiché l’espressione di PPM1A non è stata modificata dopo l’attivazione delle cellule T, tuttavia fattori regolatori sconosciuti possono essere coinvolti nella regolazione dell’attività di PPM1A.
4.4. T-Loop di CDK9 Ser-175 Fosforilazione
Una volta che CDK9 / ciclina T1 si dissocia dal grande complesso P-TEFb, CDK9 può diventare fosforilato su Ser-175. Mentre la defosforilazione Thr-186 ha completamente inibito l’attività della chinasi CDK9/ciclina T1, nessuna differenza è stata trovata nelle attività della chinasi dei mutanti CDK9 S175A e CDK9 S175D di David Price e colleghi . Al contrario, Qiang Zhou e il suo gruppo hanno mostrato che il mutante CDK9 S175A era inattivo, mentre il mutante CDK9 S175D era attivo come chinasi . Hanno anche dimostrato che la fosforilazione Ser-175 promuove il legame di CDK9/ciclina T1 a Brd4 . È stato suggerito che la fosforilazione di Ser-175 può causare un cambiamento conformazionale in CDK9, permettendo a BRD4 di legarsi alla ciclina T1 . Nel nostro recente studio, abbiamo scoperto che l’inibizione dinamica di PP1 ha portato alla fosforilazione esclusiva di CDK9 Ser-175 come determinato da una combinazione di mappatura del peptide Hunter 2D e analisi LC-MS in vivo . L’inibizione di PP1 ha portato all’inibizione dell’attività CDK9 e alla riduzione della fosforilazione di RNAPII in vitro e in vivo . Abbiamo scoperto che il mutante CDK9 S175A era enzimaticamente attivo e induceva la trascrizione dell’HIV-1 . È interessante notare che, mentre il mutante CDK9 S175D era meno attivo come chinasi, formava più facilmente un piccolo complesso P-TEFb, specialmente quando PP1 era inibito. Così abbiamo concluso che PP1 attiva la trascrizione dell’HIV-1 dephosphorylating CDK9 Ser-175 residuo. Abbiamo anche notato che l’attività di fosforilazione di Ser-175 era molto più abbondante dell’attività di Thr-186 negli estratti cellulari, suggerendo che l’attività CDK9 può essere soppressa naturalmente attraverso la sovrafosforilazione di Ser-175. Un recente studio condotto dal gruppo di Jonathan Karn ha dimostrato che l’attivazione delle cellule T attraverso il recettore delle cellule T (TCR) o l’estere di phorbol (PMA) che segnala la fosforilazione fortemente indotta del CDK9 Ser-175 . Sulla base della modellazione molecolare hanno proposto che Ser-175 fosforilato forma un legame idrogeno con Tat Lys-14 rafforzando il legame di Tat a CDK9/ciclina T1 e promuovendo l’attivazione della trascrizione dell’HIV-1 . Anche in conformità con le prime osservazioni, la mutazione CDK9 S175A è stata trovata per abolire il legame con BRD4 . Inoltre, in accordo con le nostre osservazioni, il mutante CDK9 S175A è stato trovato per indurre notevolmente la riattivazione latente dell’HIV-1 Tat-dipendente, che Jonathan Karn e i suoi colleghi hanno attribuito all’incapacità di questo mutante di legare BRD4 pur essendo in grado di legarsi a Tat . Hanno anche scoperto che CDK9 fosforilato a Ser-175 è escluso dal complesso 7SK RNP , che è parallelo alla nostra precedente osservazione che il mutante fosfomimetico CDK9 S175D è stato trovato nel piccolo complesso P-TEFb . Pertanto, questo ultimo studio indica Ser-175 come un obiettivo importante per la riattivazione dell’HIV-1 e il potenziale sviluppo di terapie a piccole molecole.
Recentemente abbiamo sviluppato piccole molecole mirate a PP1 che sono state modellate per adattarsi alla cavità che ospita RVxF su PP1 . Abbiamo esaminato virtualmente circa 300.000 composti e poi abbiamo esaminato fisicamente circa 1000 composti e identificato un composto hit, 1H4, che ha inibito la trascrizione e la replicazione dell’HIV-1 a concentrazioni non citotossiche . 1H4 ha impedito la defosforilazione mediata da PP1 di un peptide di substrato contenente una sequenza RVxF in vitro, ha interrotto l’associazione di PP1 con Tat nelle cellule coltivate e ha impedito la traslocazione di PP1 al nucleo . Siamo attualmente in fase di raffinazione del composto hit e anche lo sviluppo di composti PP1-mirati per l’attivazione di provirus latente.
4.5. La fosforilazione Ser-90 di CDK9
Noi e altri abbiamo dimostrato in precedenza che la trascrizione dell’HIV-1 è attivata da Tat nella fase G1, ma non nella fase G2 . Così abbiamo ipotizzato che Tat potrebbe coinvolgere una chinasi regolatrice del ciclo cellulare, che abbiamo dimostrato essere CDK2 / ciclina E . L’HIV-1 è inibito nelle cellule di knockdown CDK2 e anche nella differenziazione dei macrofagi dalle cellule staminali pluripotenti indotte con knockdown CDK2 , suggerendo ulteriormente che CDK2 è importante per la trascrizione e la replicazione dell’HIV-1. Il legame funzionale tra CDK2 e CDK9 è stato trovato quando abbiamo analizzato l’inibizione dell’HIV-1 da parte dei chelanti del ferro. La trascrizione dell’HIV-1 è stata inibita nelle cellule T trattate con chelanti di ferro 311 e ICL670 che hanno anche inibito l’attività cellulare di CDK2 e CDK9 . Più potenti chelanti del ferro tridentato a base di di-2-piridilchetone tiosemicarbazone hanno inibito la trascrizione dell’HIV-1 e la replicazione del virus a concentrazioni molto più basse rispetto a 311 o ILC670 e hanno anche inibito l’attività CDK2 e CDK9 . Mentre il meccanismo di inibizione CDK2 non è ancora chiarito, è probabile che includa l’induzione di p21 attraverso la sovraregolazione del fattore 1 indotto dall’ipossia (HIF-1) poiché l’esaurimento del ferro rimuove il ferro dalla prolil idrossilasi e aumenta i livelli di proteine HIF-1 e HIF-2 imitando l’effetto dell’ipossia . Abbiamo analizzato la fosforilazione CDK9 da parte di CDK2 in vitro e identificato un motivo (90SPYNR94) che rappresentava un sito di fosforilazione CDK2 di consenso e che era efficientemente fosforilato . La fosforilazione di CDK9 su Ser-90 è stata rilevata con anticorpi fosfospecifici ed è stata ridotta dopo l’abbattimento di CDK2. L’associazione mutante CDK9 S90A con il grande complesso P-TEFb è stata ridotta e la sua sovraespressione ha inibito la trascrizione dell’HIV-1. Al contrario, il mutante CDK9 S90D ha mostrato un’associazione invariata con complessi P-TEFb grandi e piccoli e ha indotto la trascrizione Tat-dipendente dell’HIV-1. Tuttavia, il fosfomimetico S90 ha mostrato una diminuzione complessiva dell’espressione CDK9 suggerendo che un equilibrio di fosforilazione/defosforilazione deve essere mantenuto per formare i complessi P-TEFb grandi e piccoli. La modellazione molecolare ha mostrato che Ser-90 di CDK9 si trovava su un anello flessibile esposto al solvente, suggerendo che potrebbe essere in fase di fosforilazione (vista anche nella Figura 2). Così i nostri studi recenti hanno identificato un nuovo sito di fosforilazione regolamentare su CDK9 che può essere mirato per l’attivazione o l’inibizione della trascrizione dell’HIV-1.
5. Conclusione
La fosforilazione e la defosforilazione di siti specifici su CDK9 si verificano durante tutto il processo di trascrizione e devono essere strettamente controllate. Le modifiche a determinati residui di treonina / serina determinano se CDK9 si associa al grande complesso P-TEFb per diventare disponibile per il reclutamento e se la dissociazione del grande complesso si verificherà in modo efficiente. La fosforilazione di Thr-186 nel T-loop di CDK9 e Ser-90 che si trova al di fuori del T-loop determina se CDK9 rimane sequestrato nel grande complesso inattivo e anche se la chinasi è enzimaticamente attiva una volta dissociata da 7SK snRNP. La defosforilazione in uno di questi siti porta alla destabilizzazione del grande complesso e al rilascio di CDK9/Ciclina T1, limitando così il reclutamento di Tat a HIV-1 LTR. Le modifiche nel C-terminale del CDK9 tengono conto il T1 della ciclina: Il legame del CATRAME e la defosforilazione a questi siti impedisce l’RNA toTAR obbligatorio. Al contrario, la fosforilazione a residui di Thr-29 o Ser-175 inibisce CDK9. Pertanto, l’immagine emergente della regolazione CDK9 attraverso la fosforilazione sembra essere complessa e in parte parallela a ciò che è noto per altri CDK. Le chinasi CDK9-mirate recentemente identificate, CDK7, CDK2 e fosfatasi, PP1 e PPM1A probabilmente emergeranno come nuovi obiettivi per le terapie anti-HIV-1 e contro il cancro.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.
Riconoscimenti
Questo progetto è stato sostenuto dal District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 dal programma Research Centers in Minority Institutions (RCMI) (Divisione delle infrastrutture di ricerca, National Center for Research Resources, NIH), Russian Foundation for Basic Research (no. 12-04-91444-NIZ) e dal Ministero russo dell’Istruzione e della Scienza (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Gli autori vorrebbero anche ringraziare i membri del Nekhai lab per i suggerimenti e scusarsi per coloro il cui lavoro non è stato citato a causa della mancanza di spazio.
