Fungine host
funghi Filamentosi, può servire come host per un microbica acido carminico cell factory, in quanto hanno la capacità di offrire un ampia offerta di acetil-CoA e malonil-CoA blocchi di costruzione per la sintesi del polyketide impalcatura. Offrono anche l’infrastruttura cellulare necessaria per ospitare la membrana ER legata alla C-glucosiltransferasi UGT28. Poiché A. nidulans possiede una cassetta degli attrezzi di ingegneria genetica ben sviluppata, abbiamo scelto questa specie come punto di partenza per lo sviluppo di una fabbrica di cellule di acido carminico fungino. Come la maggior parte dei funghi filamentosi, A. nidulans è in grado di produrre una pletora di metaboliti secondari biosinteticamente diversi tra cui un numero significativo di polichetidi aromatici. Chiang et al. hanno precedentemente dimostrato che la delezione dei cluster genici responsabili della formazione dei principali prodotti PKS endogeni in A. nidulans11, ha migliorato il potenziale di A. nidulans come fabbrica cellulare per la produzione eterologa di polichetidi. In questo modo si aumentano i pool di blocchi di acetil-CoA e malonil-CoA e si semplificano le successive analisi chimiche per la formazione di nuovi prodotti. Come primo passo verso una fabbrica di cellule fungine per la produzione di acido carminico, abbiamo quindi eliminato le vie biosintetiche per i polichetidi aromatici dominanti che potrebbero potenzialmente interferire con la produzione di acido carminico e complicare l’analisi e la purificazione a valle. In particolare, i cluster di geni per la produzione di asperthecin, monodictyphenone e sterigmatocystin sono stati eliminati così come i geni responsabili della formazione di pigmenti di conidi verdi, wA e yA, sono stati eliminati in uno sfondo A. nidulans defficient endjoining non omologa. Oltre alla prevista mancanza di pigmenti conidiali, il ceppo risultante, NID2252, non ha mostrato effetti visibili sulla morfologia e sull’idoneità (File supplementare, Fig. 1). Abbiamo quindi utilizzato NID2252 come ceppo di riferimento e come base per la costruzione di una fabbrica di cellule fungine per la produzione di acido carminico.
Progettazione di un percorso semi-naturale per la formazione di anthrone acido flavokermesico
Il principale ostacolo per la costruzione di una fabbrica di cellule di acido carminico microbico era la mancanza di un PKS naturale che sintetizza l’anthrone acido flavokermesico, il primo intermedio putativo nel percorso. Per aggirare questa limitazione, abbiamo perseguito un percorso biosintetico alternativo per la produzione di questo polichetide. Il octaketide flavokermesic acid anthrone, con il suo modello di ciclizzazione C7-C12, C5-C14 e C2-C15, potrebbe in teoria essere formato in un unico passaggio da un PKS iterativo di tipo I non riducente fungino che possiede un dominio modello di prodotto adatto (Fig. 1 a sinistra). Tuttavia, tali enzimi non sono ancora stati descritti in letteratura. Un meccanismo alternativo per formare l’anthrone acido flavokermesic è tramite una reazione in due fasi in cui un PKS sintetizza una catena ottaketide lineare non ridotta, che successivamente viene ciclizzata nella struttura desiderata da ciclasi/aromatasi trans-agenti (Fig. 1 a destra). Reazioni di questo tipo esistono in natura, ad esempio nella via actinorhodin (Act) in Streptomyces coelicolor12. In questo caso, la spina dorsale dell’ottaketide viene sintetizzata da un sistema PKS di tipo II batterico multi-subunità, KSa, KSß e ACP (act minimal PKS), che viene ridotto da actKR in posizione C9 e successivamente piegato dall’aromatasi/ciclasi, actARO/CYC e ciclasi actCYC2, per produrre il composto triciclico 3,8-diidrossi-1-metilantrachinone-2-acido carbossilico (DMAC)7. DMAC visualizza la stessa piega dell’acido flavokermesic anthrone ma è ridotto nella posizione C9.
Di particolare interesse per il presente studio, è la Zhui ciclasi e Zhuj aromatasi da Streptomyces sp. R1128, che catalizzano due reazioni di ciclizzazione sequenziale di polichetidi lineari non ridotti in pieghe simili a quelle dell’acido flavokermesic an throne13. In particolare, la ciclasi ZhuI è responsabile della chiusura del primo anello, C7-C12, e l’aromatasi ZhuJ per la chiusura del secondo anello, C5-C14. Il terzo anello, C2-C15, si forma spontaneamente. ZhuI e ZhuJ sono stati precedentemente co-espressi in S. coelicolor con l’ottaketide che forma il tipo PKS minimo di atto di II con conseguente formazione di acido flavokermesic, conosciuto come acido 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthraquinone-2-carboxylic (TMAC) nella letteratura batterica14. Sfortunatamente, una strategia identica può essere difficile da implementare in A. nidulans poiché i PKS minimi di tipo II non sono stati implementati con successo in ospiti eterologi al di fuori del genere Streptomyces nonostante diversi tentativi15. E in effetti i nostri tentativi di ricostituire i MINIPK act in A. nidulans e Saccharomyces cerevisiae si sono dimostrati ugualmente infruttuosi (dati non mostrati). Un modo alternativo per formare l’ottacetide non ridotto richiesto è quello di fare affidamento sugli enzimi PKS di tipo III, che sono stati espressi con successo nel lievito, ad esempio in relazione alla biosintesi flavonoide16. Di particolare interesse è l’Aloe arborescens octaketide synthase (OKS), che è stato descritto per produrre ottaketidi non ridotti che si piega spontaneamente in SEK4 e SEK4b in vitro17 (Fig. 2 bis). Tuttavia, in Aspergillus non è stato verificato se i prodotti di PKS di tipo III, che sono enzimi indipendenti dagli ACP che rilasciano acidi carbossilici, possano essere piegati dal tipo di ciclasi ZhuI che è stato descritto per agire su substrati legati agli ACP. Nel presente studio abbiamo quindi deciso di testare la compatibilità della pianta di tipo III OKS con quella delle ciclasi/aromatasi provenienti da sistemi batterici di tipo II PKS, con l’obiettivo di sviluppare una via biosintetica artificiale de novo per la formazione del precursore dell’acido flavokermesico anthrone per la formazione dell’acido carminico.
Formazione dell’ottaketide non ridotto. (a) Piegatura spontanea di ottacetidi non ridotti. (b) Fenotipo di Aspergillus nidulans NID2252 ceppo di riferimento e ceppi che esprimono OKS con l’uso di codoni nativi o ottimizzati. (c) Profilo metabolico di A. nidulans NID2252 ceppo di riferimento e OKS che esprimono ceppi. Cromatogramma di picco di base (grigio chiaro) con indicazione di metaboliti selezionati: SEK4 (blu), dehydro – SEK4 (blu scuro), SEK4b (viola), dehydro-SEK4b (viola scuro), mutactin (arancione) e acido flavokermesic (calce).
Produzione di polyketide precursori per la produzione di acido carminico in A. nidulans
Per testare le prestazioni in vivo di OKS in un fungine host, abbiamo inserito OKS controllata dall’A. nidulans gpdA promotore di una singola copia in una definita locus (sito di integrazione 5, IS5) A. nidulans genome18. Sono stati costruiti due ceppi, uno che esprime la sequenza di codifica nativa OKS e uno che esprime una versione ottimizzata per codoni per l’espressione in A. nidulans. Dopo sette giorni di incubazione su terreni di crescita solidi, vedere la sezione Metodi per i dettagli, entrambi i ceppi hanno mostrato una forte colorazione rosso-marrone del micelio (Fig. 2 ter). La profilazione metabolica da parte di HPLC-HRMS dei ceppi non ha rivelato alcuna traccia di un ottaketide non ridotto, ma piuttosto l’atteso SEK4 e SEK4b insieme all’acido flavokermesico e ad altri tre abbondanti composti di identità sconosciuta (Fig. 2c), che non erano presenti nel ceppo di riferimento NID2252. SEK4 e SEK4b sono stati identificati sulla base di un’analisi approfondita HPLC-HRMS / MS (File supplementare, Fig. 2) ed era conforme ai valori precedentemente riferiti19 mentre l’acido flavokermesic è stato confrontato con un riferimento autentico isolato da D. coccus9 (File supplementare, Fig. 3). Il metabolita che elude a 13.0 min. aveva uno pseud pseudomolecolare + di m / z 303.0867, corrispondente a una formula molecolare di C16H14O6, coerente con il noto prodotto di shunt ottaketide, mutactin, precedentemente descritto in esperimenti basati su Streptomyces con il gene Act cluster7. Questa identificazione è stata confermata attraverso un’analisi dettagliata dello spettro UV e supportata dal tempo di ritenzione relativo a SEK4 e SEK4b (File supplementare, Fig. 4). I due metaboliti aggiuntivi con formule molecolari di C16H12O6 (- m/z 299.0566) indicavano prodotti a base di octaketide ma, tuttavia, non corrispondevano a un prodotto di shunt comune (File supplementare, Fig. 5). Quindi, i metaboliti sono stati isolati e la delucidazione della struttura basata su esperimenti 1D e 2D NMR li ha identificati come deidro-SEK4 (noto anche come B26 nella letteratura batterica) e deidro-SEK4b20 (file supplementare, Figs 6-11). La formazione dei sei nuovi polichetidi osservati nel ceppo OKS può essere spiegata da tre diverse reazioni spontanee di chiusura del primo anello: C7-C12 (SEK4, deidro-SEK4 e acido flavokermesico), C10-C15 (SEK4b e deidro-SEK4b) e C7-C12 dopo riduzione del chetone C9 (mutattina) (Fig. 2a e file supplementare, Fig. 12). Di questi, soltanto il primo tipo della chiusura dell’anello (C7-C12) tiene conto la formazione successiva dell’anthrone desiderato dell’acido flavokermesic via una seconda chiusura dell’anello C5-C14 e la terza C2-C15. SEK4 e SEK4b sono stati precedentemente segnalati per disidratarsi spontaneamente per formare rispettivamente deidro – SEK4 e deidro-SEK4b, mentre la formazione di mutattina dipende dalla riduzione enzimatica della posizione C9 della catena del polichetide prima della piegatura21. La formazione di acido flavokermesic, un intermedio noto nella via dell’acido carminico (Fig. 1), era inatteso poichè questo metabolita non è stato segnalato per formarsi spontaneamente dalle catene non ridotte del octaketide. Ciò suggerisce che A. nidulans produce naturalmente un certo numero di ciclasi/aromatasi che promuovono il modello di piegatura desiderato. Il profilo metabolico dei due ceppi che esprimono OKS non ha mostrato differenze sostanziali nei livelli di produzione e abbiamo deciso di concentrarci sul ceppo che esprime la versione nativa di OKS come base per ulteriori sviluppi di una fabbrica di cellule fungine per la produzione di acido carminico.
Ingegnerizzazione del percorso di piegatura degli ottacetidi non ridotti
La piegatura promiscua dell’ottacetide non ridotto riduce la resa dell’acido flavokermesico desiderabile. Abbiamo quindi immaginato che la produzione di acido flavokermesic potesse essere aumentata semplificando il processo di piegatura nella direzione desiderata esprimendo versioni ottimizzate per codone di ZhuI e ZhuJ. Per esaminare se ZhuI e ZhuJ interferiscano con il metabolismo nativo di A. nidulans, abbiamo prima costruito ceppi che esprimono ZhuI e ZhuJ individualmente e in combinazione da loci genomici definiti (IS6 e IS7) nell’A. nidulans NID2252 ceppo di riferimento. Il profilo metabolico da HPLC-HRMS dei tre ceppi non ha rivelato alcuna differenza metabolica rilevabile (Fig. 3 ter). Abbiamo quindi costruito un ceppo co-esprimendo OKS con ZhuI, che codifica le ciclasi che catalizza la formazione della chiusura del primo anello C7-C12 (Fig. 3 bis). Rispetto al ceppo che esprime solo OKS, questo ceppo ha mostrato aumenti di 2,5, 2,2 e 2,1 volte nei livelli di acido flavokermesico, SEK4 e deidro-SEK4, rispettivamente. In accordo con ZhuI che guida la piegatura nella direzione desiderata, questi cambiamenti metabolici sono stati accompagnati da livelli ridotti di metaboliti contenenti le pieghe del primo anello indesiderate (Fig. 3b e Tabella 1). Un ceppo co-esprimendo OKS e ZhuJ, che codifica le aromatasi che catalizza la chiusura del secondo anello C5-C14 (Fig. 3a), ha prodotto un aumento di 2,7 volte dei livelli di acido flavokermesic. Questo aumento è stato accompagnato da una riduzione dei livelli di metaboliti con una prima piega ad anello C7-C12 (SEK4 e deidro-SEK4), mentre, come previsto, il livello di metaboliti con la prima piega ad anello C10-C15 indesiderata (SEK4b e deidro-SEK4b) non è stato influenzato (Fig. 3b e Tabella 1). Infine, l’analisi del ceppo che esprime ZhuI, ZhuJ e OKS ha mostrato un aumento di 4,1 volte nella produzione di acido flavokermesic rispetto a quando OKS è stato espresso da solo. Inoltre, questo aumento è superiore del 60% rispetto a quanto osservato con i ceppi che esprimono OKS in combinazione con ZhuI o ZhuJ, rispettivamente (Tabella 1). Questo risultato indica che la ciclasi e l’aromatasi, in modo additivo, sono in grado di aumentare il flusso nella via artificiale de novo verso il prodotto desiderato, l’acido flavokermesico (Fig. 3 ter).
Dirigere la piegatura del backbone octaketide. (a) Passi biosintetici dall’ottacetide non ridotto all’anthrone dell’acido flavokermesico. (b) Analisi chimica mirata dei ceppi di riferimento di Aspergillus nidulans NID2252 (ceppo con cluster PKS eliminati) e NID2252 che esprimono ZhuI, o ZhuJ, o ZhuI + ZhuJ, o OKS, o OKS + ZhuI, o OKS + ZhuJ e OKS + ZhuI + ZhuJ. Cromatogramma di picco di base (grigio chiaro) con indicazione di metaboliti selezionati: SEK4 (blu), deidro-SEK4 (blu scuro), SEK4b (viola), deidro-SEK4b (viola scuro), mutactin, (arancione) e acido flavokermesic (calce). c) Morfologia delle colonie di ceppi propagati per sette giorni su terreno minimo.
Sorprendentemente, e molto incoraggiante, ulteriori analisi metaboliche del ceppo co-esprimente OKS, ZhuI e ZhuJ hanno rivelato che l’aumentata formazione di acido flavokermesico era accompagnata dalla produzione di acido kermesico (Fig. 4). Quindi, A. nidulans fornisce la monoossigenasi necessaria per la conversione dell’acido flavokermesic in acido kermesic, che può servire come intermedio finale nella via dell’acido carminico (Fig. 1).
Fasi ossidative coinvolte nella formazione di acido kermesico. (a) Passaggi ossidativi dall’acido flavokermesic anthrone all’acido kermesic. b) Analisi metaboliche mirate per la produzione di acido flavokermesico (FK) e acido kermesico (KA) nel ceppo di riferimento NID2252 (ceppo con cluster PKS eliminati), ceppo che esprime OKS e ceppo OKS + ZhuI + ZhuJ. Il cromatogramma mostra il cromatogramma del picco di base (grigio chiaro) con indicazione dell’acido flavokermesic (calce) e dell’acido kermesic (blu).
Produzione di acido carminico in A. nidulans
L’ultimo passo nella formazione di acido carminico comporta la C-glucosilazione dell’acido kermesico (Fig. 5 bis). L’enzima responsabile di questo passaggio nella via biosintetica dell’acido carminico è stato precedentemente identificato in D. coccus e caratterizzato da espressione eterologa in S. cerevisiae8. Abbiamo quindi inserito il gene di codifica UGT2, ottimizzato per l’espressione in A. nidulans, nel locus IS4 del ceppo di riferimento NID2252 e per completare la via biosintetica dell’acido carminico semi-naturale in A. nidulans, nello stesso locus del ceppo che co-esprime ZhuI, ZhuJ e OKS. L’espressione di UGT2 da sola nel ceppo di riferimento non ha influenzato l’aspetto del colore del mezzo di crescita né il profilo metabolico di A. nidulans rispetto al ceppo di riferimento NID2252 (Fig. 5 ter, c). Al contrario, la co-espressione di OKS, ZhuI, ZhuJ e UGT2 ha dato origine a una colorazione rossa del mezzo, suggerendo che si è formato un colorante più solubile in acqua (Fig. 5 ter). L’analisi mirata di LC-HRMS di questo ceppo ha confermato la formazione di acido carminico22 (File supplementare, Fig. 13), insieme a dcII9, 23 e un isomero dcII (File supplementare, Fig. 14), mostrando che UGT2 era funzionale in A. nidulans e potrebbe completare con successo la via biosintetica (Fig. 5 quater). L’identificazione positiva di acido carminico e dcII è stata basata su tempi di ritenzione simili, spettri UV, modelli di frammentazione MS e MS/MS per standard puri dei due composti. Tre isomeri dell’acido carminico sono stati descritti in letteratura (acido carminico, DCIV e DCVII) da Stathopoulou et al.23, tutti e tre mostrano diversi tempi di ritenzione nell’analisi basata su LC-MS/MS. Nella nostra analisi abbiamo rilevato solo acido carminico e non DCIV e DCVII in base al tempo di ritenzione e al modello di frammentazione dell’acido carminico autentico standard isolato da D. coccus (File supplementare, Fig. 13). Insieme i nostri dati dimostrano fermamente che è possibile produrre acido carminico in A. nidulans sulla base di una via semi-naturale.
Fase di glucosilazione per la formazione di acido carminico. a) La Dactylopius coccus glucosiltransferasi UGT2 accetta sia l’acido kermesico che l’acido flavokermesico come substrati, con conseguente formazione rispettivamente di acido carminico e dcII. (b) L’effetto fenotipico di esprimere UGT2 da solo e in combinazione con il PKS sintetico nello sfondo NID2252 Aspergillus nidulans, immagini scattate dopo sette giorni di incubazione. c) Analisi metaboliche mirate per la produzione di composti glucosilati, ad esempio acido carminico (rosso) e dcII (arancione) sovrapposti cromatogramma di picco di base (grigio chiaro).
